一种A型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种a型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒及其应用。

背景技术：

口蹄疫是一种由口蹄疫病毒(fmdv)所致的急性的、热性的、高度接触性传染病，主要侵害偶蹄兽，经常在羊、牛、猪等动物中传播。发病时易感动物的唇和蹄部出现水疱，同时伴有发烧、食欲不振等症状，患病动物体重和产奶量大幅下降。口蹄疫病毒易通过空气传播，传染性强，流行快速，易感动物在抵抗力较弱的情况下也会导致死亡，给养殖户造成巨大的经济损失，严重阻碍了养殖业的发展。

目前对于a型口蹄疫病毒抗体的诊断方法和疫苗免疫效果的评价方法只能在实验室完成，不适合基层检测，需要建立更为灵敏、快捷和简便的可视化的检测方法。

技术实现要素：

有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种a型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒及其应用。

本发明提供了一种a型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，包括包被酶标板、洗涤液、样品稀释液、底物显色液、酶标二抗、终止液，所述包被酶标板以a型口蹄疫病毒作为包被抗原，所述包被抗原的包被浓度为1.5～3μg/ml。

优选的，所述包被酶标板由封闭液封闭包被抗原制得，所述封闭液为包括40～60g/l脱脂奶粉的pbst缓冲液，所述封闭的时间为15～25min；所述包被酶标板置于2～6℃保存。

优选的，所述洗涤液为包括0.04％～0.06％体积浓度的吐温-20的磷酸盐缓冲液，ph值为7～7.4。

优选的，所述样品稀释液为包括40～60g/l脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液。

优选的，所述底物显色液为tmb溶液。

优选的，所述酶标二抗的稀释倍数为1：(15000～25000)。

优选的，所述终止液为0.8～1.2％体积浓度的sds溶液。

本发明提供了上述可视化快速检测试剂盒在对a型口蹄疫病毒抗体进行接种疫苗后的检测中的应用。

优选的，所述应用包括如下步骤：

(1)取待检测的离体样品，用所述样品稀释液对离体样品进行稀释，所述稀释的倍率为1：(30～50)，得到稀释样品；

(2)将所述稀释样品加入到包被酶标板中，20～22℃孵育30～40min，弃反应液，洗涤液洗板，干燥；

(3)将所述酶标二抗加入到步骤(2)所述干燥后的酶标板中，20～22℃孵育30～40min，弃反应液，洗涤液洗板，干燥；

(4)将所述底物显色液加入到步骤(3)所述干燥后的酶标板中，20～22℃显色反应10～20min，判断检测结果。

有益效果：本发明提供了一种a型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，包括包被酶标板、洗涤液、样品稀释液、底物显色液、酶标二抗、终止液，所述包被酶标板以a型口蹄疫病毒作为包被抗原，所述包被抗原的包被浓度为1.5～3μg/ml。本发明提供的试剂盒能用于检测a型口蹄疫病毒抗体，通过颜色变化来判定结果，具有高效、特异性强、重复性好的优点。本发明提供的试剂盒操作简便、快速、成本低廉，可在室温下可视化检测，适合于在临床应用中进行推广，为a型口蹄疫病毒抗体的快速检测提供可靠的技术手段。

附图说明

图1为本发明实施例2所述特异性检测实验结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种a型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，包括包被酶标板、洗涤液、样品稀释液、底物显色液、酶标二抗、终止液，所述包被酶标板以a型口蹄疫病毒作为包被抗原，所述包被抗原的包被浓度为1.5～3μg/ml。

本发明提供的试剂盒包括包被酶标板。在本发明中，所述包被酶标板以a型口蹄疫病毒为包被抗原，在检测时可以将待测样品中的a型口蹄疫病毒抗体特异性捕获。在本发明中，所述包被抗原为a型口蹄疫病毒，包被浓度为1.5～3μg/ml。本发明对所述a型口蹄疫病毒的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。

