用于预测脑卒中的循环血管生成素-2(Ang-2)和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)的制作方法

本发明涉及一种预测受试者的脑卒中风险的方法和一种提高临床脑卒中风险评分预测准确性的方法。本发明的方法基于对来自受试者的样本中的血管生成素-2(ang-2)的量和/或胰岛素样生长因子结合蛋白7(igfbp7)的量的测定。此外，本发明涉及在来自受试者的样本中，以下物质用于预测所述受试者的脑卒中风险：i)生物标记物ang-2和/或生物标记物igfbp7，和/或ii)至少一种与ang-2特异性结合的检测剂和/或至少一种与igfbp7特异性结合的检测剂。

背景技术：

脑卒中作为高收入国家中损失失能调整的寿命年数的原因和作为全球范围内的死亡原因而排在缺血性心脏病之后的第二位。为了降低脑卒中的风险，抗凝治疗似乎是最合适的治疗。

心房颤动(af)是脑卒中的重要危险因素(hart等人，anninternmed2007；146(12)：857-67；goas等人jama2001；285(18)：2370-5)。心房颤动的特征是不规则的心脏跳动并且通常以短暂的异常跳动开始，该短暂的异常跳动会随着时间的推移增加并且可能成为永久性病症。估计270-610万美国人患有心房颤动，并且全球约有3300万人患有心房颤动(chughs.s.等人，circulation2014；129：837-47)。

评定哪些af患者的心房颤动风险最高并因此可受益于强化抗凝治疗以降低脑卒中风险是很重要的(hijazi等人，europeanheartjournaldoi：10.1093/eurheartj/ehw054.2016)。

chads2、cha2ds2-vasc评分和abc评分是估计心房颤动患者的脑卒中风险的临床预测规则。评分用于评定是否需要用抗凝治疗进行治疗。abc-脑卒中评分包括年龄、生物标记物(n-末端片段b型钠尿肽和高灵敏度心肌肌钙蛋白)和临床病史(脑卒中前)，参见oldgren等人，circulation.2016；134：1697-1707)。

血管生成素是参与血管生成的糖蛋白。因为它们在健康组织中也有表达，所以它们被认为稳定化现有血管并调节内皮细胞与周围血管平滑肌细胞之间的相互作用(wongal等人circres.1997；81：567-74)。已知有四种血管生成素，血管生成素-1(ang-1)到血管生成素-4(ang-4)。人类血管生成素-2(ang-2)例如在maisonpierrepc等人(science277(1997)55-60和cheung，a.h.等人，genomics48(1998)389-91)中描述，并且是血管生成素家族的四个成员之一。ang-2被发现为ties的配体，ties是在血管内皮内选择性表达的酪氨酸激酶家族(yancopoulos，g.d.等人，nature407(2000)242-48)。

虽然ang-1是内皮细胞特异性tie2受体酪氨酸激酶的激动剂并且具有促血管生成的特性，但发现ang-2干扰血管形成并通过tie-2受体具有拮抗信号传导作用(maisonperrepc等人，science1997；277：55-60)。

已知血管生成素-2(ang-2)会损害内皮完整性，并表现为在心力衰竭时升高(参见例如poss等人angiopoietin-2andoutcomeinpatientswithacutedecompensatedheartfailure.clinrescardiol.may2015；104(5)：380-387，或lukasz等人angiopoietin-2inadultswithcongenitalheartdiseaseandheartfailure.plosone.2013；8(6)：e66861)。

在心房颤动患者中发现ang-2升高(freestone等人，angiogenicfactorsinatrialfibrillation：apossibleroleinthrombogenesis？annmed2005；37：365-72或choudhury等人，relationshipofsolublecd40ligandtovascularendothelialgrowthfactor，angiopoietins，andtissuefactorinatrialfibrillation，chest2007；132：1913-1919)。

国际专利申请pct/ep2017/064970公开了ang-2和igfb7可用于预测心房颤动复发。

wo2014/072500公开了igpbp7作为诊断心房颤动的生物标记物。

wo2014/040759公开了igfbp7作为心血管事件和死亡率的预测因子。进一步地，在有心血管事件风险的射血减少的心力衰竭患者中发现igfbp-7升高(ghandi等人，amjcardiol2014；114：1543e1549)。发现igfbp-7水平在hfpef患者的全因死亡率、心血管住院和hf住院或hf死亡的复合因素方面是预后意义的(ghandi等人jcardiacfailure2017)。主要结局是全因死亡率和方案规定的心血管住院治疗的综合结果，该方案规定的心血管住院治疗被定义为因hf恶化、心肌梗死、脑卒中、不稳定心绞痛、室性或心房心律失常或任何住院期间发生的心肌梗死或脑卒中而住院治疗。然而，没有数据显示igfbp-7水平与脑卒中结局相关。

脑卒中的预测和预防药物的选择是临床尚未满足的重要需求。

到目前为止，igfbp7和ang-2还没有被用来预测已经发生心房颤动的患者的脑卒中。

本发明的技术问题可以看作是提供满足上述需要的方法。本技术问题由权利要求书及下文所表征的实施例解决。

有利的是，在本发明的研究背景下发现，对来自受试者的样本中ang-2和/或igfbp7的量的测定可以预测脑卒中。

技术实现要素：

本发明用于预测受试者的脑卒中风险的方法包括以下步骤：

(a)测定来自受试者的样本中的血管生成素-2(ang-2)的量和/或胰岛素样生长因子结合蛋白7(igfbp7)的量，以及

(b)将ang-2的量和/或igfbp7的量与参考量进行比较，从而预测脑卒中的风险。

在本发明方法的一个实施例中，该受试者患有心房颤动。

在本发明方法的一个实施例中，该心房颤动是阵发性、持续性或永久性心房颤动。

在本发明方法的一个实施例中，该受试者有脑卒中或tia(短暂性脑缺血发作)的病史。

在本发明方法的一个实施例中，该受试者的年龄为65岁或更高。进一步地，该受试者的年龄可为55岁或更高。

在本发明方法的一个实施例中，该受试者接受抗凝治疗。

在本发明方法的一个实施例中，脑卒中是心脏栓塞性脑卒中。

在本发明方法的一个实施例中，该受试者是人。

在本发明方法的一个实施例中，其中该样本是血液、血清或血浆。

在本发明方法的一个实施例中，ang-2的量和/或igfbp7的量与参考量相比增加表明受试者有患脑卒中的风险，且/或ang-2的量和/或igfbp7的量与参考量相比减少或未改变表明受试者没有患脑卒中的风险。

在本发明方法的一个实施例中，预测窗口为最长为10年的时段。

在本发明方法的一个实施例中，预测窗口为大约5年的时段。

在本发明方法的一个特别优选的实施例中，预测窗口为最长为3年的时段。

在本发明方法的一个实施例中，该方法进一步包括建议抗凝治疗的步骤，或者如果受试者被鉴定为有脑卒中风险则建议加强抗凝治疗的步骤。

本发明进一步涉及一种预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自具有已知的临床脑卒中风险评分的受试者的样本中的ang-2的量和/或胰岛素样生长因子结合蛋白7(igfbp7)的量，

b)评定所述受试者的临床脑卒中风险评分，以及

c)基于步骤a)和b)的结果预测脑卒中风险。

本发明进一步涉及一种提高受试者的临床脑卒中风险评分的预测准确性的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自具有已知的临床脑卒中风险评分的受试者的样本中的ang-2的量和/或胰岛素样生长因子结合蛋白7(igfbp7)的量，以及

