一步法荧光检测体系及凝血酶检测方法与流程

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一步法荧光检测体系及凝血酶检测方法。

背景技术：

蛋白标志物的灵敏、便捷、可靠及低成本的检测在现场检测(poct)和早期诊断中的越来越重要。现在常见的检测方法如酶联免疫吸附测定法(elisa)，电化学测定法，光学法等。这些方法包含多步分离和洗脱步骤，操作复杂，需要精密仪器，具有相对较低的灵敏度等特。

静电纺丝纳米纤膜具有直径可控、多孔结构、高的比表面积以及易于修饰等优点，认为是一种理想的传感界面材料。基于静电纺丝纳米纤维膜的光化学传感器被报道用来检测蛋白标志物，如前列腺特异性抗原(psa)，甲胎蛋白(afp)，心肌肌钙蛋白i(ctni)，c-反应蛋白(crp)以及凝血酶。

凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，在代谢过程中，能够将可溶性纤维蛋白原转化为不可溶性纤维蛋白链。xiang课题组报道了一种电化学适配体传感器，凝血酶的检出限低至5.6pm，该传感器结合了邻近结合诱导链置换反应和离子依赖dnazyme循环信号放大反应(j.m.yang,b.t.dou,r.yuan,y.xiang.proximitybindingandmetalion-dependentdnazymecyclicamplification-integratedaptasensorforlabel-freeandsensitiveelectrochemicaldetectionofthrombin.analyticalchemistry,2016,88,8218–8223)。gu课题组报道了一种基于适配体功能化静电纺丝的三明治型凝血酶传感器，检测限为10pm，比96孔板的检出限低了2500倍(s.j.lee,r.tatavarty,m.b.gu.electrospunpolystyrene–poly(styrene-co-maleicanhydride)nanofiberasanewaptasensorplatform.biosensors&bioelectronics,2012,38,302–307)。liu课题组报道了一种基于静电纺丝的荧光凝血酶传感器，检出限为42pm(h.m.wang,w.tang,h.j.wei,y.zhao,s.c.hu,y.guan,w.pan,b.xia,n.li,f.liu.integratingdye-intercalateddnadendrimerswithelectrospunnanofibers:anewfluorescentsensingplatformfornucleicacids,proteins,andcells.journalofmaterialschemistryb,2015,3,3541–3547)。这些方法具有较高的灵敏度，但涉及多个反应和洗脱步骤，使得整个实验费时费力。

xing课题题组基于两种不同波长荧光基团标记的适配体探针和荧光相互关联光谱(fccs)，使得凝血酶的检出限为0.8nm(x.m.zhou,y.h.tang,d.xing.one-stephomogeneousproteindetectionbasedonaptamerprobeandfluorescencecross-correlationspectroscopy.analyticalchemistry,2011,83,2906–2912)。这些一步法减少了实验步骤，节省了时间。然而，这些检测方法需要标记探针并制备纳米颗粒，灵敏度也较低。

目前并没有一种操作简单、灵敏度高的一步法检测凝血酶的方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一步法荧光检测体系及凝血酶检测方法，操作简单，灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一步法荧光检测凝血酶的检测体系，包括b-h2功能化纳米纤维膜，支撑dna，输出dna，竞争dna，缓冲溶液，tht，h1序列和凝血酶；所述支撑dna的序列如seqidno.2～7所示，所述输出dna的序列如seqidno.8所示，所述竞争dna的序列如seqidno.9～14任一项所示，所述h1序列如seqidno.15所示；所述缓冲溶液中包括以下浓度的成分：10～50mmtris，50～200mmnacl，5～15mmmgcl2和10～30mmkcl，ph值为7.5。

优选的，所述b-h2功能化纳米纤维膜的制备方法包括以下步骤：(1)将聚苯乙烯和四丁基溴化铵混合后溶解于n，n-二甲基甲酰胺中，得ps/tbab/dmf溶液；所述聚苯乙烯的质量为所述ps/tbab/dmf溶液质量的15～25％；所述四丁基溴化铵在所述ps/tbab/dmf溶液的质量体积比为0.1～0.5％。