本发明使用封闭液将包被抗原封闭到包被酶标板中。在本发明中，所述封闭液优选为含有脱脂奶粉的pbst缓冲液。所述脱脂奶粉在pbst缓冲液中的浓度优选为40～60g/l，更优选为50g/l。所述封闭的时间优选为15～25min，更优选为20min。本发明对所述pbst缓冲液和所述脱脂奶粉的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的实施例中，所述pbst、脱脂奶粉均购买自sigma。将所述包被抗原封闭到酶标板后，本发明优选对包被酶标板保存。所述保存的温度优选为2～6℃，更优选为4℃；所述保存优选在密封袋中进行。

本发明提供的试剂盒包括酶标二抗。在本发明中，所述酶标二抗能和酶标板上捕获的a型口蹄疫病毒抗体发生特异性的结合，并且能和显色液发生显色反应。在本发明中，所述酶标二抗购于sigma。本发明优选在检测时对酶标二抗进行稀释。在本发明中，所述酶标二抗的稀释倍数优选为1：(15000～25000)，更优选为1：20000。

本发明提供的试剂盒还包括洗涤液、样品稀释液、底物显色液和终止液。在本发明中，所述洗涤液优选为含有吐温-20的磷酸盐缓冲液。所述吐温-20在磷酸盐缓冲液中的体积浓度优选为0.04％～0.06％，更优选为0.05％。所述磷酸盐缓冲液的ph值优选为7～7.4，更优选为7.2。在本发明中，所述样品稀释液优选为含有脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液。所述脱脂奶粉在磷酸盐缓冲液中的浓度优选为40～60g/l，更优选为50g/l。在本发明中，所述底物显色液优选为tmb溶液(3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液)。在本发明中，所述终止液优选为sds或者硫酸溶液。所述sds的体积百分数优选为0.8％～1.2％，更优选为1％。所述硫酸溶液的浓度优选为1～3mol/l，更优选为2mol/l。本发明对所述磷酸盐缓冲液、吐温-20、tmb溶液、sds溶液的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的实施例中，所述磷酸盐缓冲液、吐温-20、tmb溶液和sds均购买自sigma。

本发明提供的试剂盒还优选包括标准阳性血清和标准阴性血清。所述标准阳性血清为a型口蹄疫病毒阳性猪血清；所述标准阴性血清为健康猪血清；所述标准阳性血清和标准阴性血清可在检测过程中用于对照试验的待检测样品。在本发明的实施例中，所述a型口蹄疫病毒阳性猪血清和健康猪血清均由兰州兽医研究所提供。

本发明提供的试剂盒能用于检测a型口蹄疫病毒抗体，通过颜色变化来判定结果，具有高效、特异性强、重复性好的优点。

本发明对所述试剂盒的制备方法没有特别限定。各组分采用本发明所述原料配制得到相应浓度的溶液即得。

本发明还提供了上述可视化快速检测试剂盒在对a型口蹄疫病毒抗体进行接种疫苗后的检测中的应用。所述应用优选包括如下步骤：

(1)取待检测的离体样品，用所述样品稀释液对离体样品进行稀释，所述稀释的倍率为1：(30～50)，得到稀释样品；

(2)将所述稀释样品加入到包被酶标板中，20～22℃孵育30～40min，弃反应液，洗涤液洗板，干燥；

(3)将所述酶标二抗加入到步骤(2)所述干燥后的酶标板中，20～22℃孵育30～40min，弃反应液，洗涤液洗板，干燥；

(4)将所述底物显色液加入到步骤(3)所述干燥后的酶标板中，20～22℃显色反应10～20min，判断检测结果。

本发明第(1)步先取待检测的离体样品，用所述样品稀释液对离体样品进行稀释。在本发明中，所述稀释的倍率优选为1：(30～50)，更优选为1：40.稀释后得到稀释样品。

本发明第(2)步将所述稀释样品加入到包被酶标板中孵育。在本发明中，所述孵育的温度优选为20～22℃。所述孵育的时间优选为30～40min，更优选为35min。孵育后弃反应液，洗涤液洗板，所述洗板的次数优选为2～3次。洗板后干燥，所述干燥的方式优选为吸水纸拍干。