b)将ang-2和/或igfbp-7的量的值与该临床脑卒中风险评分结合，

从而提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

在上述方法的实施例中，该方法进一步包括评定所述受试者的临床风险评分。

在本发明方法的一个实施例中，该临床脑卒中风险评分为cha2ds2-vasc评分、chads2评分或abc评分。

本发明进一步涉及在来自受试者的样本中，以下物质用于预测所述受试者的脑卒中风险：

i)生物标记物ang-2和/或生物标记物igfbp7，和/或

ii)至少一种与ang-2特异性结合的检测剂和/或至少一种与igfbp7特异性结合的检测剂。

本发明进一步涉及在来自受试者的样本中，以下物质用于提高临床脑卒中风险评分的预测准确性：

i)生物标记物ang-2和/或生物标记物igfbp7，和/或

ii)至少一种与ang-2特异性结合的检测剂和/或至少一种与igfbp7特异性结合的检测剂。

本发明进一步涉及在来自受试者的样本中，以下物质与临床脑卒中风险评分结合用于预测受试者的罹患脑卒中风险：

i)生物标记物ang-2和/或生物标记物igfbp7，和/或

ii)至少一种与ng-2特异性结合的检测剂和/或至少一种与igfbp7特异性结合的检测剂，

在一个实施例中，特异性结合igfbp7的检测剂是特异性结合igfbp7的抗体或其抗原结合片段。

在一个实施例中，特异性结合ang-2的检测剂是特异性结合ang-2的抗体或其抗原结合片段。

附图说明

图1a：两个组的加权kaplan-meier存活率估计值由基线igfbp-7测量值＜＝178pg/ml对比＞178pg/ml限定。

该图示出了两个患者组的加权kaplan-meier曲线，其中该两个患者组的基线igfbp-7测量值＜＝178pg/ml对比＞178pg/ml。很容易看出，两个组发生脑卒中的风险有显著差异。如图1a所示，即使在接受口服抗凝剂或维生素拮抗剂的心房颤动患者群体中，igfbp-7也有助于确定脑卒中风险升高的患者。

图1b：两个组的加权kaplan-meier存活率估计值由基线血管生成素-2测量值＜＝2.4ng/ml对比＞2.4ng/ml限定。

该图示出了两个患者组的加权kaplan-meier曲线，其中该两个患者组的基线血管生成素-2测量值＜＝2.4ng/ml对比＞2.4ng/ml。很容易看出，两个组发生脑卒中的风险有显著差异。如图1b所示，即使在接受口服抗凝剂或维生素拮抗剂的心房颤动患者群体中，ang-2也可有助于确定脑卒中风险升高的患者。

具体实施方式

定义

如上所述，本发明涉及一种预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤：

(a)测定来自受试者的样本中的血管生成素-2(ang-2)的量和/或胰岛素样生长因子结合蛋白7(igfbp7)的量，以及

(b)将ang-2的量和/或igfbp7的量与参考量进行比较，从而预测脑卒中的风险。

脑卒中预测应基于比较步骤(b)的结果。

因此，本发明的方法优选地包括以下步骤：

(a)测定来自受试者样本中的血管生成素-2(ang-2)的量和/或胰岛素样生长因子结合蛋白7(igfbp7)的量，

(b)比较ang-2和/或igfbp7的量与参考量，从而预测脑卒中的风险，以及

(c)优选地基于比较步骤(b)的结果预测受试者的脑卒中风险。

根据本发明的方法包括基本上由上述步骤组成的方法或包括其他步骤的方法。此外，本发明的方法优选地是离体方法，更优选地是体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，其他步骤可涉及测定进一步的标记物和/或样本预处理或评估通过该方法获得的结果。该方法可以手动执行或由自动化辅助。优选地，步骤(a)、(b)和/或(c)可全部或部分地由自动化辅助，例如通过合适的机器人和感觉设备进行步骤(a)中的测定或步骤(b)中由计算机实现的计算。

如本领域技术人员应理解的，与本发明相关的预测通常不旨在对100％的待测受试者是正确的。该术语优选地要求能够对受试者的具有统计显著性的部分进行正确的评定(诸如本文所述的治疗的诊断、区别、预测、鉴别或评定)。可以由本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具(例如，确定置信区间、p值确定、学生t检验、mann-whitney检验等)在无需费力的情况下测定某一部分是否是统计上显著的。详情见dowdy和wearden，statisticsforresearch，johnwiley&sons，newyork1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.4、0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。

根据本发明的方法，应预测脑卒中的风险。术语“脑卒中”在本领域是众所周知的。该术语优选地是指缺血性脑卒中，特别是指脑缺血性脑卒中。通过本发明的方法预测的脑卒中应是由于流向大脑或其部分的血流量减少所致，该血流量减少导致脑细胞供氧不足。特别地，由于脑细胞死亡，脑卒中会导致不可逆转的组织损伤。脑卒中的症状在本领域是众所周知的。缺血性脑卒中可能是由动脉粥样硬化血栓形成或大脑主动脉栓塞、由凝血障碍或非肿瘤性血管疾病、或由导致总血流量减少的心脏缺血引起的。缺血性脑卒中优选地选自由动脉粥样硬化性血栓性脑卒中、心栓塞性脑卒中和腔隙性脑卒中组成的组。优选地，要预测的脑卒中是急性缺血性脑卒中，特别是心栓塞性脑卒中。心房颤动可引起心源性脑卒中(通常也称为栓塞性或血栓栓塞性脑卒中)。

术语“脑卒中”优选地不包括出血性脑卒中。受试者是否患有脑卒中，特别是缺血性脑卒中，可以通过众所周知的方法来确定。此外，脑卒中的症状在本领域中是众所周知的。例如，脑卒中症状包括面部、手臂或腿部突然麻木或无力，特别是在身体的一侧，突然意识混乱，说话或理解困难，一只或两只眼睛突然看不到，以及突然行走困难，头晕，失去平衡或协调。

本领域中已知的是，生物标记物可在各种疾病和疾患中增加。这也适用于ang-2和igfbp7。例如，已知igfbp7在心力衰竭患者中增加。然而，技术人员会考虑到这一点。因此，“脑卒中风险的预测”的表述有助于预测与心房颤动相关的不良事件的风险。

这里所指的“受试者”优选地是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，该受试者是人受试者。

优选地，待测受试者为任何年龄，更优选地，待测受试者为50岁或更高年龄，更优选60岁或更高年龄，且最优选65岁或更高年龄。进一步地，设想待测受试者为70岁或更高年龄。此外，设想待测受试者为75岁或更高年龄。同样，该受试者可能在50岁与90岁之间。

进一步地，该受试者的年龄可为55岁或更高。

在本发明方法的一个优选实施例中，待测受试者患有心房颤动。心房颤动可以是阵发性、持续性或永久性心房颤动。因此，该受试者可能患有阵发性、持续性或永久性心房颤动。特别地，设想受试者患有阵发性、持续性或永久性心房颤动。在本发明的基础研究中已经显示，如本文所述的生物标记物的测定允许预测所有子组中的脑卒中。在持续性心房颤动和永久性心房颤动患者中观察到了最好的表现。

因此，在本发明的一个实施例中，该受试者患有阵发性心房颤动。

在本发明的另一实施例中，该受试者患有持续性心房颤动。

在本发明的另一实施例中，该受试者患有永久性心房颤动。

术语“心房颤动”在本领域中是众所周知的。如本文所用，该术语优选地指以心房不协调激活和随之导致心房机械功能恶化为特征的室上性快速心律失常。特别地，该术语指以快速且不规则的跳动为特征的不正常的心律。它涉及心脏的两个上腔室。在正常的心律中，窦房结产生的脉冲通过心脏传播，并引起心肌收缩和血液泵送。在心房颤动时，窦房结的规则电脉冲被无组织、快速的电脉冲所取代，该无组织、快速的电脉冲导致不规则的心跳。心房颤动的症状是心悸、晕厥、呼吸急促或胸痛。然而，大多数发作都没有症状。在心电图上，心房颤动的特征是用在振幅、形状和定时上变化的快速振荡或纤维波代替一致的p波，该振荡或纤维波与房室传导完整时的不规则、频繁的快速心室反应有关。

