一种梨果中挥发性芳香物质的GC×GC-TOFMS检测方法与流程

本发明涉及梨果中挥发性芳香物质的全谱扫描方法，具体是指应用全二维气相色谱-飞行时间质谱(gc×gc-tofms)实现梨果中挥发性芳香物质的全谱扫描，并通过2-壬酮进行内标定量分析，属于食品科学、分析化学领域。

背景技术：

作为梨起源中心之一，我国具有丰富的梨种质资源，在世界梨产业中占有重要地位。近几年，无论栽培面积还是产量都迅速发展，梨属新品种也在逐年增加。果实香气可以客观反映果实的风味特性及成熟程度，同时直接决定着果实及其加工品的品质，显著影响其市场竞争力，近年来受到了大量学者的广泛关注。

固相微萃取(solidphasemicro-extraction，spme)与气相色谱质谱联用(gaschromatography-massspectrometry，gc-ms)是研究香气组分最常用的方法。现在已有学者应用此研究套袋、成熟度、采收期、贮藏期等对梨果挥发性香气组分的影响；分析我国四大系统梨果中挥发性香气物质及其之间的差异，以挥发性物质的种类描述梨果的感官特性，并分析挥发性香气物质的合成及表达机理，研究过程中建立了良好的香气组分萃取方法，并对影响梨果香气的因素、梨果中香气组分差异及形成相关性进行详细阐述。

随着检测要求的不断深化，gc-ms在食品挥发及半挥发研究上的局限性也逐渐地暴露出来，如灵敏度较低、峰容量有限、检测成分较少等。全二维气相色谱具分辨率高、灵敏度高、峰容量大等优势，能克服传统单柱气相色谱对多组分样品分离能力相对较差的问题，十分适合于复杂体系的分析；飞行时间质谱具有很高的采集频率，能够实现与全二维气相色谱的最佳配合，加之高性能数据处理软件，具备自动峰识别以及图谱去卷积解析功能，大大提高了检测分析的灵敏度，近些年来已经在食品、植物香气化学等领域取得了良好的分析效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于建立梨果中挥发性芳香组分的全二维气相色谱-飞行时间质谱(gc×gc-tofms)检测方法，实现梨果芳香物质全谱扫描，通过数据分析找到不同梨果中特有芳香组分，为梨果的溯源提供详尽、可靠的数据支持。该方法采用固相微萃取技术(spme)对梨果芳香物质进行萃取，通过优化gc×gc-tofms影响芳香物质测试分析的仪器参数实现梨果中挥发性芳香物质的全谱扫描。该方法操作简单、快速、灵敏度高、分辨率高，可用于梨果产地溯源。

本发明所采用的技术方案为：一种梨果中挥发性芳香物质的gc×gc-tofms检测方法，包括以下步骤：

(1)样品制备：取梨果的一个部分，去核，切成梨块，每个样品至少选择3个梨果，将所有梨块混合均匀；

(2)挥发性芳香物质萃取：取混匀梨块装入固相微萃取装置的萃取瓶中，滴加2-壬酮内标溶液于梨块上，盖紧塞子静置，应用固相微萃取装置将梨果香气物质萃取至固相微萃取头；

(3)解吸：将固相微萃取头插入气相色谱端进样口进行解吸，保证萃取头萃取的芳香物质全部进入全二维气相色谱系统；

(4)测试：通过gc×gc-tofms检测方法，对已解吸的梨果芳香物质进行测试分析；

(5)定性：各组分芳香质谱经nist/wiley检索及匹配谱库资料比对进行定性，仅报道匹配度大于800的化合物；

(6)定量：以2-壬酮内标溶液为内标，采用内标法对样品中的各芳香物质进行定量分析。

优选的，本发明步骤(1)中梨块大小为0.5cm×0.5cm。

优选的，本发明步骤(2)中取样量为6g，添加5μl10mg/l的2-壬酮内标溶液，静置时间为10±2min。

优选的，本发明步骤(2)中固相微萃取条件为：将样品置于色谱科固相微萃取装置上，通过恒温磁力加热搅拌器使加入模块的温度维持在40±2℃，恒温萃取40±5min。

优选的，本发明步骤(3)中解吸条件为：将固相微萃取头插入气相色谱端进样口，于270℃下解析2min。

优选的，本发明步骤(4)中影响芳香物质的灵敏度及分辨率的仪器参数由色谱条件和质谱条件两部分组成。

所述色谱条件为：色谱柱1为rxi-5ms，色谱柱2为rxi-17silms，载气为高纯氦气，进样模式：分流，分流比10：1，调制周期为3s。

质谱条件为ei离子源，采集电压1450v。

进一步的，其色谱条件为：一维炉箱的起始温度40℃，保持2min；以5℃/min的速度升至200℃，以20℃/min的速度，升至280℃并保持2min。二维炉箱的温度始终比一维炉箱高5℃，调制器的温度始终比二维炉箱高15℃。

