一种测定中药口服液中指标性成分的方法与流程

本发明涉及一种化学物质的检测方法，特别是涉及一种采用液相色谱-电喷雾电离-离子迁移谱联用方法测定中药口服液中7种指标性成分。

背景技术：

中药是我国传统医学的重要组成部分，是防治疾病的重要工具。据不完全统计，目前全球有130多个国家和地区销售中药，世界上近四分之一的人口使用中药。中药制剂是以中医药理论为指导，以中药为原料，根据处方将其制成某种剂型供临床直接使用，以达到最大限度地发挥药物疗效的目的。中药活性成分是保证临床疗效的关键，其质量控制尤为重要。建立中药制剂指标成分的分析检测方法可为中药制剂质量控制提供保障，同时也是中药现代化、国际化的关键。

离子迁移谱是一种利用大气压下电离形成的气相离子在电场中迁移速率的差异来对化学物质进行分离和表征的分析技术，已被广泛应用于毒品检测、公共安全、食品安全、环境监测等相关领域。离子迁移谱的基本原理是待测样品在电离反应区进行电离，产生的离子在电场力驱动下，通过周期性开启的离子门进入漂移区，与逆向的中性漂移气体分子不断发生碰撞，使得具有不同迁移率的离子得到分离并依次到达检测电极。在离子迁移谱测量中，首先要生成气相离子然后才能进行产物离子的分离和检测。离子迁移谱现有的离子化方式包括放射性离子化、电晕放电离子化、光致离子化、火焰离子化、电喷雾离子化等。其中，电喷雾电离源的出现，使得离子迁移谱可以直接对液体样品进行分析。电喷雾电离已经成为采用离子迁移谱测定生物分子和进行环境样品分析的重要方法。

尽管离子迁移谱具有简单便携、成本低廉、快速灵敏等优点，但分离能力有限，在样品基质较为复杂的情况下，可能存在无法满足多组分同时分离需求、离子化过程中不同物质间产生电离竞争抑制等问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便的测定中药口服液中指标性成分的方法。

将离子迁移谱与液相色谱通过电喷雾接口联用，离子迁移谱作为液相色谱的检测器，测量色谱分离柱流出物得到的离子迁移谱图，从而基于离子化前色谱疏水性差异和离子化后离子迁移率不同的同时实现色谱的二维分离，为复杂化合物的准确鉴定提供更为丰富的化学信息，增强离子迁移谱的分析价值。同时，离子迁移谱是在常压下对气态离子进行分析而非质谱所需的高真空条件，液相色谱与离子迁移谱联用的便利之处在于二者之间的接口装置简单。

一种测定中药口服液中指标性成分的方法，包括如下步骤：

样品溶液经液相色谱分离后导入可调节式分流器，流出液分为两路：一路与离子迁移谱仪连接，在喷雾电压作用下发生电喷雾离子化，形成的离子进入离子迁移谱仪的迁移管内进行分离后最终到达法拉第杯检测器检测得到相应测试图谱；另一路流出液进入三重四极杆质谱仪，在多反应监测模式下采集待测物的信号，对离子迁移谱仪的检测结果作进一步确证。

本发明所述的测定中药口服液中指标性成分的方法，其中，采用液相色谱-电喷雾-离子迁移谱联用实验装置，所述装置包括离子迁移谱仪、可调节式分流器、超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪，其中，所述可调式分流器的进液口端与所述超高效液相色谱仪的出液口相连，所述可调式分流器的出液口端分别与所述离子迁移谱仪和所述三重四极杆质谱仪的进液口端相连。

本发明所述的测定中药口服液中指标性成分的方法，其中，所述指标性成分为丹参素、绿原酸、甘草酸、芦丁、黄芩苷、天麻素和葛根素，共7种。

本发明所述的测定中药口服液中指标性成分的方法，其中，设置所述可调节式分流器的分流比为50:1，所述可调式分流器的低流速出液口端与所述离子迁移谱仪的进液口端相连，所述可调式分流器的高流速出液口端与所述三重四极杆质谱仪的进液口端相连。