(2)将所述ps/tbab/dmf溶液进行静电纺丝，烘干后得ps纳米纤维膜；所述静电纺丝时的电压为10～20kv，进样速度为2～8μl/min，接收距离为7～15cm，收集时间为1.5～3h；

(3)利用介质阻挡放电产生的氩气等离子体处理所述ps纳米纤维膜，得处理后的ps纳米纤维膜；所述处理的电压为40～50v，电流为1.2～2.5a，放电处理时间为1～3min；

(4)将所述处理后的ps纳米纤维膜浸泡于亲和素溶液中0.5～1.3h，取出后清洗，然后再与b-h2溶液反应0.6～1.5h，清洗后得b-h2功能化的纳米纤维膜；所述b-h2为经生物素标记的核苷酸序列，所述核苷酸序列如seqidno.1所示。

优选的，步骤(1)所述四丁基溴化铵在所述ps/tbab/dmf溶液的质量体积比为0.1～0.5％。

优选的，步骤(1)所述溶解时伴随搅拌，所述搅拌的时间为20～28h。

优选的，步骤(2)所述烘干的温度为75～85℃，烘干的时间为3.2～4.5h。

优选的，步骤(2)得所述ps纳米纤维膜后，还包括对所述ps纳米纤维膜进行修剪。

优选的，步骤(4)所述亲和素溶液的浓度为1.2～2.5μm。

优选的，步骤(4)所述b-h2溶液的浓度为600～1000nm。

本发明还提供了一步法荧光检测凝血酶的方法，包括以下步骤：将支撑dna、输出dna和缓冲溶液混合后于95℃温度下退火，得so双链；将b-h2功能化纳米纤维膜、所述so双链、竞争dna、h1序列、tht和待测样品混合后，在避光条件下反应后，测量膜的荧光。

优选的，所述荧光的激发波长为450nm，收集470nm到700nm之间的发射光谱。

本发明提供了一步法荧光检测凝血酶的检测体系，包括b-h2功能化纳米纤维膜，支撑dna，输出dna，竞争dna，缓冲溶液，tht，h1序列和凝血酶。本发明所述检测体系，整合了邻近诱导dna链置换(pidsd)、催化发夹自组装放大(cha)和tht结合反应三个过程。通过所述b-h2功能化纳米纤维膜的表界面行为，促进表界面上的动力学和热力学反应速率。在本发明实施例中，以凝血酶作为检测对象，检测限可达1.0pm，线性范围宽至50pm～5nm，并且具有特异性高、稳定性好的优势。

附图说明

图1为本发明所述凝血酶检测原理图；

图2为本发明实施例中的pidsd过程结果图和荧光变化图；

图3为本发明实施例3中不同浓度凝血酶检测性能实验结果图；

图4为本发明实施例4中检测体系检测特异性和稳定性结果图。

具体实施方式

本发明提供了一步法荧光检测凝血酶的检测体系，包括b-h2功能化纳米纤维膜，支撑dna，输出dna，竞争dna，缓冲溶液，tht，h1序列和凝血酶；所述支撑dna的序列如seqidno.2～7所示，所述输出dna的序列如seqidno.8所示，所述竞争dna的序列如seqidno.9～14任一项所示，所述h1序列如seqidno.15所示；所述缓冲溶液中包括以下浓度的成分：10～50mmtris，50～200mmnacl，5～15mmmgcl2和10～30mmkcl，ph值为7.5。在本发明的所述pidsd过程中，所述的竞争dna(c)和支撑dna(s)中可以包含一段t碱基序列作为支撑dna(s)和输出dna(o)链的连接链，以便减少位阻，促进链置换效率。

