一种电化学放大检测汞离子的方法与流程

本发明属于电化学以及生物化学分析检测领域，具体涉及一种电化学放大检测汞离子的方法。

背景技术：

随着生活水平的不断提高以及环保意识的不断增强，人们对金属污染也越来越重视，尤其是生物毒性显著的金属污染。金属离子由于未经处理或未按要求处理就排入河流中，它们不能被生物降解，而却能在食物链的生物放大作用或土壤栽培下，在动物植物内富集，最后进入人体。金属离子在人体的肝、肾等器官组织中蓄积，造成各器官组织的损伤及慢性中毒。因此，保护人类免受金属污染以及食物中金属残留的伤害，寻找简单方便高效的检测金属残留的方法具有重要意义。

通常的金属分析方法包含紫外可分光光度法、原子吸收法、原子荧光法、电感耦合等离子体法、电感耦合等离子质谱法等方法。然而这些方法耗时耗力，需要昂贵的仪器以及熟练的操作人员，最主要的是，选择性不强及灵敏度不高。

鉴于此，克服上述现有技术所存在的缺陷，提供一种简单的、选择性强、灵敏度高的金属离子检测方法，是本领域亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明提供一种电化学放大检测汞离子的方法，其有效解决了现有的金属分析方法测试成本高、选择性不强、灵敏度不高的问题。

一种电化学放大检测汞离子的方法，包括如下步骤：

a、将玻碳电极置于氯金酸水溶液中，利用电化学沉积法在玻碳电极表面沉积一层金纳米层；

b、将步骤a得到的电极置于巯基修饰的核酸适体和巯基修饰的锚核酸混合液中，得到金修饰的玻碳电极，放置一段时间后取出，然后将电极置于巯基己醇水溶液中，再放置一段时间后取出；

