包括内部支柱的色谱柱的制作方法

本发明涉及用于生物过程分离的色谱柱。本发明还涉及色谱柱的堆叠、填充一个或多个色谱柱的方法，以及组装色谱柱的堆叠的方法。

背景技术：

液体色谱中使用的柱典型地包括管状本体，该管状本体包围多孔色谱介质的填充床，载液流过该填充床，其中分离通过在多孔介质的固相与载液之间分隔来发生。

在任何分离过程之前，床必须通过从待引入柱中的微粒介质开始来制备。床形成的过程称为“填充过程”，且正确填充的床是影响包含填充床的柱的性能的关键因素。典型地，填充床通过浆料填充(即，巩固液态下的离散微粒的悬浮液，该悬浮液称为浆料，该浆料泵送、倾注或吸取到柱中)来制备。一旦将预定体积的浆料输送到柱中，它需要通过使可移动适配器(adapter)沿柱的纵向轴线向下朝柱的底部移动(通常以恒定速度)来进一步巩固和压缩。在该过程期间，过量的液体在柱出口处排出，而介质微粒借助于过滤材料(所谓的‘床支承件’)被保留，其中孔过小以至于不能允许介质微粒通过(passthough)。一旦填充床由最佳压缩度来压缩，填充过程完成。用于柱浆料填充的另一方法是流动填充方法，其中多孔结构的压缩主要通过在柱上应用高流率来实现，由此形成开始于出口床支承件处的多孔结构。在多孔结构中的微粒上所得的阻力最终引起压降和床的压缩。最后通过将适配器放到适当位置中来限制压缩的床。

随后色谱分离的效率强烈(strongly)依赖于：1)填充床的流体入口和出口处的液体分配和收集系统；2)填充床中的介质微粒的特殊定向(也称为填充几何形状)；以及3)填充床的压缩。如果填充床的压缩过低，则在该床上执行的色谱分离遭受“拖尾”且大体上，此类压缩不足的床是不稳定的。如果填充床的压缩过高，则由床执行的色谱分离遭受“超前”且此类过度压缩的床可影响通过量(throughput)和结合能力，且大体上给出更加高的操作压力。如果压缩是最佳的，则在使用期间形成的分离峰显示出更加少的超前或拖尾且基本是对称的。最佳压缩度对于实现多孔结构的良好长期稳定性也至关紧要，由此确保在多个过程周期期间的最佳性能。对于柱所需要的最佳压缩度用实验方法针对每个柱尺寸(宽度或直径)、床高度和介质类型来确定。

特定的问题是，通常期望通过若干柱的并行联接来按比例增加(scale)色谱过程，以便提高能力。然而，当前填充过程的可变性是严重的障碍，因为渗透性和对应的流速将在各个柱之间变化，引起并行组件上过量的谱带展宽。干燥填充可膨胀介质的方法建议作为对该问题的补救(见us20140224738和us20120267299，其两者由此通过引用以其整体并入)。

用于生物过程分离中的制备的柱需要具有相对大的直径来容纳足够的床体积以用于所需要的吸收能力。这意味着，柱需要承受来自流体动力背压的显著的力，而不破裂或变形。为了重复使用，柱通常用不锈钢的重端件来构造，且使用作用于端件的液压来用于抵消背压力。单次使用的柱需要由低成本材料(诸如塑料)来构造，其需要不同的构造。典型地，塑料端件非常厚以防止膨胀，且它们通过多个外部拉杆保持在一起(见例如us8702983和us20080017579，其由此通过引用以其整体并入)。即使当使用这些补救时，单次使用的柱的直径仍然受限。备选地，单次使用的柱的堆叠可使用液压或螺纹杆通过重的不锈钢板来夹紧在一起以用于压缩(见例如us201330068671，其由此通过引用以其整体并入)。