进一步的，其质谱条件为：离子源温度250℃。

本发明步骤(5)中匹配谱库包括mainlib、replib、ff2017。

本发明步骤(6)定量公式为组分含量(ng/g)＝[各组分的峰面积/内标的峰面积×内标浓度(mg/l)×内标溶液体积(μl)]/样品量(g)。

本发明采用全二维气相色谱-飞行时间质谱法，通过优化程序升温、分流比、调制周期、采集电压等确定最佳采集参数，以此实现梨果中挥发性芳香物质的全谱扫描，并通过2-壬酮进行内标定量分析。本方法克服了传统单柱气相色谱灵敏度较低、峰容量有限、检测成分较少等问题。gc×gc-tofms的独特二维分离模式，十分适合于复杂体系的分析，一维色谱峰通过调制解调器在二维色谱柱上进行纵向分离，实现叠加色谱峰的准确识别，大大提高了检测分析的灵敏度分离度。本发明通过样品重复进样方式，确保实验的准确性。本方法采用梨果香气物质浓郁的果实优化条件，能适应多种梨果分析。

本发明的有益效果：

(1)gc×gc-tofms的独特二维分析方法，可实现叠加色谱峰的准确识别，大大提高挥发性芳香物质检测的灵敏度、辨识度、准确度，可实现梨果芳香信息的全谱扫描；

(2)通过梨果芳香物质全谱信息，可全面了解梨果挥发性芳香物质信息，挖掘梨果特有特征香气；

(3)梨果挥发性芳香物质的全谱信息，为产地溯源提供强大数据支持，对于以产地溯源为基础实现危害因子溯源有重要意义。

本发明方法简单、快速、准确、分离度高、准确度与辨识度高，可实现梨果挥发性芳香物质的全谱扫描，可用于基于梨果香气信息的产地溯源研究。

附图说明

图1不同升温速率下梨芳香成分二维色谱图；

图2不同调制周期下南果梨二维轮廓图；

图3不同调制周期下2-甲基萘与1-甲基萘的二维轮廓图；

图4不同电压下南果梨芳香成分二维轮廓图；

图5南果梨芳香成分二维轮廓图；

图6南果梨芳香成分3d图；

图7乙酸丁酯二维色谱图；

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。

1仪器与试剂

supelco固相微萃取装置(美国色谱科公司)，包括50/30μmdvb/car/pdms萃取头；gc×gc-tofms：agilent7890b气相色谱仪(美国安捷伦公司)，配备pegasus质谱仪；corningpc-420d磁力搅拌器购于美国康宁公司；sartoriusbsa224s-cw分析天平购于德国赛多利斯公司。

2-壬酮(99.0％)购于德国dr.ehrensorfer公司；甲醇(hplc级)购于美国fisher公司。

2仪器条件

gc×gc-tofms方法如下：

色谱柱1为rxi-5ms(30m×250μm×0.25μm)，色谱柱2为rxi-17silms(2m×250μm×0.25μm)，载气为高纯氦气，流速为1.4ml/min，进样模式：分流，分流比10：1。前进样口和传输线温度分别为270℃和280℃。一维炉箱的起始温度40℃，保持2min；以5℃/min的速度升至200℃，以20℃/min的速度，升至280℃并保持2min。二维炉箱的温度始终比一维炉箱高5℃，调制器的温度始终比二维炉箱高15℃。调制周期为3s(冷喷时间为0.9s，热喷时间为0.6s)，冷却剂为液氮，热调制气体为压缩空气，冷调制气体为氮气。

质谱为ei离子源，电子能量70v，采集电压1450v，采集速率为100(spectra/s)，扫描范围为35-550amu，离子源温度250℃。

3标准溶液配制

称取0.1g(精确至0.0001g)2-壬酮于容量瓶中，用甲醇定容至10ml，配制成10000mg/l的标准储备液；用甲醇将2-壬酮稀释至10mg/l备用；所有标准溶液于-18℃冰箱中贮存。

4采集参数优化

4.1程序升温速率对芳香物质分离确证的影响

程序升温初始温度为40℃，选择程序升温的升温速率5℃/min和8℃/min进行试验，比较两种升温速率对梨果中挥发性芳香物质的分离确证的影响。

4.2分流比对芳香物质分离确证的影响

分流比的改变显著影响进样量，设置2：1、5：1、10：1、20：1四个梯度进行试验，分析分析图谱中香气物质的响应值、二维轮廓图的形状及高响应香气物质的峰分裂现象的影响。