美国心脏病学会(acc)、美国心脏病协会(aha)和欧洲心脏病学会(esc)提出了以下分类体系(参见fuster(2006)circulation114(7)：e257-354，本文件的全部内容通过引用合并于此，参见例如文件中的图3)：首次检测到af、阵发性af、持续性af和永久性af。

所有有af的人最初都属于被称为第一次检测到af的类别。然而，该受试者可能有或可能没有先前未被检测到的发作。如果af已持续超过一年，则受试者患有永久性af。特别地，不会发生转换回窦性心律的(或仅在医疗干预下转换回窦性心律)。如果af持续超过7天，则受试者患有持续性af。该受试者可能需要药物或电干预来终止心房颤动。因此，持续性af在发作时发生，但心律失常通常不会自发(即在没有医学发明的情况下)转换回窦性心律。阵发性心房颤动优选地是指持续不超过7天并且自发(即在没有医疗干预的情况下)终止的心房颤动的间歇性发作。在大多数阵发性af的病例中，发作持续小于24小时。因此，虽然阵发性心房颤动自发终止的，但是持续性心房颤动并不是自发结束的，并且需要电复律或药物复律来进行终止，或需要其他程序，诸如消融程序(fuster(2006)circulation114(7)：e257-354)。术语“阵发性心房颤动”被定义为这样的af发作，该af发作在小于48小时内，更优选在小于24小时内，并且最优选在小于12小时内自发终止。持续性和阵发性af都可能复发。

如上所述，待测受试者优选患有阵发性、持续性或永久性心房颤动。

此外，可以设想，在获得样本时，受试者患有心房颤动的发作。这可能是例如如果该受试者患有永久性或持续性af的情况。

或者，设想在获得样本时该受试者不患有心房颤动的发作。这可能是例如如果该受试者患有阵发性af的情况。因此，当获得样本时，该受试者应具有正常的窦性心律，即处于窦性心律。

进一步地，预期心房颤动先前已在受试者中诊断出。因此，心房颤动应是被诊断出的，即被检测到的心房颤动。

如实例所示，预测心力衰竭患者的风险是可能的。因此，待测受试者可能患有心力衰竭。根据本发明方法的术语“心力衰竭”优选地涉及左室射血分数降低的心力衰竭。

进一步地，在没有心力衰竭病史的受试者中预测该风险是可能的。因此，待测受试者优选地不患有心力衰竭。特别地，根据nyhaii、iii和iv级，待测受试者不患有心力衰竭。

在本发明的一个实施例中，该受试者不患有左心室射血分数保持的心力衰竭。

在特别优选的实施例中，该受试者是不患有心力衰竭，但是患有心房颤动的受试者。

有利地，在本发明方法的基础研究中已经证明，即使受试者已经接受抗凝治疗，即旨在降低脑卒中风险的治疗(约70％的患者接受口服抗凝剂和约30％的维生素k拮抗剂，诸如华法林(warfarin)和双香豆素(dicumarol))，也可以做出可靠的预测。令人惊讶的是，已经证明通过测定igfbp7和/或ang-2的量可以区分人群或风险患者(即接受抗凝治疗的心房颤动患者)，可以可靠地区分降低的脑卒中风险和增加的脑卒中风险。脑卒中风险增加的af患者可受益于抗凝治疗的强化。此外，脑卒中风险降低的af患者可能会被过度治疗，并且可能受益于强度较小的抗凝治疗(导致例如医疗保健成本降低)。

因此，根据本发明优选的是受试者接受抗凝治疗。

如上所述，抗凝治疗优选为旨在降低所述受试者的抗凝风险的治疗。更优选地，抗凝治疗是施用至少一种抗凝剂。施用至少一种抗凝剂应旨在减少或预防血液凝固和相关的脑卒中。在一个优选实施例中，至少一种抗凝剂选自由以下项组成的组：肝素、香豆素衍生物(即维生素k拮抗剂)(特别是华法林或双香豆素)、口服抗凝剂(特别是达比加群(dabigatran)、利伐沙班(rivaroxaban)或阿哌沙班(apixaban))、组织因子途径抑制剂(tfpi)、抗凝血酶iii、因子ixa抑制剂，因子xa抑制剂、因子va和viiia的抑制剂以及凝血酶抑制剂(抗iia型)。因此，设想受试者服用上述药物中的至少一种。

在优选的实施例中，该抗凝剂是维生素k拮抗剂，诸如华法林或双香豆素。维生素k拮抗剂，诸如华法林或双香豆素价格较低，但是因为治疗不方便，繁琐，而且往往不可靠，并且治疗时间在治疗范围内波动，所以需要更好的患者依从性。noac(新的口服抗凝剂)包括直接因子xa抑制剂(阿哌沙班、利伐沙班、达瑞沙班(darexaban)、依度沙班(edoxaban))、直接凝血酶抑制剂(达比加群)和par-1拮抗剂(沃拉帕沙(vorapaxar)、阿托帕沙(atopaxar))。

在另一优选实施例中，抗凝剂和口服抗凝剂，特别是阿哌沙班、利伐沙班、达瑞沙班、依度沙班、达比加群、沃拉帕沙或阿托帕沙。。

因此，待测受试者可在测试时(即收到样本时)用口服抗凝剂或维生素k拮抗剂进行治疗。

在一个优选实施例中，预测受试者的脑卒中风险的方法还包括i)建议抗凝治疗的步骤，或ii)如果已确定受试者有脑卒中的风险则建议强化抗凝治疗的步骤。在一个优选实施例中，用于预测受试者的脑卒中风险的方法还包括i)开始抗凝治疗的步骤，或ii)如果已(通过本发明的方法)确定该受试者有脑卒中风险则强化抗凝治疗。

如本文所用的术语“建议”是指建立可应用于受试者的治疗方案。然而，应该理解的是该术语并不包括应用实际治疗。建议的治疗取决于通过本发明的方法提供的结局。

特别地，以下规定适用：

如果待测受试者未接受抗凝治疗，则如果已确定受试者有脑卒中风险，就建议开始抗凝治疗。因此，应开始抗凝治疗。

如果待测受试者已接受抗凝治疗，则如果已确定受试者有脑卒中风险，就建议加强抗凝治疗。因此，应加强抗凝治疗。

在一个优选实施例中，通过增加抗凝剂的剂量(即，当前施用的凝结剂的剂量)来加强抗凝治疗。

在一个特别优选的实施例中，通过增加用更有效的抗凝剂替换当前施用的抗凝剂来加强抗凝治疗。因此，建议更换抗凝剂。

据描述，与维生素k拮抗剂华法林相比，用口服抗凝剂阿哌沙班实现了高风险患者中的更好预防，如hijazi等人，2016，图4所示。

因此，设想待测受试者是用维生素k拮抗剂(诸如华法林或双香豆素)治疗的受试者。如果已确定受试者有患脑卒中的风险(通过本发明的方法，建议用口服抗凝剂(特别是达比加群、利伐沙班或阿哌沙班)替代维生素k拮抗剂。根据用维生素k拮抗剂的治疗中止，开始用口服抗凝剂进行治疗。

在本发明的一个优选实施例中，受试者具有脑卒中或tia(短暂性脑缺血发作)的病史。特别地，该受试者有脑卒中病史。

因此，设想受试者在实施本发明的方法之前(或更精确地在获得待测样本之前)患有脑卒中或短暂性脑缺血发作。尽管受试者过去应患过脑卒中或短暂性脑缺血发作，但在获得待测样本时，受试者不应患有脑卒中或短暂性脑缺血发作)。

如上所述，在除心房颤动以外的各种疾病和疾患中，生物标记物ang-2和igfbp7可能增加。在本发明的一个实施例中，设想受试者不患有此类疾病和疾患。

本发明的方法也可用于筛选更大的受试者群体。因此，设想评定至少100名受试者，特别是至少1000名受试者的脑卒中风险。因此，在来自至少100名或特别是至少1000名受试者的样本中确定生物标记物的量。此外，设想评定至少10,000名受试者。