c、将步骤b得到的金修饰的玻碳电极置于含有汞离子的样品溶液中，放置一段时间后取出；

d、将步骤c取出后的电极置于脱氧核苷酸、末端转移酶和信号核酸的混合缓冲溶液中，放置一段时间后取出；

e、利用方波伏安法检测步骤d取出后电极上的电流，由此根据标准曲线计算出样品溶液中汞离子的含量。

本发明优选的实施方案中，步骤a中，氯金酸溶液的浓度为1.0wt％，用量为2ml，电化学沉积的电位为-0.2v，沉积时间60s。

本发明优选的实施方案中，步骤b中巯基修饰的核酸适体浓度为0.2μm；巯基修饰的锚核酸浓度为0.5～5.0μm，巯基己醇水溶液的浓度为1mm。

本发明优选的实施方案中，步骤b中，电极置于巯基修饰的核酸适体和巯基修饰的锚核酸混合液中的时间为1h，温度为20～30℃，电极置于巯基己醇水溶液的时间为1h。

本发明优选的实施方案中，步骤d中，信号核酸所使用的信号物质为亚甲基蓝或二茂铁，脱氧核苷酸、末端转移酶和信号核酸的浓度分别为50μm，2u/μl和1μm。

本发明优选的实施方案中，步骤d中电极置于混合缓冲溶液中的时间为0.5～2h，温度为37℃。

本发明中，所使用玻碳电极直径3mm，购买于天津艾达恒晟科技发展有限公司。

本发明中，巯基修饰的核酸适体是指核酸的5’端被巯基修饰的核酸。

本发明中，巯基修饰的锚核酸是指核酸的3’端被巯基修饰的核酸。

本发明中，信号核酸是指核酸的5’端被亚甲基蓝修饰，3’端被氨基修饰的核酸。

本发明中，加入巯基己醇的目的为封闭电极表面，减少与检测汞离子无关非特异性信号的干扰。

本发明的工作过程及汞离子的检测原理如下：

如图1所示，将玻碳电极置于氯金酸溶液中，通过电化学沉积法在电极表面沉积一层金纳米层，得到电极表面沉积金纳米层的玻碳电极；然后将沉积金纳米层的玻碳电极置于巯基修饰的核酸适体和巯基修饰的锚核酸混合溶液中，巯基修饰的核酸适体与巯基修饰的锚核酸与电极表面的金通过硫金键固定在电极表面，得到金修饰的玻碳电极；将金修饰的玻碳电极依次置于含有汞离子的样品溶液和由脱氧核苷酸、末端转移酶和信号核酸组成的混合缓冲溶液中，如果样品溶液中没有与巯基修饰的核酸适体匹配的汞离子，巯基修饰的核酸适体3’端在末端转移酶的作用下与混合缓冲溶液中的脱氧核苷酸结合，巯基修饰的核酸适体3’端被延长，包含亚甲基蓝或二茂铁的信号核酸在该延长部分与巯基修饰的锚核酸的协同作用下固定在电极表面，亚甲基蓝或二茂铁在外界电压作用下，亚甲基蓝或二茂铁中的电子发生移动，从而产生电信号，提高了电极表面的电化学信号；如果样品溶液中有与巯基修饰的核酸适体匹配的汞离子，巯基修饰的核酸适体与汞离子结合从而将巯基修饰的核酸适体3’端深埋于电极表面，末端转移酶无法对巯基修饰的核酸适体3’端进行识别，阻碍了巯基修饰的核酸适体3’端与脱氧核苷酸的结合，导致只有少量包含亚甲基蓝或二茂铁的信号核酸固定在电极表面，从而降低了电极表面的电化学信号。

本发明中，通过添加巯基修饰的锚核酸，大大提高了包含亚甲基蓝或二茂铁的信号核酸在电极表面的固定量，不增加巯基修饰的锚核酸，大部分巯基修饰的核酸适体3’端的延长部分远离电极表面，使得包含亚甲基蓝或二茂铁的信号核酸固定在电极表面的量大大降低，导致电极表面的电化学信号低，添加巯基修饰的锚核酸后，巯基修饰的核酸适体3’端的延长部分在巯基修饰的锚核酸的协同作用下与多个包含亚甲基蓝或二茂铁的信号核酸结合在电极表面，大大提高了亚甲基蓝或二茂铁在电极表面的固定量，电极表面的电化学信号大大提高，进而提高了本发明检测方法的灵敏性。

本发明优选的实施方案中，通过选择与待检测的汞离子相匹配的巯基修饰的核酸适体，大大提高了待检测汞离子的选择性。

本发明优选的实施方案中，当待检测汞离子中存在与巯基修饰的核酸适体相匹配的离子时，汞离子与巯基修饰的核酸适体相结合，并将巯基修饰的核酸适体3’端深埋在电极表面，阻碍了末端转移酶对巯基修饰的核酸适体3’端的识别，进而影响信号核酸与巯基修饰的核酸适体的结合，导致没有亚甲基蓝或二茂铁结合在电极表面，无电化学信号检出。

本发明中的标准工作曲线为用本发明的检测方法测得已知汞离子浓度的电流，绘制标准工作曲线，当测得未知汞离子浓度时，利用本发明方法测得未知汞离子浓度所产生的电流，然后与标准工作曲线中的电流比较，进而计算出未知汞离子浓度的含量。

本发明中，末端转移酶及其缓冲溶液为商品化产品，购买于thermoscientific公司。

本发明中，所有核酸和脱氧核苷酸购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，其中巯基修饰的核酸适体的具体序列为：5’-sh-ttctctcttcgacgttgtgtgtt-3’，sh代表5’端被巯基修饰；锚核酸具体序列为5’-cacagctct-sh-3’，sh代表3’端被巯基修饰；信号核酸的具体序列为5’-mb-gagctgtggttttttttt-nh2-3’，mb代表5’端被亚甲基蓝修饰，nh2代表3’端被氨基修饰；所使用的脱氧核苷酸为脱氧三磷酸腺苷二钠。