4.3调制周期对芳香物质分离确证的影响

调制周期分别设置为2s，3s，4s，考察二维轮廓图的响应、香气种类总数及辨识度的变化。

4.4采集电压对芳香物质分离确证的影响

电压对于目标物谱峰的响应有显著影响，设置1400v，1450v，1500v进行优化，考察香气物质响应过载情况及峰型的变化。

5挥发性芳香成分萃取与检测

按照四分法将每个梨果划分为4部分，随机选择梨果的一个部分竖切0.5cm厚的梨片，去掉核果，每次取5个梨果上果肉，带皮切成0.5cm×0.5cm梨块，混合均匀，取6g装入supelco固相微萃取装置的萃取瓶中，加入5μl10mg/l2-壬酮于梨块上，盖紧塞子静置10min，在40℃条件下萃取40min，然后将固相微萃取头插入气相色谱端进样口，于270℃下解析2min，在以优化条件下进行检测。每个品种梨果重复试验3次。

6定性定量分析

样品经过气相色谱进行分离后，各组分质谱经nist/wiley检索及资料分析进行定性，仅报道匹配度大于800的化合物；以2-壬酮作为内标进行定量计算，其添加量为5μl10mg/l。计算公式参照前人研究方法，组分含量(ng/g)＝[各组分的峰面积/内标的峰面积×内标浓度(mg/l)×5μl]/样品量(g)。

7结果与讨论

7.1全谱扫描分析条件优化

7.1.1程序升温条件的确定

梨果中芳香成分复杂多样，首先选择初始温度设为40℃和8℃/min的升温速率，此时梨果中香气成分出峰时间比较集中，如图1所示，当升温速率降为5℃/min时，色谱峰分离较好，较为分散，由于gc×gc采用二维分离，不易设置较为复杂程序升温阶数，所以最终选择升温速率降为5℃/min。

7.1.2分流比优化

分流比的改变显著影响进样量，设置2：1、5：1、10：1、20：1四个梯度进行试验，分析分析图谱中芳香物质的响应值、二维轮廓图的形状及高响应香气物质的峰分裂现象，最终选择分流比10：1为最优分流比。

7.1.3调制周期优化

调制周期变小，峰数量增加，峰型变为比较规整的纺锤形，峰分离度越高，准确度越高，二维谱峰辨识度越高。由此设置调制周期分别为2s，3s，4s，观察二维色谱峰的变化，发现当调制周期为3s时，化合物峰形为标准的纺锤形，如图2。但调制周期越小，峰易于出现裂缝，如图3所示，2-甲基萘色谱峰被分裂为两部分，对定量结果产生很大影响，1-甲基萘也在整个图谱的最底端，所以为了保证所有化合物的峰形及定量结果的准确性，确定为调制周期为3s。

7.1.4采集电压值优化

电压对于目标物谱峰的响应有显著影响，电压越高，峰响应越强，由此根据梨果芳香测试预实验设置不同电压(1400v，1450v，1500v)进行优化。如图4，随着电压增高，目标物响应值不断增加，但电压值越高，目标物仪器响应容易过载，造成峰型变差，且同一化合物在不同保留时间及二维时间轴出现多个匹配峰，同一化合物需要合峰数量增加。由此根据实验结果确定电压值为1450v。

7.2南果梨中挥发性香气物质的全谱扫描分析

南果梨二维轮廓图及3d图，见图5和图6。经统计，其共检出130种芳香成分，详见表1，酯类66种，烯烃类10种，醛类7种，醇类9种，酮类5种，烷烃类23种，其他类10种。酯类总含量最高为529.602ng/g(68.75％)，其次为烯烃类为143.541ng/g(18.6％)，醇类总含量为6.35ng/g(9.24％)，醛类总含量为25.77ng/g(3.35％)，总计占总数的99％以上。南果梨中的主要香气成分为α-法尼烯(132.33ng/g,17.18％)、乙酸乙酯(80.14ng/g,10.40％)、丁酸甲酯(58.68ng/g,7.62％)、辛酸乙酯(43.03ng/g,5.59％)、乙醇(36.81ng/g,4.78％)、辛酸甲酯(30.55ng/g，3.97％)、2-己烯-1-醇乙酸酯(30.31ng/g,3.93％)、乙酸丁酯(27.82ng/g,3.61％)、丙酸乙酯(22.55ng/g,2.93％)、2-甲基-丁酸乙酯(21.73ng/g，2.82％)、乙酸庚酯(19.98ng/g,2.59％)、乙酸辛酯(18.95ng/g,2.46％)、乙醛(18.29ng/g，2.37％)、乙酸丙酯(16.80ng/g,2.18％)、乙酸甲酯(13.36ng/g,1.73％)、乙酸戊酯(12.91ng/g,1.68％)、丁酸乙酯(12.01ng/g,1.56％)、2-丁烯酸乙酯(11.15ng/g,1.45％)、(z)-2-己烯酸乙酯(10.65ng/g,1.38％)，总计占香气总量的67％。

