本发明涉及生物玻片制备技术领域，特别是一种土壤线虫的玻片制备方法。
背景技术：
土壤中线虫的数量丰富、种类多样。土壤线虫广泛分布于各类土壤中，不同的土壤深度线虫的数量有所不同，其中0cm-20cm土层内分布的土壤线虫最多。线虫作为常见土传病害的头号杀手之一，对农业危害极大。身长仅有0.3mm-6mm的它近乎“隐形”，却与50％以上的土壤病害有关，穿孔线虫、根结线虫、胞囊线虫、茎线虫……多种多样的线虫让相关领域农科产业减产5％-20％，局部减产达60％甚至绝收。
为研究土壤线虫，经常需要对线虫样本进行检测，目前普遍采用的是在解剖镜下直接解剖鉴定，其放大倍数有限，检测无法达到足够的精度；或者采用制作临时玻片进行检测，但是临时玻片的保存时间短，每次检测前都要制作，工作量和成本高，且临时玻片密封性差，消毒灭菌效果差。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种土壤线虫的玻片制备方法，该方法制备的土壤线虫的玻片密封性好，消毒灭菌效果好，土壤线虫的样品保存更长时间，便于进行鉴定。
本发明采用的技术方案是：
一种土壤线虫的玻片制备方法，包括如下步骤：
a、将载玻片和盖玻片分开放入稀盐酸中浸泡后取出用清水冲洗干净，再放入酒精中浸泡后用镊子取出并擦拭干净备用；
b、将已经分离的线虫样品置于解剖镜下，在解剖镜下用解剖针拨开土壤和杂质，然后用移液枪将土壤线虫转移到盖玻片上，转移两次到一张载玻片上，并加福尔马林；
c、在转移了土壤线虫和福尔马林的载玻片上盖上盖玻片，立即用中性树胶将盖玻片的边缘封住，中性树胶封不易过厚，同时也要将盖玻片的边缘封严，不能使空气进入，并在载玻片上相应位置写上编号；
d、将制好的玻片的无盖玻片面放在酒精灯上烘烤，然后在解剖镜下观察玻片上的线虫存活状况，如仍有存活的线虫，则再次烘烤，直到观察至无存活的线虫；接着用纸巾擦干净载玻片上酒精灯烧后留下的污迹；
e、将玻片平放在紫外灭菌灯下进行灭菌；
f、将消毒灭菌完成的玻片放置在托盘内，并放置在干燥无灰尘处，待中性树胶完全干后，放入玻片盒内，并保持盖玻片朝上，且玻片平衡放置储存。
优选地，在步骤a中：
玻片和盖玻片在稀盐酸中浸泡的时间为30min；
玻片和盖玻片在酒精中浸泡的时间大于10min。
优选地，在步骤b中：
移液枪在使用前将刻度调节到6.5μl；
加福尔马林的量为6.5μl。
优选地，步骤b还包括如下步骤：
如果样品中杂质过多或过于浑浊，可以将线虫先转移到盛有蒸馏水的培养皿中，用解剖针拨开杂质，再用移液枪将线虫转移到盖玻片上。
优选地，步骤c还包括如下步骤：
如果温度比较高，蒸发比较严重，盖玻片周围会出现空隙，如空隙比较小，则直接用树胶封边缘，树胶会渗入填充空隙；如空隙比较大，则用移液枪加蒸馏水补足空隙，按照一共19.5μl液体，使用18mm×18mm的盖玻片，则不会出现盖玻片溢水，如果有水溢出，应等其自然风干，并调节移液枪的刻度，使其不再溢水。
优选地，在步骤d中：
将制好的玻片的无盖玻片面放在酒精灯上烘烤2～3次，每次约1s，间隔5s，如在解剖镜下观察玻片上仍有存活的线虫，则再次烘烤1次后观察直到无存活的线虫。
优选地，在步骤e中：
紫外灭菌灯的照射时间为24h。
本发明的有益效果是：利用土壤线虫以及微生物不耐高温的特征，用高温将土壤线虫和微生物杀死且不破坏线虫的内部结构，并且加入福尔马林后用树胶将其密封，再用紫外灭菌灯灭菌，使其内部达到无菌的状态，其密封性好，消毒灭菌效果好，土壤线虫的样品保存更长时间，便于进行鉴定。
具体实施方式
下面结合实施例本发明进行详细说明。
实施例1
一种土壤线虫的玻片制备方法，包括如下步骤：
a、将载玻片和盖玻片分开放入稀盐酸中浸泡后取出用清水冲洗干净，再放入酒精中浸泡后用镊子取出并擦拭干净备用；
b、将已经分离的线虫样品置于解剖镜下，在解剖镜下用解剖针拨开土壤和杂质，然后用移液枪将土壤线虫转移到盖玻片上，转移两次到一张载玻片上，并加福尔马林；
c、在转移了土壤线虫和福尔马林的载玻片上盖上盖玻片，立即用中性树胶将盖玻片的边缘封住，中性树胶封不易过厚，同时也要将盖玻片的边缘封严，不能使空气进入，并在载玻片上相应位置写上编号；
d、将制好的玻片的无盖玻片面放在酒精灯上烘烤，然后在解剖镜下观察玻片上的线虫存活状况，如仍有存活的线虫，则再次烘烤，直到观察至无存活的线虫；接着用纸巾擦干净载玻片上酒精灯烧后留下的污迹；
e、将玻片平放在紫外灭菌灯下进行灭菌；
f、将消毒灭菌完成的玻片放置在托盘内，并放置在干燥无灰尘处，待中性树胶完全干后，放入玻片盒内，并保持盖玻片朝上，且玻片平衡放置储存。
实施例2
本实施例在实施例1的基础上，具体地，在步骤a中：
玻片和盖玻片在稀盐酸中浸泡的时间为30min；
玻片和盖玻片在酒精中浸泡的时间大于10min。
实施例3
本实施例在实施例1的基础上，具体地，在步骤b中：
移液枪在使用前将刻度调节到6.5μl；
加福尔马林的量为6.5μl。
实施例4
本实施例在实施例3的基础上，具体地，步骤b还包括如下步骤：
如果样品中杂质过多或过于浑浊，可以将线虫先转移到盛有蒸馏水的培养皿中，用解剖针拨开杂质，再用移液枪将线虫转移到盖玻片上。
实施例5
本实施例在实施例1的基础上，具体地，步骤c还包括如下步骤：
如果温度比较高，蒸发比较严重，盖玻片周围会出现空隙，如空隙比较小，则直接用树胶封边缘，树胶会渗入填充空隙；如空隙比较大，则用移液枪加蒸馏水补足空隙，按照一共19.5μl液体，使用18mm×18mm的盖玻片，则不会出现盖玻片溢水，如果有水溢出，应等其自然风干，并调节移液枪的刻度，使其不再溢水。
实施例6
本实施例在实施例1的基础上，具体地，在步骤d中：
将制好的玻片的无盖玻片面放在酒精灯上烘烤2次，每次约1s，间隔5s，如在解剖镜下观察玻片上仍有存活的线虫，则再次烘烤1次后观察直到无存活的线虫。
实施例7
本实施例在实施例1的基础上，具体地，在步骤e中：
紫外灭菌灯的照射时间为24h。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。