术语“样本”是指体液样本、分离细胞样本或组织或器官样本。体液样本可以通过众所周知的技术获得，并且包括血液、血浆、血清、尿液、淋巴液、痰、腹水，或任何其他身体分泌物或其衍生物的样本。组织或器官样本可以通过例如活检从任何组织或器官获得。分离细胞可以通过诸如离心或细胞分选等分离技术从体液或组织或器官中获得。例如，可以从表达或产生生物标记物的那些细胞、组织或器官中获得细胞、组织或器官样本。样本可以是冷冻、新鲜、固定(例如福尔马林固定)、离心和/或包埋(例如石蜡包埋)的等。在评定估样本中一种或多种生物标记物的量之前，细胞样本当然可以接受各种众所周知的收集后制备和贮存技术(例如核酸和/或蛋白质提取、固定、贮存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。

在本发明的一个优选实施例中，样本是血液(即全血)、血清或血浆样本。血清是在使血液凝固后所获得的全血的液体级分。为了获得血清，通过离心去除血块并收集上清液。血浆是血液中无细胞的流体部分。为了获得血浆样本，将全血收集在抗凝处理过的试管(例如柠檬酸盐处理过的试管或edta处理过的试管)中。通过离心将细胞从样本中取出，并获得上清液(即血浆样本)。

优选地，如本文所用的术语“预测风险”是指评定受试者将遭受脑卒中的概率。典型地，预测受试者是有患脑卒中的风险(因此风险升高)还是没有患脑卒中的风险(因此风险降低)。因此，本发明的方法允许区分有脑卒中风险的受试者和没有脑卒中风险的受试者。进一步地，设想本发明的方法允许区分降低的、平均的和升高的脑卒中风险。

如上所述，应预测在一定时间窗口内患脑卒中的风险(和概率)。根据本发明，设想预测短期风险或长期风险。例如，预测一周内或一个月内患脑卒中的风险。在本发明的基础研究中观察到的最短时间跨度为11天。受试者的ang-2(14.57ng/ml)和igfb7(318ng/ml)水平升高。这表明，不仅可以进行长期预测，而且可以进行短期预测。

在本发明的一个实施例中，预测窗口为约至少三个月、约至少六个月或约至少一年的时段。在另一优选实施例中，预测窗口为约五年的时段。此外，预测窗口可为约六年(例如用于预测脑卒中)的时段。

在一个实施例中，预测窗口为最长为10年的时段。因此，可以预测十年内患脑卒中的风险。

在另一实施例中，预测窗口为最长为7年的时段。因此，可以预测七年内患脑卒中的风险。

在另一实施例中，预测窗口为最长为3年的时段。因此，可以预测三年内患脑卒中的风险。

此外，设想预测窗口为1年至10年的时段。

优选地，从本发明的方法的完成起计算预测窗口。更优选地，从获得待测样本的时间点计算所述预测窗口。

如上文所述，“预测脑卒中风险”的表述是指要通过根据本发明的方法分析的受试者被分配到有脑卒中风险的受试者组中，或被分配到没有脑卒中风险的受试者组中。因此，可以预测受试者是否有患脑卒中的风险。如本文所使用的，“有患脑卒中风险的受试者”优选地具有升高的患脑卒中的风险(优选在预测窗口内)。优选地，与受试者同期群中的平均风险相比，所述风险是升高的。如本文所用的，“没有患脑卒中风险的受试者”优选地具有降低的患脑卒中风险(优选在预测窗口内)。优选地，与受试者同期群中的平均风险相比，所述风险是降低的。优选在五年的预测窗口内，具有脑卒中风险的受试者优选具有至少7％或更优选至少10％的脑卒中风险。优选在五年的预测窗口内，不具有脑卒中风险的受试者优选具有低于5％，更优选低于3％的脑卒中风险。

生物标记物血管生成素-2(缩写为“ang-2”，通常也称为angpt2)在本领域中是众所周知的。它是ang-1和tie2两者的天然存在的拮抗剂(参见例如maisonpierre等人，science277(1997)55-60)。在没有ang-1的情况下，该蛋白可诱导tek/tie2的酪氨酸磷酸化。在没有血管生成诱导因子(如vegf)的情况下，ang2介导的细胞基质接触的松动可诱导内皮细胞凋亡以及随之发生的血管退行。与vegf协同作用，其可促进内皮细胞的迁移和增殖，从而作为允许的血管生成信号。人类血管生成素的序列在本领域中是众所周知的。uniprot列出了血管生成素-2的三种亚型：亚型1(uniprot标识符：o15123-1)、亚型2(标识符：o15123-2)和亚型3(o15123-3)。在一个优选实施例中，测定血管生成素-2的总量。总量优选为复合和游离血管生成素-2的量之和。

igfbp-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)是由内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞和上皮细胞分泌的30kda模块化糖蛋白(ono，y.等人，biochembiophysrescomm202(1994)1490-1496)。优选地，术语“igfbp-7”是指人igfbp-7。蛋白质的序列在本领域中是众所周知的，并且例如可通过uniprot(q16270，ibp7_human)或通过genbank(np_001240764.1)获得。生物标记物igfbp-7的详细定义如wo2008/089994中所提供，该专利的全部内容以引用方式并入本文。igfbp-7有两种亚型：亚型1和亚型2，它们是通过可变剪接产生的。在本发明的一个实施例中，测量两种亚型的总量(关于序列，参见uniprot数据库条目(q16270-1和q16270-2)。

术语“测定”如本文所述的生物标记物的量(ang-2或igfbp7，或两种生物标记物的量)是指生物标记物的量化，例如使用本文别处描述的适当检测方法来测量样本中生物标记物的水平。术语“测量”和“测定”在本文中可互换使用。

在一个实施例中，生物标记物的量是通过以下方式来测定的：使样本与特异性地结合生物标记物的试剂接触，从而在该试剂与所述生物标记物之间形成复合物，检测所形成的复合物的量，并由此测量所述生物标记物的量。

本文提及的生物标记物(诸如ang-2)可以使用本领域中一般已知的方法来检测。检测方法通常包括量化样本中生物标记物的量的方法(定量方法)。本领域技术人员通常已知以下方法中的何种适合于生物标记物的定性和/或定量检测。可以使用商购可得的western和免疫分析，如elisa、ria、基于荧光和发光的免疫测定和邻近延伸测定法来方便地测定样本中的例如蛋白质。检测生物标记物的其他合适方法包括测量肽或多肽特有的物理或化学性质，诸如其精确的分子质量或nmr谱。所述方法包括，例如生物传感器、耦合到免疫测定的光学装置、生物芯片、分析装置(诸如质谱仪、nmr分析仪或色谱装置)。进一步地，方法包括基于微板elisa的方法、全自动或机器人免疫测定(例如在elecsys^tm分析仪上可用)、cba(例如在roche-hitachi^tm分析仪上可用的酶钴结合测定)和乳胶凝集测定(例如在roche-hitachi^tm分析仪上可用)。

对于本文所述的生物标记物蛋白的检测，可以使用这种测定形式的各种免疫测试技术，参见例如美国专利号4016043、4424279和4018653。这些技术包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”测定，以及传统的竞争性结合测定。这些测定还包括标记抗体与靶标生物标记物的直接结合。

采用电化学发光标签的方法是众所周知的。此类方法利用特殊金属复合物的借助于氧化实现激发态的能力，所述特殊金属复合物从该激发态衰变为基态，从而发出电化学发光。关于综述请参见richter，m.m.，chem.rev.2004；104：3003-3036。

在一个实施例中，用于测量生物标记物的量的检测抗体(或其抗原结合片段)被钌化或铱化。因此，抗体(或其抗原结合片段)应包含钌标签。在一个实施例中，所述钌标签是联吡啶钌(ii)复合物。或抗体(或其抗原结合片段)应包含铱标签。在一个实施例中，所述铱标签是如wo2012/107419中所公开的复合物。