因此，需要允许较轻的构造以降低成本且改进在柱的使用期间的便利性的单次使用的生物过程柱。

技术实现要素：

本发明的一个方面是提供一种适合于单次使用应用的紧凑的生物过程色谱柱。这通过包括下者的柱来实现：

a)床室，该床室由至少一个侧壁、第一床支承筛(screen)和第二床支承筛界定；

b)第一端壁，该第一端壁固定到侧壁或与侧壁整体结合，其中第一端口经由第一分配器流体地连接到第一床支承筛；

c)第二端壁，该第二端壁固定到侧壁或与侧壁整体结合，其中第二端口经由第二分配器流体地连接到第二床支承筛；

d)壁中的填充端口；以及

e)内部支柱，该内部支柱固定到端壁中的至少一个或与端壁中的至少一个整体结合，且延伸到床室中。

一个优点是允许较轻的构造。另外的优点是不需要繁琐的外部拉杆或压缩板。

本发明的第二方面是一种色谱柱的堆叠，其由如上文公开的多个色谱柱组装。

本发明的第三方面是一种通过如下过程来填充上文的柱的方法：将称量(weighedamount)的干燥可膨胀的分离基质微粒传输到所述床室；以及将液体输送到柱，以使干燥可膨胀的分离基质微粒膨胀。

本发明的第四方面是一种通过用上文方法填充各个柱、堆叠它们和将它们串联地或并联地连接到彼此来制备色谱柱的堆叠的方法。

本发明的另外适合的实施例在从属权利要求中描述。

附图说明

图1示出本发明的柱，a)侧视图，b)端视图。

图2示出本发明的柱的分解图。

图3示出本发明的柱，a)侧视图，b)端视图。

图4示出本发明的柱，a)侧视图，b)端视图。

图5示出图1柱的堆叠，其中柱并联地联接。

图6示出图1柱的堆叠，其中柱串联地联接。

具体实施方式

限定

为更清楚且简明地描述和指出所要求保护的发明的主题，以下限定提供用于在以下描述和附于此的权利要求书中使用的特定用语。

除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数对象。如本文中在说明书和权利要求书各处使用的，近似语言可应用于修饰在不引起它所涉及的基本功能上改变的情况下可允许变化的任何数量表示。因此，由诸如“约”的用语所修饰的值不限于所指定的精确值。除非另外指示，否则表达说明书和权利要求书中使用的成分的量、性质(诸如分子量)、反应条件等的所有数量应理解为在所有情况下由用语“约”修饰。因此，除非相反地指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中陈述的数字参数是近似，其可取决于设法由本发明的实施例获得的期望性质来变化。起码每个数字参数应按照所报告的有效数字的数量且通过应用普通的舍入技术来解释。

如本文中用来描述本发明的，方向性用语(诸如，“上”、“下”、“向上”、“向下”、“顶部”、“底部”、“竖直”、“水平”、“上方”、“下方”，以及任何其它方向性用语)指的是附图中的那些方向。

实施例的详细描述

在由图1-4示出的一方面，本发明公开一种用于生物过程分离的色谱柱10；11；110；111。柱可能够与相似的色谱柱堆叠，且包括：

a)床室12，床室12由至少一个侧壁14、第一床支承筛16和第二床支承筛18界定。床室为填充床提供空间，其中第一床支承筛和第二床支承筛在轴向方向上界定与床直接接触的室，同时允许液体通过筛和床。在径向方向上，床由侧壁界定，该侧壁也与床直接接触—如果床室具有圆形或椭圆形的截面，为一个侧壁，且如果床室具有多边形或基本多边形的截面，为多个侧壁。床室可适当地(suitably)具有基本四边形的截面，诸如，例如定形为直角或菱形四边形、带有圆角的四边形、超椭圆形(superellipse)或方圆形(squircle)的截面。基本四边形的截面是有利的，特别是在柱以水平流向单独使用或用作柱的水平堆叠的情况下。床室截面的最大尺寸(在圆形的情况下为直径，且在基本四边形形状的情况下为对角线)可适当地至少5cm，诸如至少10cm、至少20cm、5-50cm或10-30cm。床支承筛可例如为多孔材料片，其中孔尺寸适合于使分离基质微粒保留在床室内。适合的材料的示例为烧结的聚烯烃片，其可从例如porexcorp.或porvairplc得到。适当地，床支承筛的边缘与侧壁成密封邻接，或与侧壁整体结合，以防止分离基质微粒从填充床室的填充床中的任何泄漏。