本发明所述检测体系中能够应用到的序列如表1所示：

表1序列名称及序列

在本发明所述检测体系中，所述b-h2功能化纳米纤维膜的制备方法包括以下步骤：(1)将聚苯乙烯和四丁基溴化铵混合后溶解于n，n-二甲基甲酰胺中，得ps/tbab/dmf溶液；所述聚苯乙烯和四丁基溴化铵的混合物质量为所述ps/tbab/dmf溶液质量的15～25％；

(2)将所述ps/tbab/dmf溶液进行静电纺丝，烘干后得ps纳米纤维膜；所述静电纺丝时的电压为10～20kv，进样速度为2～8μl/min，接收距离为7～15cm，收集时间为1.5～3h；

(3)利用介质阻挡放电产生的氩气等离子体处理所述ps纳米纤维膜，得处理后的ps纳米纤维膜；所述处理的电压为40～50v，电流为1.2～2.5a，放电处理时间为1～3min；

(4)将所述处理后的ps纳米纤维膜浸泡于亲和素溶液中0.5～1.3h，取出后清洗，然后再与b-h2溶液反应0.6～1.5h，清洗后得b-h2功能化的纳米纤维膜；所述b-h2为经生物素标记的核苷酸序列，所述核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明在制备所述b-h2功能化纳米纤维膜时，将聚苯乙烯和四丁基溴化铵混合后溶解于n，n-二甲基甲酰胺中，得ps/tbab/dmf溶液；所述聚苯乙烯的质量为所述ps/tbab/dmf溶液质量的15～25％；所述四丁基溴化铵在所述ps/tbab/dmf溶液的质量体积比为0.1～0.5％。。本发明以所述n，n-二甲基甲酰胺(dmf)为溶剂，将聚苯乙烯(ps)和四丁基溴化铵(tbab)溶解，最终形成ps/tbab/dmf溶液，所述ps/tbab/dmf溶液中，ps浓度优选为16～24％，更优选为18～22％，最优选为20％。在本发明所述ps/tbab/dmf溶液中，所述tbab的质量体积比优选为0.1～0.5％，更优选为0.2～0.4％，最优选为0.3％。本发明在制备所述ps/tbab/dmf溶液时，优选伴随搅拌，所述搅拌的时间优选为20～28h，更优选为22～25h，最优选为24h。本发明所述搅拌的速率优选为30～40r/s。本发明对所述搅拌的温度并没有特殊限定，在室温下进行即可，优选为18～25℃。

得ps/tbab/dmf溶液后，本发明将所述ps/tbab/dmf溶液进行静电纺丝，烘干后得ps纳米纤维膜；所述静电纺丝时的电压为10～20kv，进样速度为2～8μl/min，接收距离为7～15cm，收集时间为1.5～3h。本发明所述静电纺丝的电压优选为12～18kv，更优选为14～16kv，最优选为15kv。本发明所述静电纺丝时的进样速度优选为3～7μl/min，更优选为4～6μl/min，最优选为5μl/min。本发明优选将经过静电纺丝后的纤维膜接收到铝箔上，所述接收距离优选为8～14cm，更优选为9～12cm，最优选为10cm。本发明所述收集时间优选为1.6～2.5h，更优选为1.8～2.2h，最优选为2h。本发明在进行所述静电纺丝时，环境湿度优选为环境湿度优选为45～55％，更优选为49％。本发明将接收在铝箔上的纳米纤维膜优选进行烘干处理，所述烘干的温度优选为75～85℃，更优选为78～82℃，最优选为80℃。本发明所述烘干的时间优选为3.2～4.5h，更优选为3.6～4.2h，最优选为4h。本发明得所述ps纳米纤维膜后，优选还包括对所述ps纳米纤维膜进行修剪，所述修剪优选为剪成直径d＝5mm的圆片。

得ps纳米纤维膜后，本发明利用介质阻挡放电产生的氩气等离子体处理所述ps纳米纤维膜，得处理后的ps纳米纤维膜；所述处理的电压为40～50v，电流为1.2～2.5a，放电处理时间为1～3min。本发明所述处理的电压优选为42～48v，更优选为44～46v，最优选为45v。本发明所述处理的电流优选为1.5～2.4a，更优选为1.8～2.2a，最优选为2a。本发明所述放电处理的时间优选为1.2～2.8min，更优选为1.6～2.5min，最优选为2min。本发明所述等离子体处理可以改善ps膜表面亲水性。