在用于测定ang-2的夹心测定的一个实施例中，该测定包括特异性结合ang-2的生物素化的第一单克隆抗体(作为捕获抗体)；以及特异性结合ang-2的第二单克隆抗体(作为检测抗体)的钌化f(ab′)2片段。两种抗体与样本中的ang-2形成夹心免疫测定复合物。

在用于测定igfbp7的夹心测定的一个实施例中，该测定包括特异性结合igfbp7的生物素化的第一单克隆抗体(作为捕获抗体)；以及特异性结合igfbp7的第二单克隆抗体(作为检测抗体)的钌化f(ab′)2片段。两种抗体与样本中的igfbp7形成夹心免疫测定复合物。

测量多肽(诸如ang-2或igfbp7)的量可优选地包括以下步骤：(a)将多肽与特异性结合所述多肽的试剂接触，(b)(任选地)移除未结合的试剂，(c)测量结合的试剂的量，即在步骤(a)中形成的试剂的复合物。根据一个优选实施例，所述接触、移除和测量步骤可由分析器单元执行。根据一些实施例，所述步骤可由所述系统的单个分析器单元或由彼此可操作通信的多于一个分析器单元来执行。例如，根据一个特定实施例，本文所公开的所述系统可包括用于执行所述接触和移除步骤的第一分析器单元；以及第二分析器单元，所述第二分析器单元通过传输单元(例如，机械臂)可操作地连接到所述第一分析器单元，所述第二分析器单元执行所述测量步骤。

专门结合生物标记物的试剂(在此也称为“结合试剂”)可以共价或非共价地耦合到标签，从而允许检测和测量结合的试剂。可通过直接或间接方法进行标记。直接标记涉及将标签直接(共价或非共价)耦合到结合试剂。间接标记涉及二级结合试剂与第一结合试剂的结合(共价或非共价)。该二级结合试剂应特异性地与第一结合试剂结合。所述二级结合试剂可以与适当的标签耦合，并且/或者是三级结合试剂的与二级结合试剂结合的靶标(受体)。合适的二级和更高阶的结合试剂可包括抗体、二抗和众所周知的链霉亲和素-生物素体系(vectorlaboratories，inc.)。结合试剂或底物也可以用本领域已知的一个或多个标签“标记”。此类标签可以是更高阶的结合试剂的靶标。合适的标签包括生物素、洋地黄毒苷、his标签、谷胱甘肽-s-转移酶、flag、gfp、myc标签、甲型流感病毒血凝素(ha)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，该标签优选地位于n-末端和/或c-末端。合适的标签是可通过合适的检测方法检测到的任何标签。典型的标签包括金颗粒、乳胶珠粒、吖啶酸酯、鲁米诺、钌复合物、铱复合物、酶活性标签、放射性标签、磁性标签(“例如磁珠”，包括顺磁标签和超顺磁标签)和荧光标签。酶活性标签包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶，以及它们的衍生物。用于检测的合适底物包括二氨基联苯胺(dab)、3，3′-5，5′-四甲基联苯胺、nbt-bcip(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氧-3-吲哚基磷酸盐，可作为现成储备溶液从rochediagnostics购得)、cdp-star^tm(amershambio-sciences)、ecf^tm(amershambiosciences)。合适的酶-底物组合可产生有色反应产物、荧光或化学发光，所述有色反应产物、荧光或化学发光可根据本领域已知的方法(例如使用感光胶片或合适的摄像系统)来测定。对于酶反应的测量，上述给定的标准类似地适用。典型的荧光标记包括荧光蛋白(诸如gfp及其衍生物)、cy3、cy5、德克萨斯红、荧光素和alexa染料(例如alexa568)。进一步的荧光标签可从molecularprobes(oregon)购得。同样，还考虑使用量子点作为荧光标签。放射性标签可以通过任何已知且适当的方法检测，所述方法为例如感光胶片或磷光成像仪。

多肽的量也可以优选地如下测定：(a)将包含如本文其他部分所述的多肽的结合试剂的固体支持物与包含所述肽或多肽的样本接触，以及(b)测量与支持物结合的肽或多肽的量。制造支持物的材料在本领域中是众所周知的，并且尤其包括商用柱材料、聚苯乙烯珠粒、乳胶珠粒、磁性珠粒、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅片和表面、硝化纤维带、膜、片材、duracytes、反应盘的孔和壁、塑料管等。

在另一方面中，在测量形成的复合物的量之前，从结合试剂与至少一种标记物之间形成的复合物中移除样本。因此，在一个方面中，该结合试剂可固定在固体支持物上。在另一方面中，通过应用洗涤溶液，可以从固体支持物上形成的复合物中移除样本。

“夹心测定”是最有用和最常用的测定之一，包括夹心测定技术的许多变型。简单地说，在典型的测定中，未标记的(捕获)结合试剂被固定或可以固定在固体底物上，并且使待测样本与捕获结合试剂接触。在适当的孵育期后，添加和孵育用能够产生可检测信号的报告分子标记的第二(检测)结合试剂达足以允许形成结合试剂-生物标记物复合物的时间段，从而使时间足以形成结合试剂-生物标记物-标记的结合试剂的另一复合物。可将任何未反应的材料洗去，并且通过观察由与检测结合试剂结合的报告分子产生的信号来确定生物标记物的存在。结果可以通过简单观察可见信号来定性，或者可以通过与含有已知量的生物标记物的对照样本进行比较来量化。

典型夹心测定的孵育步骤可以根据需要和在适当时进行变化。此类变化包括例如同时孵育，其中将两种或更多种结合试剂和生物标记物共孵育。例如，将待分析的样本和标记的结合试剂同时添加到固定的捕获结合试剂中。也可以首先孵育待分析的样本和标记的结合试剂，然后添加结合到固相或能够结合到固相的抗体。

特定结合试剂与生物标记物之间形成的复合物应与样本中存在的生物标记物的量成比例。应理解的是，将要应用的结合试剂的特异性和/或敏感性限定了样本中包含的能够被特异性结合的至少一种标记物的比例程度。也可在本文其他地方找到关于可以如何进行测量的进一步细节。形成的复合物的量应转化为生物标记物的量，从而反映样本中真实存在的量。

术语“结合试剂”、“特异性结合试剂”、“分析物特异性结合试剂”、“检测剂”和“与生物标记物特异性结合的试剂”在本文中可互换使用。优选地，它涉及这样的试剂，所述试剂包含特异性结合对应的生物标记物的结合部分。“结合试剂”、“检测剂”、“试剂”的实例是核酸探针、核酸引物、dna分子、rna分子、适体、抗体、抗体片段、肽、肽核酸(pna)或化合物。优选的试剂是特异性结合待测定生物标记物的抗体。本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性(即其抗原结合片段)即可。优选地，该抗体是多克隆抗体(或其抗原结合片段)。更优选地，抗体是单克隆抗体(或来自其的抗原结合片段)。因此，如本文别处所述，设想使用在ang-2的不同位置处结合的两种单克隆抗体(在夹心免疫测定中)。因此，将至少一种抗体用于测定ang-2的量。

术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指结合对分子在它们没有与其他分子显著结合的条件下表现为彼此结合的结合反应。当提及蛋白质或肽作为生物标记物时，术语“特异性结合”或“特异性地结合”优选地指结合试剂以至少10⁷m^-1的亲和力(“结合常数”ka)与对应的生物标记物结合的结合反应。术语“特异性结合”或“特异性地结合”优选地是指对其靶分子具有至少10⁸m^-1或甚至更优选至少10⁹m^-1的亲和力。术语“特异的”或“特异性地”用于表示样本中存在的其他分子不显著地与特异于该靶分子的结合试剂结合。

如本文所用的术语“量”包括本文提及的生物标记物(诸如ang-2或igfbp7)的绝对量、所述生物标记物的相对量或浓度，以及与其相关或可从其导出的任何值或参数。此类值或参数包括来自通过直接测量从所述肽获得的所有具体物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或nmr谱中的强度值。此外，所包含的是通过在本说明书其他地方指定的间接测量获得的所有值或参数，例如，响应于肽或从特异性结合的配体获得的强度信号而从生物读出系统测定的反应量。应理解的是，与上述量或参数相关的值也可以通过所有标准数学运算获得。