b)第一端壁20，第一端壁20固定到侧壁或与侧壁整体结合，其中第一端口22经由第一分配器24流体地连接到第一床支承筛。在柱的使用期间，第一端口用作入口/出口，且分配器提供在整个床截面上的均匀流动。如图1a)中示出的，分配器可为由间隔物38提供的在第一床支承筛16与第一端壁20之间的间隙。备选地，它可为更复杂的结构，例如带有专门设计成在截面上分配液体的肋或通道。此类结构在色谱柱领域中是众所周知的。

c)第二端壁26，第二端壁26固定到侧壁或与侧壁整体结合，其中第二端口28经由第二分配器30流体地连接到第二床支承筛。在柱的使用期间，第二端口用作出口/入口，且第二分配器的构造可与第一分配器类似或相同。如果床室具有基本四边形的截面，第一端口和第二端口可适当地邻近于床室的对角相反的转角定位。如果柱布置成用于水平流动，这允许液体在最低位置处的进入和液体在最高位置处的离开，其提供用于从柱中有效去除空气。第一端壁和第二端壁可适当地由塑料制成，例如低成本塑料(诸如聚烯烃)，以提供用于单次使用的构造。而且，侧壁可由塑料制成，例如聚烯烃。第一和第二端口22、28可装配有无菌连接器或闭合(closed)长度的可焊接柔性管。这允许将柱用作预先灭菌的柱，其中无菌连接器可连接到无菌色谱系统或与堆叠中的其它无菌柱连接。备选地，如无菌连接领域中已知的，闭合长度的无菌管可用于通过柔性管的无菌焊接来与系统或其它柱连接。灭菌(例如通过辐射灭菌)可在柱填充有分离基质微粒之后执行。然而，也可能对空柱灭菌，以用于稍后在无菌条件下用灭菌的分离基质微粒填充。

d)壁中(诸如侧壁中)的填充端口32。填充端口可例如为侧壁中的孔，允许如下文描述的那样在填充期间添加干燥可膨胀的分离基质微粒。如图2中示出的，填充端口可例如用(螺纹)塞42闭合，其由垫片或o形圈44密封。

e)内部支柱34；134，内部支柱34；134固定到第一端壁和第二端壁中的至少一个或与第一端壁和第二端壁中的至少一个整体结合，且延伸到床室中。支柱是布置在床室内部的结构，以消散在柱的使用期间出现的由背压产生的作用于端壁的纵向张力负载。因此，它抵消朝端壁膨胀的任何趋势，端壁膨胀将引起填充床中的不稳定且导致差的色谱性能。如果支柱固定到第一端壁和第二端壁两者或与第一端壁和第二端壁两者整体结合，它还可减小端壁与侧壁之间的接头上的张力负载，允许更细长的构造。可通过紧固诸如螺钉等的元件(例如通过焊接)来将支柱固定到端壁，或它可与端壁整体形成。后者可例如通过增材制造(也称为3d打印)来实现，增材制造还可允许床支承筛和/或侧壁与端壁和支柱整体形成。适当地，支柱的至少部分延伸到床室中，到床室的轴向高度h的至少20%，诸如至少50%。为了最大的加固效果，如果支柱的至少部分跨过床室的整个轴向高度，固定到第一端壁和第二端壁两者或与第一端壁和第二端壁两者整体结合，则是有利的。