本发明有益效果：

(1)本发明首次提出将巯基修饰的核酸适体与末端转移酶结合用于检测汞离子的含量，末端转移酶的参与提高了汞离子含量测定的灵敏性。

(2)本发明在提出将巯基修饰的核酸适体与末端转移酶结合的基础上，通过添加巯基修饰的锚核酸，大大提高了包含亚甲基蓝或二茂铁的信号核酸在电极表面的固定量，不增加巯基修饰的锚核酸，大部分巯基修饰的核酸适体3’端的延长部分远离电极表面，使得包含亚甲基蓝或二茂铁的信号核酸固定在电极表面的固定量大大降低，导致电极表面的电化学信号低，添加巯基修饰的锚核酸后，巯基修饰的核酸适体3’端的延长部分在巯基修饰的锚核酸的协同作用下与多个包含亚甲基蓝或二茂铁的信号核酸结合在电极表面，大大提高了亚甲基蓝或二茂铁在电极表面的固定量，电极表面的电化学信号大大提高和放大，进而极大提高了本发明检测方法的灵敏性。

(3)本发明通过选择与待检测的汞离子相匹配的巯基修饰的核酸适体，大大提高了待检测汞离子的选择性。

(4)本发明检测汞离子的方法操作方便，无需昂贵的仪器，选择性强、灵敏度高。

附图说明

图1为本发明的检测原理示意图；

图2为利用本发明方法检测实施例1中汞离子及其他金属离子的电流变化图；

图3为利用本发明方法检测实施例1中不同浓度汞离子的电流图；

图4为利用本发明方法检测实施例2中有无巯基修饰的锚核酸对灵敏度(电流变化)的影响图；

图中附图标记含义如下：

1-核酸适体；2-锚核酸；3-汞离子；4-脱氧核苷酸；5-信号核酸；6-亚甲基蓝或二茂铁。

具体实施方式

下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。

实施例1：

一种电化学放大检测汞离子的方法，包括如下步骤：

a、将打磨清洗好的玻碳电极置于1.0wt％氯金酸溶液中，利用电化学沉积法在玻碳电极表面沉积一层金纳米层，控制电位为-0.2v，沉积时间为60s，清洗电极；

b、将步骤a制得的电极置于10μl含有0.2μm的巯基修饰的汞离子核酸适体与3μm的巯基修饰的锚核酸混合液中，25℃放置1h，清洗电极；然后将电极置于1mm的巯基己醇水溶液中0.5h，清洗电极，得到金修饰的玻碳电极；

c、将步骤b得到的金修饰的玻碳电极置于10μl含有不同浓度汞离子的溶液中，25℃下放置1小时，清洗电极；

d、将步骤c取出后的电极置于含有50μm脱氧三磷酸腺苷，2u/μl末端转移酶及1μm信号核酸的10μl混合缓冲溶液中，放置45min，温度为37℃，清洗电极；

e、利用方波伏安法检测步骤d取出后电极上的电流，由此根据标准曲线计算出样品溶液中汞离子的含量，设置电位为-0.35至-0.15v。

本实施例中巯基修饰的汞离子核酸适体是指与汞离子相匹配的核酸适体，其可用于汞离子浓度的测定，其具体序列为5’-sh-ttctctcttcgacgttgtgtgtt-3’，sh代表5’端被巯基修饰。

本实施例中还采用与检测汞离子相同的方法检测其他金属离子电流变化，具体结果如图2所示。所使用的汞离子浓度为0.2μm，其他离子浓度为2μm。从图2中可以看出，汞离子的电流变化明显，这是由于巯基修饰的汞离子核酸适体与汞离子结合，导致巯基修饰的核酸适体3’端深埋于电极表面，末端转移酶无法对巯基修饰的核酸适体3’端进行识别，阻碍了巯基修饰的核酸适体3’端与脱氧核苷酸的结合，导致包含亚甲基蓝或二茂铁的信号核酸不能固定在电极表面，从而降低了电极表面的电化学信号，电流出现比较大的变化，从图2中可以看出本实施例中的巯基修饰的核酸适体对汞离子有很强的选择性和敏感性。