如本文所用的术语“比较”是指将来自受试者的样本中的生物标记物(ang-2或igfbp7)的量与本说明书其他地方指定的生物标记物的参考量进行比较。应理解的是，如本文所用的比较通常指对应的参数或值的比较，例如，将绝对量与绝对参考量进行比较，而将浓度与参考浓度进行比较，或将从样本中的生物标记物获得的强度信号与从参考样本获得的相同类型的强度信号进行比较。可手动或计算机辅助进行比较。因此，可以由计算装置进行比较。例如，可以将来自受试者的样本中生物标记物的测定或检测量的值与参考量相互比较，并且可以由执行比较算法的计算机程序自动执行所述比较。执行上述评估的计算机程序将以适当的输出格式提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测定的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测定的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可以进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的预测。

根据本发明，本文所提及的生物标记物(即ang-2和/或igfbp7)的量应与参考(即与一个参考量(或与多个参考量))进行比较。因此，参考优选为参考量。术语“参考量”被技术人员很好地理解。应理解的是，参考量应允许进行脑卒中的预测或如本文其他地方所述的脑卒中临床预测规则的优化。例如，关于预测脑卒中风险的方法，参考量优选地是指这样的量，所述量允许将受试者分配到(i)患有心房颤动的受试者的组，或(ii)未患有心房颤动的受试者的组。可从要与测试样本一起(即同时或随后)分析的参考样本确定适当的参考量。

应当理解的是，将ang-2的量与ang-2的参考量相比较和/或将igfbp7的量与igfbp7的参考量相比较。如果测定了两种标记物的量，则也可以设想基于ang-2和igfbp7的量来计算综合评分。在随后的步骤中，将评分与参考评分进行比较。

原则上，可以基于给定生物标记物的平均值或均值，通过施加标准统计方法来计算如上文所指定的受试者同期群的参考量。特别地，测试(诸如旨在诊断发生事件或未发生事件的方法)的准确性通过其接收器操作特性(roc)而被最好地描述(特别地参见zweigmh.等人，clin.chem.1993；39：561-577)。roc曲线图是在观察到的整个数据范围内连续改变决策阈值所产生的所有敏感性对比特异性对的曲线。诊断方法的临床性能取决于其准确性，即其能够正确地将受试者分配到某一预后或诊断中。roc曲线通过将适用于区分的整个阈值范围的敏感性对比1-特异性绘制成曲线而显示了两种分布之间的重叠。y轴上是敏感性，即真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性测试结果数和假阴性测试结果数之积的比率。其仅从受影响的子组计算。x轴上是假阳性分数，即1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性结果数和假阳性结果数之积的比率。这是一个特异性指数，并且完全由未受影响的子组计算得出。由于真阳性分数和假阳性分数是完全分开计算的，所以通过使用来自两个不同子组的测试结果，roc曲线与同期群中事件的患病率无关。roc曲线上的每一点代表与特定决策阈值对应的敏感性/特异性对。有完全区别(两种结果分布没有重叠)的测试具有穿过左上角的roc曲线，其中真阳性分数为1.0或100％(完全敏感性)，并且假阳性分数为0(完全特异性)。无区别(两个组的结果分布相同)的测试的理论曲线是从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线落在这两个极端之间。如果roc曲线完全落到低于45°对角线，则可以通过将“阳性”的标准从“大于”逆转为“小于”或反之亦然来轻松纠正。定性地，曲线越接近左上角，则测试的总体准确度就越高。根据期望的置信区间，可以从roc曲线导出阈值，从而允许分别在适当的敏感性和特异性平衡下对给定事件进行诊断。因此，优选地，通过建立如上所述的所述同期群的roc并由此导出阈值量，可以生成用于本发明方法的参考，即允许评定心房颤动的阈值。根据诊断方法所需的敏感性和特异性，roc曲线允许得出合适的阈值。应理解的是，最佳敏感性是排除具有脑卒中风险的受试者(即排除)所需的，而最佳特异性是针对据预测有脑卒中风险的受试者(即确定)设想的。

优选地，本文的术语“参考量”是指预定值。所述预定值应允许预测脑卒中风险。

优选地，参考量，即参考量应允许区分有脑卒中风险的受试者和没有脑卒中风险的受试者。

诊断算法优选如下：

优选地，ang-2的量和/或igfbp7的量与参考量相比增加表明受试者有患脑卒中风险的是指示性的，且/或ang-2的量和/或igfbp7的量与参考量相比减少(或未改变)表明受试者没有患脑卒中的风险。

优选的参考量在实例部分给出。例如，关于ang-2，参考量可为2.4ng/ml，并且关于igfbp7，参考量可为178pg/ml，优选在血液、血清或血浆样本中。然而，本领域技术人员应理解，根据期望的敏感性和特异性，其他参考量也可用于可靠的预测。

在本发明的基础研究中，进一步证明，ang-2和/或igfbp7的测定允许提高受试者的临床脑卒中风险评分的预测准确性。因此，与ang-2和/或igfbp7的测定或单独的临床脑卒中风险评分的测定相比，临床脑卒中风险评分的测定和ang-2和/或igfbp7的测定的组合可以更可靠地预测脑卒中。

因此，预测脑卒中风险的方法可进一步包括将ang-2和/或igfbp7的量与临床脑卒中风险评分的进行组合。基于ang-2和/或igfbp7的量与临床风险评分的组合，预测测试受试者的脑卒中风险。

因此，本发明特别涉及一种预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自具有已知的临床脑卒中风险评分的受试者的样本中的ang-2的量和/或胰岛素样生长因子结合蛋白7(igfbp7)的量，

b)评定所述受试者的临床脑卒中风险评分，以及

c)基于步骤a)和b)的结果预测脑卒中风险。

根据本发明的方法，设想受试者是具有已知临床脑卒中风险评分的受试者。因此，临床脑卒中风险评分的值是受试者已知的。

或者，该方法可包括获得或提供临床脑卒中风险评分的值。因此，步骤b)优选地包括提供临床风险评分的值。优选地，该值是数字。在一个实施例中，临床脑卒中风险评分是通过医生可用的基于临床的工具中的一种生成的。优选地，值是通过测定受试者的临床脑卒中风险评分的值而提供的。更优选地，受试者的值是从受试者的患者记录数据库和病史获得的。因此，评分的值也可以使用该受试者的历史数据或公布的数据来确定。

根据本发明，将ang-2和/或igfbp7的量与临床脑卒中风险评分结合。这意味着优选地，将ang-2和/或igfbp7的量的值与临床脑卒中风险评分结合。因此，将这些值有效结合以预测受试者罹患脑卒中的风险。通过结合该值，可以计算单个值，该单个值本身可用于预测。

临床脑卒中风险评分在本领域中是众所周知的。例如，在kirchhofp.等人(europeanheartjournal2016；37：2893-2962)中描述了所述评分。在一个实施例中，评分是cha2ds2-vasc评分。在另一个实施例中，评分是chads2评分。(gagebf.等人，jama，285(22)(2001)，第2864-2870页)和abc评分，即abc(年龄、生物标记物、临床病史)脑卒中风险评分(hijaziz.等人，lancet2016；387(10035)：2302-2311)。本段中的所有出版物的全部公开内容均以引用方式并入本文。

因此，在本发明的一个实施例中，临床脑卒中风险评分是cha2ds2-vasc评分。

在本发明的另一实施例中，临床脑卒中风险评分是chads2评分。

在另一实施例中，临床风险评分是abc评分。abc脑卒中风险评分是用于预测af中的脑卒中的新的基于生物标记物的风险评分，该风险评分在大的af患者同期群中得到验证，并在独立的af同期群中得到进一步的外部验证(参见hijazi等人，2016)。它包括受试者的年龄、所述受试者的血液、血清或血浆肌钙蛋白t和nt-probnp水平，以及关于受试者是否有脑卒中病史的信息。优选地，abc脑卒中评分是如hijazi等人所公开的评分。