在由图1和图2示出的一些实施例10；11中，内部支柱34包括一个或多个杆36。这些中的每个具有：第一杆端50，第一杆端50固定到第一端壁或与第一端壁整体结合；以及第二杆端52，第二杆端52固定到第二端壁或与第二端壁整体结合。适当地，杆的数量为至少两个，诸如至少三个或至少四个。杆的数量可取决于柱的尺寸，例如其中对于10-15cm截面尺寸的柱，四个杆足够，且对于更宽的柱，要更大的数量。这确保相对于膨胀和/或纵向失效的足够抗性。

在由图3和图4示出的某些实施例110；111中，内部支柱134包括至少一个肋136，该至少一个肋136固定到第一端壁和第二端壁中的至少一个或与第一端壁和第二端壁中的至少一个整体结合，且延伸到床室中。肋可适当地包括至少一个侧孔140，诸如多个侧孔。侧孔提供柱的不同部分之间的流体连通。侧孔还为分离基质微粒提供连通，尤其是在膨胀之前干燥状态中，由此允许干燥可膨胀的微粒在通过填充端口填充之后的均匀分配。如图4中示出的，肋136a可固定到第一端壁和第二端壁两者或与第一端壁和第二端壁两者整体结合。在该情况下，肋136a也可称为内部壁。柱可包括若干肋，该肋可平行于彼此或成交叉或星形图案布置。在某些实施例(尤其是当床室形成为圆形或椭圆形形状时)中，内部支柱可形成为床室内部的圆形(圆柱形)或椭圆形壁。

在一些实施例中，柱可包括一个或多个传感器，允许柱内部的重要参数的在线测量。传感器可例如能够测量压力、传导率、ph和/或温度。

在某些实施例中，床室12包括分离基质微粒的填充床，其中分离基质微粒与至少一个侧壁14、第一和第二床支承筛16、18以及内部支柱34之间直接接触。填充床可适当地包括膨胀微粒，其通过下文论述的填充方法来填充。

在由图5和图6示出的第二方面，本发明公开如上文公开的能够堆叠的色谱柱的堆叠200；210。如图5中示出的，堆叠中的柱可并联地连接。如图6中示出的，它们也可串联连接，或堆叠可包括串联连接的柱的子堆叠，其中子堆叠并联地连接。柱可适当地填充有相同的分离基质，且堆叠中任何两个色谱柱的分离基质的量的干重上的差异可小于5wt.%，诸如小于2wt.%。这确保堆叠的高效率，特别是当柱并联地连接时。然后，低的重量差异导致通过平行柱的基本相同的流率。

实现柱的并联或串联连接的一种方式是在柱之间使用流体连接器板215；220。可仅用串联连接器板220来获得串联连接，串联连接器板220将一个柱的出口与随后的柱的入口连接。对于并联连接，可还需要公共入口导管225和公共出口导管230。公共入口导管允许入流到达所有柱入口，且公共出口导管收集来自所有柱出口的出流。公共入口/出口导管可为如图5中指示的单独的管道，但它们也可整体形成在例如柱侧壁中。

堆叠可通过各个柱(未示出)之间的紧固件和/或通过框架保持在一起。因为不需要夹紧压力来抵消膨胀或纵向失效，框架可为比较轻的构造，且可包括或可不包括轻的端板。

在第三方面，本发明公开一种填充色谱柱的方法，包括如下步骤：

a)提供如上文公开的色谱柱10；11；110；111；

b)将称量的干燥可膨胀的分离基质微粒传输到床室12；以及

c)将液体输送到柱，以使干燥可膨胀的分离基质微粒膨胀。液体典型地可为水或水溶液，诸如缓冲剂或盐溶液。在步骤c)期间或之后，可机械地扰动柱(例如通过使它经受振动)，以便得到膨胀微粒的更均匀的分配。适合的振动方法的细节在共同未决的pct申请ep2017/064876中给出，该申请由此通过引用以其整体并入。