本发明所述的测定中药口服液中指标性成分的方法，其中，所述离子迁移谱仪的进样流速约为1μl/min，精确数值为0.98μl/min。

本发明所述的测定中药口服液中指标性成分的方法，其中，液相色谱分离条件为：

色谱柱：acquityuplcbehc18，50mm×1mm,1.7μm；流速：50μl/min；流动相a为0.5％甲酸水溶液，b为乙腈；梯度洗脱程序：0～3min，5％b～10％b；3～10min，10％b～80％b；10～12min，80％b；12～12.1min，80％b～5％b；12.1～15min，5％b；柱温：25℃；样品室温度：20℃；进样量：5μl。

本发明所述的测定中药口服液中指标性成分的方法，其中，所述离子迁移谱仪的分析条件为：

电喷雾电压：2400v；离子化模式：负离子模式；迁移管电压：8000v；迁移管温度：190℃；气体预加热温度：190℃；迁移谱宽：26ms；bradbury-nielsen离子门脉冲宽度：110μs；bradbury-nielsen离子门电压：37v；漂移气流速：1.4l/min；排气泵抽速：1.0l/min。

本发明所述的测定中药口服液中指标性成分的方法，其中，质谱分析条件如下：

电喷雾离子源负离子模式；毛细管电压：2.8kv；射频透镜电压：0.3kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：800l/h；锥孔气流量：50l/h；光电倍增器电压：650v；碰撞气：氩气；碰撞气压：0.32pa。

本发明所述的测定中药口服液中指标性成分的方法，其中，7种待测物的质谱分析参数如下：

表17种待测物的质谱参数

*具有更高响应的离子。

本发明测定中药口服液中指标性成分的方法与现有技术不同之处在于：本发明测定中药口服液中指标性成分的方法采用液相色谱-电喷雾电离-离子迁移谱联用技术，建立了中药口服液中丹参素、甘草酸、天麻素、绿原酸、葛根素、黄芩苷、芦丁等7种代表性指标成分的分析方法，并优化了液相色谱、喷雾电压、迁移管和气体预加热温度、漂移气流速等分析参数，同时建立了指标性成分的液相色谱-串联质谱确证方法，为中药制剂质量控制和活性成分检测提供了科学有效的技术手段。7种中药指标性成分的检出限为2～10μg/ml，定量限为5～25μg/ml。

下面结合附图对本发明的测定中药口服液中指标性成分的方法作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中液相色谱-电喷雾-离子迁移谱联用实验装置及流程示意图；

图2为本发明中7种待测物的离子迁移谱图；

图3为本发明中7种待测物的选择离子监测色谱图；

图4为本发明中不同喷雾电压下7种待测物的信号响应(n＝3)；

图5为本发明中不同迁移管及气体预加热温度下7种待测物的信号响应(n＝3)；

图6为本发明中不同漂移气流速下7种待测物的信号响应(n＝3)；

图7为本发明中7种待测物的二维分离分析。

其中，图2、图3和图7中，数字和物质的对应关系为：

谱峰确认:1.丹参素；2.甘草酸；3.天麻素；4.绿原酸5.葛根素；6.黄芩苷；7.芦丁。

附图中出现的英文的中文对照表

具体实施方式

1、实验部分

1.1仪器与试剂

ga2100型便携式离子迁移谱仪(美国excellims公司)：配有电喷雾离子源、离子栅门控制器、空气过滤装置(含硫酸钙和分子筛)、高分辨率离子迁移分析器、法拉第杯检测器、vision仪器控制与数据处理系统，使用前用色氨酸和柠檬酸分别在正、负离子模式下校正仪器；quicksplit600-po10-04型可调节式分流器(美国analyticalscientificinstruments公司)；acquity超高效液相色谱仪、xevotq-ms三重四极杆质谱仪、masslynx数据处理系统(美国waters公司)；milli-qintegral5型超纯水器(美国merckmillipore公司)。丹参素(cas22681-72-7，纯度98％)和绿原酸(cas327-97-9，纯度98％)购自北京中科质检生物技术有限公司；甘草酸(cas1405-86-3，纯度98％)、芦丁(cas153-18-4，纯度98％)、黄芩苷(cas21967-41-9，纯度98％)和天麻素(cas62499-27-8，纯度98％)购自百灵威科技有限公司；葛根素(cas3681-99-0，纯度98％)购自中国食品药品检定研究院。7种标准物质用甲醇配制成1g/l标准储备液，使用时根据需要用甲醇稀释成混合标准工作液；甲醇(色谱纯)购自美国fisher公司；色氨酸和柠檬酸购自美国sigma-aldrich公司，以甲醇配成10mg/l校正液进行仪器校正。