在一个优选实施例中，预测受试者脑卒中风险的上述方法进一步包括建议抗凝治疗的步骤，或如果已确定受试者有脑卒中风险则建议强化抗凝治疗的步骤(如本文别处所述)。

提高临床脑卒中风险评分的预测准确性的方法

本发明进一步涉及一种提高受试者的临床脑卒中风险评分的预测准确性的方法，该方法包括以下步骤：

a)如本文其他地方所规定，测定来自受试者的样本中ang-2和/或igfbp7的量，以及

b)将ang-2和/或igfbp7的量(特别是该量的值)与临床脑卒中风险评分结合，从而提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

该方法可包括进一步的步骤：c)基于步骤b)的结果提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

本文中给出的与评定心房颤动的方法有关的定义和解释，特别是预测不良事件(诸如脑卒中)的风险的定义和解释优选地同样适用于上述方法。例如，设想受试者是具有已知临床脑卒中风险评分的受试者。或者，该方法可包括获得或提供临床脑卒中风险评分的值。

根据本发明，将ang-2和/或igfbp7的量与临床脑卒中风险评分结合。这意味着优选地，将ang-2和/或igfbp7的量的值与临床脑卒中风险评分结合。因此，将这些值有效结合，以提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

本发明进一步涉及一种有助于预测受试者的脑卒中风险的方法，所述方法包括以下步骤：

a)根据本发明的方法从本文所述的受试者获得样本，

b)测定所述样本中生物标记物ang-2和/或igfbp7的量，以及

c)向受试者的主治医生提供关于生物标记物ang-2和/或igfbp7的测定量的信息，从而帮助预测风险

主治医师应为要求测定一种或多种生物标志物的医师。上述方法应帮助主治医师评定心房颤动。因此，该方法不包括对风险的实际预测。

上述样本获得方法的步骤a)不包括从受试者处提取样本。优选地，通过接收来自所述受试者的样本来获得该样本。因此，可以递送样本。

本发明进一步涉及一种方法，该方法包括：

a)提供对生物标记物ang-2和/或igfbp7的测试，以及

b)提供关于在心房颤动的评定中使用通过所述一个或多个测试获得或可获得的测试结果的使用说明。

上述方法的目的优选地是有助于预测脑卒中风险，如本文其他地方更详细描述的。

使用说明应包含实施评定如上所述的心房颤动的方法的方案。此外，使用说明应包含ang-2和/或igfbp7的参考量的至少一个值。

该“测试”优选为适于执行评定心房颤动的方法的试剂盒。术语“试剂盒”在下文中解释。例如，所述试剂盒应包括至少一种用于生物标记物ang-2的检测剂和/或至少一种用于生物标记物igfbp7的检测剂。这两种生物标记物的检测剂可在一个试剂盒或两个单独的试剂盒中提供。

通过所述测试获得或可获得的测试结果是一个或多个生物标记物的量的值。

在一个实施例中，步骤b)包括提供关于在脑卒中的预测(如本文别处所述)中使用通过所述一个或多个测试获得或可获得的测试结果的使用说明。

上面给出的定义和解释，优选地在细节上作必要的修改后适用于以下：

本发明进一步涉及在来自受试者的样本中，以下物质用于预测所述受试者的脑卒中风险：

i)生物标记物ang-2和/或生物标记物igfbp7，和/或

ii)至少一种与ang-2特异性结合的检测剂和/或至少一种与igfbp7特异性结合的检测剂。

进一步地，本发明考虑在来自受试者的样本中，以下物质用于提高临床脑卒中风险评分的预测准确性：

i)生物标记物ang-2和/或生物标记物igfbp7，和/或

ii)至少一种与ang-2特异性结合的检测剂和/或至少一种与igfbp7特异性结合的检测剂。

最后，本发明涉及在来自受试者的样本中，以下物质与临床脑卒中风险评分结合用于预测所述受试者罹患脑卒中风险：

i)生物标记物ang-2和/或生物标记物igfbp7，和/或

ii)至少一种与ang-2特异性结合的检测剂和/或至少一种与igfbp7特异性结合的检测剂，

已经结合本发明的方法定义了与上述用途相关的术语，诸如“样本”、“受试者”、“检测剂”、“ang-2”、“igfbp7”、“特异性结合”、“脑卒中”和“预测风险”。定义和解释相应地适用。

优选地，上述用途是体外用途。此外，该检测剂优选为抗体，诸如单克隆抗体(或其抗原结合片段)，该抗体与生物标记物特异性结合。

本说明书中引用的所有参考文献的全部公开内容和在本说明书中特别提及的公开内容均以引用方式并入本文。

实例

本发明仅通过以下实例来说明。无论如何，所述实例不得以限制本发明范围的方式进行解释。

实例1：

在具有记录的心房颤动的患者的前瞻性多中心登记中评定了循环igfbp-7和循环ang-2预测脑卒中发生风险的能力(conend.，forummedsuisse2012；12：860-862；blums.(jamheartassoc.2017；6：e005401.doi：10.1161/jaha.116.005401)。

beataf同期群包括1553名患者的基线血浆样本，所述患者被随访7年。女性的平均年龄为70+/-11岁，并且男性的平均年龄为67+/-12岁。主要终点是脑卒中或全身性栓塞。70名患者在随访期内经历脑卒中，所述脑卒中中的大部分在3年内发生。在2010年与2014年间，共有1553名记录在案的af患者在瑞士7个中心注册。当时的治疗方法仅从维生素k拮抗剂改为口服抗凝，其中约70％的入选患者接受口服抗凝治疗，并且有一部分患者在采血时仍接受维生素拮抗剂治疗。beataf同期群中的大多数患者已经接受了“新的治疗、新的口服抗凝剂”(noac、oac)代替维生素k拮抗剂来进行血栓预防和脑卒中预防。

noac包括直接因子xa抑制剂(阿哌沙班、利伐沙班、达瑞沙班、依度沙班)、直接凝血酶抑制剂(达比加群)和par-1拮抗剂(沃拉帕沙、阿托帕沙)。维生素k拮抗剂包括华法林和双香豆素。所有患者都必须有先前由ecg记录的af、心律条带图、或装置问诊。约60％的入选患者有阵发性af，20％有持续性af并且20％有永久性af。通过临床诊断评定阵发性af，所述临床诊断包括采血时出现窦性心律的患者以及采血时出现几次af发作和持续性af的患者的自限性af。排除标准是不能签署知情同意书和仅出现短暂的af发作(例如心脏手术后af)。

69名有脑卒中结局的患者和1435名无脑卒中患者的igfbp-7水平是可用的。69名有脑卒中结局的患者和1430名无脑卒中患者的血管生成素-2水平是可用的。

为了量化igfbp-7和ang-2的单变量预后值，使用具有脑卒中结局的成比例危险模型。

分别用由igfbp-7和由ang-2给出的预后信息的两种不同组合来评定igfbp-7和ang-2的单变量预后性能。

第一成比例危险模型包括以中位数(分别为178pg/ml或2.4ng/ml)二值化的igfbp-7或ang-2，因此比较igfbp-7或ang-2低于或等于中位数的患者与igfbp-7或ang-2高于中位数的患者的风险。

第二成比例风险模型包括原始的igfbp-7或ang-2水平，但转换为log2尺度。执行log2转换是为了实现更好的模型校准。

表1：包括经二值化和log2转换的igfbp-7和ang-2的单变量加权成比例风险模型的结果。

表1显示了两个单变量加权成比例风险模型的结果，该两个单变量加权成比例风险模型包括经二值化或log2转换的igfbp-7或ang-2。

在这两个模型中，发生脑卒中的风险与igfbp-7或ang-2的基线值之间的关联非常显著。

二值化的igfbp-7的危险比意味着基线igfbp-7＞178pg/ml的患者组的脑卒中风险比基线igfbp-7＜＝178pg/ml的患者组的脑卒中风险的高3.14倍。