得处理后的ps纳米纤维膜后，本发明将所述处理后的ps纳米纤维膜浸泡于亲和素溶液中0.5～1.3h，取出后清洗，然后再与b-h2溶液反应0.6～1.5h，清洗后得b-h2功能化的纳米纤维膜；所述b-h2为经生物素标记的核苷酸序列，所述核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明对所述浸泡的温度并没有特殊限定，优选在室温下，更优选为18～25℃。本发明所述亲和素溶液的浓度优选为1.2～2.5μm，更优选为1.8～2.2μm，最优选为2μm。本发明所述浸泡的时间优选为0.6～1.2h，更优选为0.8～1h。本发明所述亲和素浸泡可以使亲和素固载在膜表界面。本发明中，两次所述清洗优选的均为超纯水清洗，所述清洗的次数优选为三次。本发明所述b-h2溶液的浓度优选为600～1000nm，更优选为700～900nm，最优选为800nm。本发明所述反应的温度优选为35～40℃，更优选为37℃。本发明所述反应的时间优选为0.8～1.2h，更优选为1h。本发明所述b-h2的序列优选为：biotin-ctgactaaaacccaaaacccgctagagaagtcagtgtggaaaatctctagcgggttttgggttttgggttttggg(seqidno.1)。本发明所述b-h2溶液反应可以得到b-h2功能化纳米纤维膜以及最优信背比最好。

本发明还提供了一步法荧光检测凝血酶的方法，包括以下步骤：将支撑dna、输出dna和缓冲溶液混合后于95℃温度下退火，得so双链；将b-h2功能化纳米纤维膜、所述so双链、竞争dna、h1序列、tht和待测样品混合后，在避光条件下反应后，测量膜的荧光。

本发明所述方法中，所述混合优选为将s和o加入到缓冲溶液中，所述s的的浓度优选为80～120μm，更优选为90～110μm，最优选为100μm。本发明所述o的浓度优选为80～120μm，更优选为90～110μm，最优选为100μm。本发明所述s与o的体积比优选为(1～1.5)：1，更优选为(1.1～1.3)：1，最优选为1.2:1。在本发明实施例中，将2.4μl100μms和2.0μl100μmo加入到20.0μl缓冲溶液中，在95℃中退火5min并冷却至室温，制备出终浓度为10.0μm的so双链。

本发明的so双链后，优选将b-h2功能化纳米纤维膜浸入到20nmso，20nmc，200nmh1，6μmtht和样品的混合溶液中进行反应。本发明所述反应优选在室温避光条件下进行，所述反应的时间优选为80～120min，更优选为90～110min，最优选为100min。本发明在反应结束后，优选利用缓冲溶液冲洗三次，并测量膜的荧光。在本发明中，所述荧光的激发波长优选为450nm，收集470nm到700nm之间的发射光谱，并记录492nm的荧光。激发和发射的狭缝宽度分别为10nm和10nm。

在本发明中，所述方法的检测原理如图1所示，在浸泡的过程中，凝血酶特异性的促进pidsd过程，输出dna将引发纳米纤维膜上的cha放大反应和tht结合反应。pidsd过程包含3条dna链：支撑dna(s)，输出dna(o)以及竞争dna(c)。s和c链中分别包含两种适配体(apt29在s中，apt15在c中)，同时设计一段t碱基序列作为s和c链的连接链，以便减少位阻，促进链置换效率。凝血酶和so、c中的适配体结合，拉近了c到so之间的距离。这个过程促进了so和c之间的链置换速率。随后的cha放大反应使纳米纤维膜上形成g-四链体-tht复合物，产生显著的荧光信号。总的来说，凝血酶能够在一步的特异性引发功能化的纳米纤维膜产生g-四链体-tht复合物。由此，纳米纤维膜产生显著增强的荧光强度并由此便捷、灵敏的检测凝血酶。