表1南果梨中主要挥发性芳香物质

7.3gcxgc/tofms全谱扫描的独特优势

gcxgc/tofms具有独特的二维分离模式，以南果梨中乙酸丁酯为例，在二维图中1、2、3是乙酸丁酯的三个切片，响应最高的第2个切片定为基峰b，见图7，也就是说在二维时间轴中通过三个切片对乙酸丁酯确认了3次，质谱定性信息加上第一维保留时间、第二维保留时间，组成了正交的3维定性信息，保证乙酸丁酯的定性质量，使其在复杂组份中具有高分辨率。

同时在此模式下，gcxgc/tofms具有高灵敏度，以内标2-壬酮的添加量即可看出，使用全二维色谱分析时，其添加量仅为使用gc/ms仪器时的1/200，即使在分流比为10：1条件下，其响应值也高达10⁷，且可得到清晰二维轮廓图。

由此可见，gcxgc/tofms所具有的高分辨率及高灵敏度可以使得复杂样品组分的分离得到大大改善，质谱定性质量提高，可鉴定痕量组分种数增加。

与gc/ms相比，以南果梨为例，gcxgc-tofms鉴定出匹配度大于800的组分有133种，而gc/ms共检出香气物质79种，远小于gcxgc/tofms的测试数据，见表2。gc×gc/tofms分析香气数据中酯类物质、烷烃类、醛类、醇类种数均多于gc/ms数据，多出的香气物质种数分别为32种、13种、4种、4种，其他各类物质种数相差不大。

gc/ms中检出的酯类物质及烷烃类物质绝大多数都出现在gc×gc/tofms的测试数据中；两种方法中烯烃类物质的种数相差不大，种类差异较大，但是主要烯烃类物质同为α-法尼烯；醛类物质、醇类物质、酮类的种类也同样差异较大，全二维色谱检出乙醛、乙醇及丙酮，并且相对含量最高，而gc/ms中未检出这三种物质。

gc/ms中未检出，而gc×gc-tofms中检出的主要酯类物质为：2-己烯-1-醇乙酸酯(30.30ng/g)、乙酸丁酯(27.82ng/g)、乙酸辛酯(18.95ng/g)、乙酸丙酯(16.80ng/g)、乙酸甲酯(13.36ng/g)、2-甲基丁基乙酸酯(7.86ng/g)、(e)-3-己烯-1-醇乙酸酯(4.90ng/g)、乙酸异丁酯(4.41ng/g)、戊酸甲酯(4.33ng/g)、丙酸甲酯(2.72ng/g)、2-丁烯酸甲酯(2.68ng/g)、(e)-2-己烯酸甲酯(1.44ng/g)、乙酸-3-甲基-3-丁烯-1-醇酯(1.28ng/g)。

由此可见，gc×gc/tofms独特的二维分离模式使其具有高分辨率及高灵敏度，可以实现梨果中挥发性芳香物质的全谱扫描分析，详尽丰富的挥发性芳香物质信息为梨果产地溯源提供可靠的数据来源。

表2不同检测方法下南果梨中芳香物质种类变化

实施例1：

翠冠梨中挥发性芳香物质分析检测

1、样品萃取

按照四分法将每个梨果划分为4部分，随机选择梨果的一个部分竖切0.5cm厚的梨片，去掉核果，每次取5个梨果上果肉，带皮切成0.5cm×0.5cm梨块，混合均匀，取6g装入supelco固相微萃取装置的萃取瓶中，加入5μl10mg/l2-壬酮于梨块上，盖紧塞子静置10min，在40℃条件下萃取40min，每个品种梨果重复试验3次。

2、测试

将固相微萃取头插入气相色谱端进样口，于270℃下解析2min，在以优化条件下进行检测。

3结果与分析

从表3可看出，翠冠中共检测出香气成分108种，其中酯类物质47种、醛类12种、醇类5种、酮类3种、芳烃类19种、烯烃类7种、烷类8种、其他7种。进一步分析，翠冠各香气类别占香气成分总量的比例汇总如下，酯类(61％)、醛类(9％)、醇类(8％)、酮类(0.5％)、芳烃类(20.4％)、烯烃类(0.5％)、烷类(0.1％)、醚类(0.2％)、其他(0.3％)。具体来说，从香气成分的数量和含量比较，翠冠的香气成分以酯类为主，且酯类香气阈值较低，具有果香味，是翠冠香气的主要贡献成分。醛类在砂梨中一般所占比例较大，在砂梨翠冠的香气成分中，含量超过1％的就有乙醛(1.6％)、正己醛(4.4％)、2-已烯醛(2.6％)赋予了翠冠青草香味。翠冠香气种类较多，但是香气阈值高的芳烃、烯烃等数量较多、含量较大，人类感官品评到的香味较少。

表3翠冠梨果中主要挥发性芳香物质