包括作为经log2转换的线性风险预测因子的igfbp-7的成比例危险模型的结果表明，经log2转换的值igfbp-7与脑卒中风险成比例。危险比3.09可以解释为igfbp-7增加2倍与脑卒中风险增加3.09有关。

二值化的血管生成素-2的危险比意味着基线血管生成素-2＞2.4ng/ml的患者组的脑卒中风险比基线血管生成素-2＜＝2.4ng/ml的患者组的高3.31倍。

包括作为经log2转换的线性风险预测因子的血管生成素-2的成比例危险模型的结果表明，经log2转换的值血管生成素-2与脑卒中风险成比例。危险比1.78可以解释为血管生成素-2增加2倍与脑卒中风险增加1.78有关。

用kaplan-meier曲线示出了两个组中基于二分的基线igfbp-7或ang-2测量值(分别是＜＝178pg/ml与＞178pg/ml；＜＝2.4ng/ml与＞2.4ng/ml)的绝对存活率。

为了评定igfbp-7或ang-2的预后值是否独立于已知的临床和人口学风险因素，计算加权的成比例cox模型，该加权的成比例cox模型还包括以下变量：年龄、性别、chf史、高血压史、脑卒中/tia/血栓栓塞史、血管疾病史和糖尿病史。

图1a示出了基线igfbp-7测量值＜＝178pg/ml与＞178pg/ml的两个患者组的加权kaplan-meier曲线。很容易看出，两个组发生脑卒中的风险有显著差异。如图1所示，即使在接受口服抗凝剂或维生素拮抗剂的心房颤动患者群体中，igfbp-7也可有助于确定脑卒中风险升高的患者。

图1b示出了两个患者组的加权kaplan-meier曲线，其中该两个患者组的基线血管生成素-2测量值＜＝2.4ng/ml对比＞2.4ng/ml。很容易看出，两个组发生脑卒中的风险有显著差异。如图1b所示，即使在接受口服抗凝剂或维生素拮抗剂的心房颤动患者群体中，ang-2也可有助于确定脑卒中风险升高的患者。

表2：包括igfbp-7、ang-2及相关的临床和人口统计学变量的多变量成比例危险模型。

表2显示了包括igfbp-7(经log2转换的)的成比例危险模型与临床和人口统计学变量相结合的结果。虽然igfbp-7的危险比的点估计仍显著高于1，但p值现在高于0.05。

然而，考虑到危险比仍然很高并且仅包括表2中所示的临床变量的模型的c指数随着igfbp-7的加入而提高了0.0054，可以预期igfbp-7对具有例如140个事件的更大同期群的影响将是显著的。

表2显示了包括血管生成素-2(经log2转换的)与临床和人口统计学变量的组合的成比例危险模型的结果。这清楚地表明，如果调整相关临床和人口统计学变量的预后效应，则血管生成素-2的预后效应保持显著

为了评定igfbp-7或ang-2改善包括chads2的脑卒中加权成比例危险模型的预后的现有风险评分的能力，分别计算cha2ds2-vasc评分和igfbp-7或ang-2(经log2转换的)。

表3：结合chads2评分与igfbp-7和ang-2的加权成比例危险模型(经log2转换的)

表3显示了加权成比例危险模型的结果，该加权成比例危险模型结合了chads2评分与igfbp-7和ang-2(经log2转换的)。此外，在该模型中，igfbp-7和ang-2可将预后信息添加到chads2评分中。

表4：结合cha2ds2-vasc评分与igfbp-7和ang-2的加权呈比例危险模型(经log2转换的)

表4显示了加权成比例危险模型的结果，该加权成比例危险模型结合了cha2ds2-vasc评分与igfbp-7和ang-2(经log2转换的)。与表2相似，igfp-7的危险比仍高于1，但p值仍未达到0.05。在此也要考虑相对较少量的事件。此外，在该模型中，血管生成素-2可将预后信息添加到cha2ds2-vasc评分中。

将chads2和cha2ds2-vasc评分的c指数与这些模型的c指数进行比较。

表5：igfbp-7、ang-2、chads2、cha2ds2-vasc和abc评分的c指数及它们与igfbp-7或ang-2的结合。

观察到的脑卒中最短时间为无脑卒中、tia、血管疾病、高血压或糖尿病病史的75岁永久性心房颤动女性患者采血后11天。在基线时检测到igfbp-7(318pg/ml)和ang-2(14.6ng/ml)的效价升高。患者有永久性心房颤动并且接受抗凝治疗。该患者无心力衰竭病史并且无心力衰竭诊断。

比较有和无心力衰竭(hf)史的脑卒中患者中的igfbp-7和ang-2的中值。

表6：在有和无心力衰竭史的患者中的igfbp-7和ang-2

如表6所示，无论是否有心力衰竭病史，在脑卒中患者中都观察到igfbp-7水平升高到高于178pg/ml并且ang-2水平升高到高于2.4ng/ml。在54名无心力衰竭诊断并无心力衰竭病史的患者中，igfbp-7水平升高到高于178pg/ml并且ang-2水平升高到高于2.4ng/ml。

结果表明，igfbp-7可以以多种方式用于预测新患者的未来脑卒中风险，无论是单独使用，还是作为组合使用，以显著提高预测脑卒中风险中的临床评分(诸如chads2、cha2ds2-vasc和abc)。患者可能是具有心房颤动并且已经接受抗凝或维生素ka拮抗剂治疗的患者。

对于新患者，可以测量igfbp-7，并将其与预先定义的截止值(例如178pg/ml)进行比较。如果新患者的测量值高于预先确定的截止值，则认为患者有高脑卒中风险，并可发起适当的临床措施。

还可以基于不断增加的一组截止值来定义多于两个风险组。然后基于igfbp-7的测量值将患者分配到风险组中的一个风险组中。在不同的风险组中，脑卒中的风险预计会增加。

或者，也可以基于预先定义的适当转换函数，将igfbp-7的结果直接转换为连续的风险评分。

此外，可以将igfbp-7的值与基于临床和人口统计学变量的风险评分(例如cha2ds2-vasc评分或abc评分)结合使用，从而提高风险预测的精度。

对于新患者，应评定风险评分的值并将该值以适当的方式与测量的igfbp-7值(潜在的经log2转换的)相结合，例如通过创建风险评分结果和具有适当预定义权重的igfbp-7值的加权和(例如如表3所示)。

结果表明，血管生成素-2可以多种方式用于预测新患者未来脑卒中的风险，无论是单独使用，还是作为组合使用，以显著提高预测脑卒中风险中的临床评分(诸如chads2、cha2ds2-vasc和abc)。患者可能是具有心房颤动并且已经接受抗凝或维生素ka拮抗剂治疗的患者。

对于新患者，可以测量血管生成素-2，并与预先定义的截止值(例如2.4ng/ml)进行比较。如果新患者的测量值高于预先确定的截止值，则认为患者有高脑卒中风险，并可发起适当的临床措施。

还可以基于不断增加的一组截止值来定义多于两个风险组。

然后，基于患者的血管生成素-2测量值，将患者分配到风险组中的一个风险组中。在不同的风险组中，脑卒中的风险预计会增加。

或者，也可以基于预先定义的适当转换函数，将血管生成素-2的结果直接转换为连续的风险评分。

此外，还可以将血管生成素-2的值与基于临床和人口统计学变量的风险评分(例如cha2ds2-vasc评分或abc评分)结合使用，从而提高风险预测的精度。

对于新患者，应评定风险评分的值并将该值以适当的方式与测量的血管生成素-2值(潜在的经log2转换的)相结合，例如通过创建风险评分结果和具有适当预定义权重的血管生成素-2值的加权和(例如如表3所示)。