下面结合实施例对本发明提供的一步法荧光检测凝血酶的反应体系及检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

ps纳米纤维膜采用静电纺丝技术制备，具体操作如下：以dmf为溶剂，配制质量分数为20％的ps/tbab/dmf溶液，其中tbab为0.3％(w/v)，在室温下搅拌24h，混合均匀后进行静电纺丝。纺丝条件：电压15kv，进样速度5μl/min，接收距离10cm，收集时间2h，环境湿度～49％。将接收在铝箔上的纳米纤维膜放于烘箱中80℃处理4h，然后将纳米纤维膜剪成直径d＝5mm的圆片备用。

通过介质阻挡放电产生的氩气等离子体来处理ps纳米纤维膜，电压设为45v，电流为2.0a，放电处理时间为2min。将处理后的ps纳米纤维膜在室温下立即浸泡于100μl2.0μm亲和素溶液中1h，取出用超纯水浸泡清洗三次，然后将纳米纤维膜浸泡在100μl800nmb-h2溶液中37℃反应1h，取出用超纯水清洗三次，制备得到b-h2功能化的纳米纤维膜。在扫面电镜下对该b-h2功能化的纳米纤维膜进行观察，结果如图2-a所示，b-h2功能化的纳米纤维膜由均匀、随机分布的纳米纤维组成，直径约为350nm。

实施例2

邻近诱导dna链置换(pidsd)过程由聚丙烯酰氨凝胶电泳(page)证明

制备12％聚丙烯酰胺凝胶，然后将8μldna样品与2μl6×凝胶加样缓冲液(0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，40％(w/v)蔗糖溶液)充分混合，加入到凝胶加样孔中，进行电泳。在1×tbe缓冲液(89mmtris、89mm硼酸、2mmedta，ph＝8.3)和110v恒定电压下电泳1h。此时将凝胶用eb染色30分钟，接着用uv成像系统拍照(clinxgenosens，china)。

pidsd结果如图2b所示，其中1，2，5条带分别代表so，c，o链。在没有凝血酶存在的条件下，so和c链反应100min也不能产生输出链o(条带3)。当凝血酶存在时，在条带4的底部可以形成输出o链的条带。除此之外，在条带4的顶部还产生了一条新的迁移速度慢的s-凝血酶-c条带，同时so和c链的混合条带变浅，这也能够进一步证明输出o被置换出来。

利用功能化纳米纤维膜检测不同测试溶液，并测量纳米纤维膜的荧光强度。将b-h2功能化纳米纤维膜分别浸入到不同的测试溶液中，各测试溶液中分别包含以下成分：(a)h1，so，c，凝血酶；(b)tht，(c)h1，tht；(d)h1，so，tht；(e)h1，c，tht；(f)h1，so，c，tht；(g)h1，so，c，凝血酶，tht。所述(a)～(g)所用h1、so、c、凝血酶及tht的浓度分别为200nm，20nm，20nm，10nm和6μm。

实验结果如图2c所示，当b-h2功能化的纳米纤维被浸入到测试溶液(a)-(f)，荧光强度都非常的弱(图2ca-f)。这是由于cha放大反应和g-四链体-tht复合物都没有发生。然而，一旦b-h2功能化的纳米纤维被浸入到含有凝血酶，so，c，h1和tht的测试溶液中，荧光强度显著增强(图2cg)。相对于不包含凝血酶的测试溶液(f)，测试溶液(g)在492nm出的荧光强度增强了3.3倍。荧光强度的增强是由于测试溶液(g)形成了g-四链体-tht复合物。上述检测结果证明了基于纳米纤维传感平台的凝血酶一步荧光检测策略的可行性。