利用本发明的方法对不同浓度的汞离子检测得到的电化学谱图如图3所示，从图中可以看出，随着汞离子浓度的增大，检测出的电流逐渐减小，这是由于巯基修饰的核酸适体与汞离子结合将巯基修饰的核酸适体3’端深埋于电极表面，末端转移酶无法对巯基修饰的核酸适体3’端进行识别，阻碍了巯基修饰的核酸适体3’端与脱氧核苷酸的结合，导致包含亚甲基蓝或二茂铁的信号核酸不能固定在电极表面，从而降低了电极表面的电化学信号，即电流信号减弱。本实施例中汞离子的检测范围为2pm至20nm。

实施例2：

有无锚核酸对方法灵敏度的影响，具体步骤如下：

a、同实施例1中的步骤a、b、c相同，区别在于未增加巯基修饰的锚核酸。

b、将步骤a得到的电极置于含有50μm脱氧三磷酸腺苷、2u/μl末端转移酶及1μm信号核酸的10μl混合缓冲溶液中，放置45min，温度为37℃，清洗电极；

c、同实施例1中的步骤e相同。

本实施例的结果如图4所示，在相同浓度的汞离子存在的条件下，有巯基修饰的锚核酸存在时检测出的电流信号远大于无巯基修饰的锚核酸存在时检测出的电流信号，这是由于添加巯基修饰的锚核酸后，巯基修饰的核酸适体3’端的延长部分在巯基修饰的锚核酸的协同作用下与多个包含亚甲基蓝或二茂铁的信号核酸结合在电极表面，大大提高了亚甲基蓝或二茂铁在电极表面的固定量，电极表面的电化学信号得到放大，极大提高了检测灵敏性进而和溶液中汞离子的检测限。

实施例3：

利用本发明的方法检测烟草样品中汞离子的含量，具体步骤如下：

1、烟草样品的提取步骤如下：

a、在利用吸烟机捕集了烟气粒相物的剑桥滤片中加入20ml的人工体液在37℃下超声提取40min；

b、将步骤a超声后的溶液过滤得提取液，然后用人工体液洗涤剑桥滤片，重复4次，超声过滤后合并提取液；

c、在步骤b所得提取液中加入5ml浓度为5wt％的硝酸，加热蒸发到5ml左右并准确定容至5ml。

2、烟草样品中汞离子含量的检测，包括如下步骤：

a、将打磨清洗好的玻碳电极置于1wt％氯金酸溶液中，利用电化学沉积法在玻碳电极表面沉积一层金纳米层，控制电位为-0.2v，沉积时间为60s，清洗电极；

b、将步骤a制得的电极置于10μl含有0.2μm的汞离子巯基修饰的核酸适体与3μm的巯基修饰的锚核酸混合液中，25℃下放置1h，清洗电极；然后将电极置于1mm的巯基己醇水溶液中0.5h，清洗电极，得到金修饰的玻碳电极；

c、将步骤b得到的金修饰的玻碳电极置于10μl含有不同浓度汞离子的溶液中，25℃下放置1小时，清洗电极；

d、将步骤c得到的电极置于含有50μm脱氧三磷酸腺苷，2u/μl末端转移酶及1μm信号核酸的10μl混合缓冲溶液中，放置45min，温度为37℃，清洗电极；

e、利用方波伏安法检测步骤d取出后电极上的电流变化，由此根据标准曲线计算出样品溶液中汞离子的含量，设置电位为-0.35至-0.15v。

本实施例中的人工体液为包含na⁺、cl-、hco3^2-、葡萄糖、k⁺、ca²⁺、mg²⁺、so4^2-、hpo4^2-、氨基酸、核苷酸、蛋白质、多糖等无机离子和有机物，浓度和实际体液相当，ph值在7.3-7.5之间。

本实施例所测得烟草样品中汞离子的含量为未检出。