方法可在步骤b)之前包括适当地使用与步骤c)中相同的液体来确定干燥可膨胀的分离基质微粒的液体吸收的步骤。在步骤b)中，然后可基于液体吸收测量来计算干燥可膨胀的分离基质微粒的量，以给出大于床室的内体积的100%(诸如101-130%或105-120%)的非约束膨胀体积。液体吸收vs/md可使用用于取得代表性样品的所建立的方法来从微粒的单独样品等分试样(aliquot)中确定。样品干燥(即，与环境大气平衡)称重，且然后悬浮在测试液体中。测试液体可为待在柱的填充和操作中使用的相同液体，或类似组分的液体；典型为类似的离子强度/传导率和ph的水缓冲剂或盐溶液。使测试液体中的微粒平衡，典型地达约一个小时且无论如何不大于24小时。微粒再悬浮且使其沉淀。沉淀体积例如在量筒中测量。液体吸收然后计算为沉淀体积vs与干燥微粒样品的重量md之间的比vs/md。初始(initially)测量液体吸收的优点是可预测柱中微粒的膨胀体积，引起对压缩和柱效率的更好控制。在特定实施例中，液体吸收确定有小于5%的变化系数或甚至小于2%的变化系数，以允许在对柱性能的控制中的高精度。

在一些实施例中，方法包括在步骤c)之前用干燥可膨胀的分离基质微粒对色谱柱辐射灭菌的步骤。干燥微粒朝辐射通常比膨胀微粒更稳定，故该方法可减小潜在的辐射降解。然后易于用无菌(例如，无菌过滤的)液体执行步骤c)来维持无菌。备选地，色谱柱和干燥可膨胀的分离基质微粒可各自在步骤a)之前辐射灭菌，其中步骤b)和步骤c)在无菌条件下执行。又一备选方案是在步骤c)之后对柱辐射灭菌。这是方便的过程，特别是在其中膨胀微粒相当地耐辐射降解的情况下。

填充柱可用于分离至少一种生物分子，诸如生物药物(biopharmaceutical)。适合的生物分子可为蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、病毒微粒等。适合的生物药物可为免疫球蛋白(例如单克隆抗体)、免疫球蛋白片段和其它构造物、胰岛素和其它治疗性肽、促红细胞生成素、血浆蛋白、寡核苷酸、质粒、疫苗等。在特定实施例中，生物分子或生物药物为蛋白质。

在一些实施例中，生物分子或生物药物结合到微粒，且通过用洗涤液洗涤来去除至少一种杂质。生物分子或生物药物然后可用洗脱液从微粒中洗脱出。该模式通常称为结合-洗脱分离，且当杂质的量显著时和/或当需要非常高的分离选择性时特别有用。

在某些实施例中，至少一种杂质结合到微粒，且在柱的流通中回收生物分子或生物药物。该模式通常称为流通分离，且提供非常高的通过量，特别是当杂质的量相对低时。

在第四方面，本发明公开一种制备色谱柱的堆叠的方法，包括如下步骤：

1)根据上文公开的方法来填充多个色谱柱；以及

2)堆叠色谱柱和将它们串联地或并联地连接到彼此(如上文论述的)。

堆叠中任何两个色谱柱的干燥可膨胀的分离基质微粒的量可适当地相差小于5wt.%，诸如小于2wt.%。

该书面描述使用示例来公开本发明(包括最佳模式)，且还使本领域的任何技术人员能够实施本发明，包括制作和使用任何装置或系统以及执行任何并入的方法。本发明的可申请专利的范围由权利要求书限定，且可包括本领域技术人员想到的其它示例。如果此类其它示例包括不异于权利要求书的字面语言的结构元件，或如果它们包括带有与权利要求书的字面语言非实质差异的等同结构元件，此类其它示例意在处于权利要求书的范围内。文本中提到的所有专利和专利申请由此通过引用以其整体并入，如同(asif)独立地并入。