实施例3

设置h1浓度为200nm，tht浓度为6μm，反应时间100min，染色时间15min进行不同浓度凝血酶检测性能实验，根据凝血酶的浓度将测试溶液标记为：(a)0pm，(b)1.0pm，(c)10pm，(d)50pm，(e)100pm，(f)200pm，(g)500pm，(h)1nm，(i)5nm，(j)10nm，(k)20nm。

实验结果如图3-a所示，凝血酶浓度从0pm到20nm，纳米纤维在492nm的荧光强度逐渐增加。当凝血酶的浓度在0pm到20nm时，纳米纤维膜荧光强度与凝血酶浓度的对数呈现良好的线性相关，如图3-b所示，线性方程为：fl＝58.7+213.4lgc，线性相关系数r＝0.9910，根据3σ规则，可计算出检出限为1.0pm。

实施例4

通过实施例3中的实验条件，将不同浓度的凝血酶分别替换为常见蛋白质和氨基酸(100nm)，包括牛血清白蛋白(bsa)，人血清白蛋白(hsa)，葡萄糖氧化酶(god)苏氨酸(thr)，丝氨酸(ser)和丙氨酸(ala)来测试所述检测体系的特异性及稳定性，测试结果如图4所示：当检测蛋白质或氨基酸时，纳米纤维膜的荧光强度与空白样相比较，没有显著的增加。然而，当加入10nm凝血酶(tb)的时候，荧光强度显著增加。证明纳本发明所述检测体系具有很好的选择性。

同时对稳定性也进行了验证，当在51天后，膜的荧光相对于初始值仅下降了7.3％。

实施例5

为了证实检测体系在生物复杂体系中的可行性，在稀释100倍的人血清样品中加入不同浓度的凝血酶，利用所述检测体系进行检测并测试其回收率，结果如表2所示，回收率和rsd分别在98.8％～102.5％和2.3％～3.7％之间。结果表明本发明所述检测体系能够准确、精密的分析方法用于生物复杂体系中凝血酶的检测。

表2检测体系在人血清样品中的检测和回收率实验

本发明提供了一步法荧光检测体系及凝血酶检测方法，基于纳米纤维膜表界面上反应热力学和动力学的提高，所述检测体系具有1.0pm的检出限，且在50pm～5nm之间具有良好的线性关系，优异的选择性以及长期稳定性。本发明所述检测方法通过整合pidsd过程，cha放大以及tht结合反应，这种一步检测法避免了elisa要求的分离和洗脱过程，节约了时间，简化了实验步骤。这种灵敏、简便、免标记的传感平台将在poct和其他蛋白质检测领域具有潜在的运用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>四川大学

<120>一步法荧光检测体系及凝血酶检测方法

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>75

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ctgactaaaacccaaaacccgctagagaagtcagtgtggaaaatctctagcgggttttgg60

gttttgggttttggg75

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggttggtgtggttggttggctagagattt29

<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggttggtgtggttggtttttggctagagattt32

<210>4

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggttggtgtggttggttttttttggctagagattt35

<210>5

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggttggtgtggttggtttttttttttggctagagattt38

<210>6

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ggttggtgtggttggttttttttttttttggctagagattt41

<210>7

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ggttggtgtggttggtttttttttttttttttggctagagattt44

<210>8

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

aagtcagtgtggaaaatctctagccaa27

<210>9

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

atctctagccaaagtccgtggtagggcaggttggggtgact41

<210>10

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

atctctagccaatttagtccgtggtagggcaggttggggtgact44

<210>11

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

atctctagccaattttttagtccgtggtagggcaggttggggtgact47

<210>12

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

atctctagccaatttttttttagtccgtggtagggcaggttggggtgact50

<210>13

<211>53

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

atctctagccaattttttttttttagtccgtggtagggcaggttggggtgact53

<210>14

<211>56

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

atctctagccaatttttttttttttttagtccgtggtagggcaggttggggtgact56

<210>15

<211>60

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

gctagagattttccacactgacttctctagcgggttttgggttttagtcagtgtggaaaa60