1.2实验方法

实验室自行搭建的液相色谱-电喷雾-离子迁移谱联用实验装置示意图如图1所示。样品溶液经液相色谱分离后导入可调节式分流器(设置分流比为50:1)，流出液分为两路：一路与离子迁移谱仪连接(约1μl/min，精确数值为0.98μl/min)，在喷雾电压作用下发生电喷雾离子化，形成的离子进入离子迁移谱的迁移管内进行分离后，最终到达法拉第杯检测器检测得到相应测试图谱；另一路流出液进入三重四极杆质谱仪，在多反应监测模式下采集7种待测物的信号，可对离子迁移谱检测结果作进一步确证。

1.3液相色谱分离条件

色谱柱：acquityuplcbehc18(50mm×1mm,1.7μm)；流速：50μl/min；流动相a为0.5％甲酸水溶液，b为乙腈。梯度洗脱程序：0～3min，5％b～10％b；3～10min，10％b～80％b；10～12min，80％b；12～12.1min，80％b～5％b；12.1～15min，5％b；柱温：25℃；样品室温度：20℃；进样量：5μl。

1.4离子迁移谱分析条件

电喷雾电压：2400v；离子化模式：负离子模式；迁移管电压：8000v；迁移管温度：190℃；气体预加热温度：190℃；迁移谱宽：26ms；bradbury-nielsen离子门脉冲宽度：110μs；bradbury-nielsen离子门电压：37v；漂移气流速：1.4l/min；排气泵抽速：1.0l/min。7种待测物的分子式、相对分子质量和迁移时间见表2，离子迁移谱图见图2。

表27种待测物的分子式、相对分子质量、离子化方式和迁移时间

1.5质谱分析条件

电喷雾离子源负离子模式；毛细管电压：2.8kv；射频透镜电压：0.3kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：800l/h；锥孔气流量：50l/h；光电倍增器电压：650v；碰撞气：氩气；碰撞气压：0.32pa。7种待测物的质谱分析参数见表1，多反应监测色谱图见图3。

表17种待测物的质谱参数

*具有更高响应的离子。

2结果与分析

2.1液相色谱分离条件的优化

离子迁移谱在与液相色谱联用时，电喷雾电离源是最为常用的接口方式，通过高压电场产生带电液滴和待测物离子，而后进入离子迁移谱检测。由于本实验中离子迁移谱配备的电喷雾接口没有内置的辅助气和加热模块，因此能够耐受的流速范围较低。综合考虑适用流速、分离效率、色谱峰形以及与电喷雾接口兼容性等因素，本研究选用了微径柱acquityuplcbehc18(50mm×1mm,1.7μm)。经比较，以乙腈作为流动相的有机溶剂可获得较好的色谱性能和信号响应。鉴于7种待测物均为酸性化合物，需要在流动相水相中加入一定比例的挥发性酸以获得理想的色谱峰形和保留行为。

2.2离子迁移谱喷雾电压的优化

喷雾电压是决定目标成分信号响应强度及离子化效果的重要参数。样品经液相色谱分离后，柱后流出液经分流器分流后在喷雾电压作用下，产生离子进入离子迁移谱得到响应信号。本实验考察喷雾电压从1600～2600v条件下，7种中药指标成分的响应值，它们的最佳喷雾电压略有差异，综合考虑7种待测化合物各自的最佳喷雾电压值及离子化效果，确定本方法的喷雾电压为2400v。实验结果如图4所示。