本发明第(3)步将所述酶标二抗加入到步骤(2)所述干燥后的酶标板中进一步孵育。在本发明中，所述进一步孵育的温度优选为20-22℃，更优选为22℃。所述进一步孵育的时间优选为30～40min，更优选为40min。进一步孵育后弃反应液，洗涤液洗板，所述洗板的次数优选为2～3次。洗板后干燥，所述干燥的方式优选为吸水纸拍干。

本发明第(4)步将所述底物显色液加入到步骤(3)所述干燥后的酶标板中显色。在本发明中，所述显色的温度优选为20-22℃，更优选为22℃。所述显色反应的时间优选为10～20min，更优选为20min。显色反应结束后判断检测结果。在本发明中，所述检测结果的判断优选通过加入sds终止液，肉眼观察进行判断：蓝色为阳性，无色为阴性。

本发明提供的试剂盒操作简便、快速、成本低廉，可在室温下可视化检测，适合于在临床应用中进行推广，为a型口蹄疫病毒抗体的快速检测提供可靠的技术手段。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)包被酶标板的制作及样品稀释液、洗涤液、终止液的配制

配制0.05mol/l碳酸盐缓冲液作为包被液：na3co31.59g，nahco32.93g，加蒸馏水定容至1000ml，ph为9.6。使用包被液稀释a型口蹄疫病毒，稀释度为2.0μg/ml。将稀释后的a型口蹄疫病毒抗原加入到酶标板中，每孔加100μl体积。然后用50g/l脱脂奶粉pbst封闭20min，得到包被酶标板。装入密封袋，4℃保存备用。

配制含有50g/l脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，作为样品稀释液；

配制含0.05％tween-20的0.01mol/lph为7.2的磷酸盐缓冲液作为洗涤液：nacl8.5g，nah2po4·2h2o0.356g，nah2po4·12h2o2.772g，将其混合后，再用蒸馏水溶解并定容至1000ml，再向其中加入0.5ml吐温-20；

配制1％的sds或者2mol/l的硫酸溶液作为终止液。

2、样品检测

(1)取待检测血清样品，使用样品稀释液，以1:40倍稀释血清；

(2)取出已包被并封闭好的elisa板条(包被酶标板)，每孔中加入100μl的稀释血清；同时设置添加标准阳性血清和标准阴性血清(健康猪血清)的对照组，于室温(20-22℃)孵育1h，弃去孔内液体，每孔用洗涤液洗3次并拍打，弃尽孔内液体；

(3)取酶标二抗(购买sigma)，使用样品稀释液，以1:20000倍稀释酶标二抗。然后将稀释后的酶标二抗加入到酶标板中，每孔中加入100μl，于室温(20-22℃)孵育40min，弃去反应孔中液体，每孔用洗涤液洗3次并拍打，弃尽孔内液体；

(4)向酶标板每孔中加入100μl底物tmb显色液，室温下(20-22℃)避光显色反应20min，加入100μlsds终止液；肉眼观察颜色，蓝色为阳性，无色为阴性。

实施例2

试剂盒的特异性试验：按实施例1的方法分别检测已知的猪瘟病毒、乙脑病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、蓝耳病病毒、流感病毒和a型口蹄疫病毒阳性血清样品，阴性为无色，阳性为蓝色。

检测结果如图1所示，图1从左到右依次为猪瘟病毒、a型口蹄疫病毒、乙脑病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、蓝耳病病毒和流感病毒。图1结果表明：本发明实施例1提供的试剂盒对猪瘟病毒、乙脑病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、蓝耳病病毒以及流感病毒的阳性血清样品检测结果呈无色，对a型口蹄疫病毒阳性血清样品的检测结果呈蓝色。说明本发明提供的试剂盒用于检测a型口蹄疫病毒抗体，具有高效、灵敏特异性和重复性均良好的优点。且操作简便、快速、成本低廉，可以在室温下可视化检测，适合于在临床应用中进行推广，为a型口蹄疫病毒抗体的快速检测提供可靠的技术手段。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。