2.3离子迁移谱迁移管和气体预热温度的优化

本研究考察了离子迁移谱迁移管和气体预加热温度对目标化合物信号强度的影响情况。为避免由于热交换或其他因素而导致的离子迁移时间重现性差、响应值不稳定等问题，实验在优化上述两项参数时将其设为相同值。温度过低时，环境中水分子会对离子信号造成干扰；温度过高会造成系统不稳定，导致离子损失。分别考察了不同温度(160、170、180、190、200℃)对7种中药指标成分响应值的影响，结果如图5所示。综合考虑各目标化合物离子的信号强度、信号漂移时间的稳定性以及峰形表现，选择190℃为迁移管和气体预加热温度。

2.4离子迁移谱漂移气流速的优化

漂移气的种类和流速对离子分辨率和响应强度存在一定影响。空气凭借稳定性强、成本低廉等优势被选用为漂移气。本研究考察了不同漂移气流速(1.2～2.2l/min)对7种化合物分离效果和响应强度的影响，实验结果见图6。当漂移气流速过低时，7种化合物分辨率较差；而流速太高时，响应信号强度降低，原因可能是目标物浓度被稀释，电场力的作用被抵消，离子难以到达检测器造成。经考察，漂移气的最佳流速为1.4l/min。

2.5液相色谱-电喷雾-离子迁移谱联用分析

液相色谱和离子迁移谱是分别基于待测物的不同性质，根据不同机理进行分离，由此组成的二维分离体系在分离能力上可相互补充。在分别对液相色谱和离子迁移谱条件优化的基础上，将液相色谱通过电喷雾离子源与离子迁移谱联用，开发丹参素、甘草酸、天麻素、绿原酸、葛根素、黄芩苷、芦丁等7种指标成分的二维分离分析方法，得到的二维等高线图见图7。7种中药指标性成分的检出限、定量限、线性范围、线性方程和相关系数见表3。

由于常规液相色谱柱的工作流速通常在ml/min级别，而电喷雾离子迁移谱能够耐受的流速范围较低，通常在μl/min级别，二者之间并不匹配。过高的进样流速会造成电喷雾的脱溶剂困难，从而增大离子迁移谱的噪音，并降低离子的响应信号。本发明采用了适宜流速为50μl/min左右的内径为1mm的微径色谱柱，通过柱后分流得到低流速以适应电喷雾离子迁移谱的兼容要求。但由于常规液相色谱仪存在相对较大的柱外体积，造成液相色谱分离维度存在一定程度的峰形扩展。在后续实验研究中，将采用纳升/纳升级液相色谱仪进行色谱分离以达到更好的分离效果。

表37种待测物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限

*y:峰面积；x:质量浓度,μg/ml。

2.6液相色谱-三重四极杆质谱分析确证

本研究还开发了丹参素、甘草酸、天麻素、绿原酸、葛根素、黄芩苷、芦丁等7种指标性成分的液相色谱-三重四极杆质谱确证方法。每种目标化合物分别选择一个前体离子和对应的两个产物离子作为监测离子对，7种待测成分的质谱分析参数见表2。如果样品中目标化合物的离子相对丰度与浓度相当的标准溶液的相对丰度一致，且偏差不超过表2中对应的允许偏差，则判断样品中含有相应的目标化合物。

2.7样品测定

应用本方法对儿感退热宁口服液、清开灵口服液、小儿清肺化痰口服液、小儿七星茶口服液、双黄连口服液等5件中药口服液实际样品进行了检测分析。经测定，上述中药口服液样品中指标性成分甘草酸的含量为730.69和841.82μg/ml，黄芩苷的含量分别为4.22、6.51和13.08mg/ml，均达到了《中国人民共和国药典》2015版中的含量要求。

3结论

本研究采用液相色谱-电喷雾电离-离子迁移谱联用技术，建立了中药口服液中丹参素、甘草酸、天麻素、绿原酸、葛根素、黄芩苷、芦丁等7种指标性成分的分离分析方法，结合了离子迁移谱高分辨、快速分离以及与液相色谱分离的正交性的特点，可实现目标化合物同时基于疏水性和离子迁移率差异的二维分离，为复杂样品体系的全面解析提供更为丰富的综合信息。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。