本发明涉及生物检测
技术领域：
，具体涉及维生素d及其代谢物的质谱检测用校准品和质控品及其制备方法和应用。
背景技术：
：维生素d(vitamind)为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。目前认为维生素d也是一种类固醇激素，维生素d家族成员中最重要的成员是vd2(麦角钙化醇)和vd3(胆钙化醇)。维生素d均为不同的维生素d原经紫外照射后的衍生物。植物不含维生素d，但维生素d原在动、植物体内都存在。维生素d是一种脂溶性维生素，有五种化合物，对健康关系较密切的是维生素d2和维生素d3。它们有以下三点特性：它存在于部分天然食物中；人体皮下储存有从胆固醇生成的7-脱氢胆固醇，受紫外线的照射后，可转变为维生素d3。适当的日光浴足以满足人体对维生素d的需要。从化学结构上划分，维生素d是环状结构胆固醇的脂溶性衍生化合物族群的统称。其中有两种主要的结构分别是麦角钙化醇(维生素d2)和胆钙化醇(维生素d3)。两种维生素d具有同样的生理作用，维生素d2主要在植物中合成，维生素d3主要在动物组织中合成，人体可自身合成。维生素d2活性温和，更适合于孕妇、胎儿和婴幼儿补充维生素d2；而维生素d3活性强，其促进钙的吸收效果远大于维生素d2。因此也导致维生素d3的毒性强，例如其中一个副作用是导致软组织的钙化。从食物中得来的维生素d，与脂肪一起吸收。吸收的维生素d与乳糜微粒相结合，由淋巴系统运输，但也可与维生素d运输蛋白(α-球蛋白部分)相结合在血浆中运输。有些与β-脂蛋白相结合，口服维生素d与乳糜微粒结合，比从皮肤中来的与蛋白结合者易于分解。当维生素d运到肝脏中，在微粒体中经单氧酶系统作用，生成25-羟基维生素d3(25-羟胆钙化醇，骨化二醇)。进而结合到特定的蛋白质上(dbp)并通过血管系统循环，因此维生素d的代谢物在血液中表现出最高的浓度。25-羟基维生素d3复合蛋白被运送到肾经过单氧酶的羧基化生成1,25-羟基维生素d3(1,25-二羟胆钙化醇，骨化三醇)。他是维生素d的生物作用形式，现将其作为激素。其作用方式与其他固醇类激素相似。在靶组织中都有其受体。在维生素d缺乏症状的诊断中，使用25-羟基维生素d3在血液中的浓度作为临床系数被广泛认可。25-羟基维生素d2(25-羟基麦角钙化醇)和活性代谢物1,25-羟基维生素d2的反应途径和25-羟基维生素d3类似。目前研究表明25-羟基维生素d3、1,25-羟基维生素d3、25-羟基维生素d2、1,25-羟基维生素d2与疾病的相关性密切，需要进行临床的精准诊断。临床研究发现：维生素d是维持人体健康非常重要的营养素和激素原，可调节体内钙、磷代谢，同时与多种疾病的发生发展显著相关，包括肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病、高血压、自身免疫疾病等。维生素d缺乏正在世界范围内属于常见，据统计，全球有30～50％的人群存在维生素d不足的情况，国内86％的人群存在维生素d水平缺乏(低于20ng/ml)或不足(低于30ng/ml)。适量补充维生素d可降低患病风险，过量服用维生素d补充剂导致的维生素d重度可能引起高血钙和高尿钙。因此，对于机体内维生素d水平的检测非常有必要，特别是处于生长发育阶段的青少年和孕妇。青少年及时检测维生素d可预防儿童骨骼发育不良，佝偻病，骨软化症，小儿精神抑郁，自闭症等。孕期和哺乳期的维生素d检测，可以预防产科并发症和新生儿维生素d缺乏，预防产后骨质疏松和抑郁症。孕妇，青少年，老年人，骨骼发育缓慢或缺陷人群，佝偻病患者，继发性甲状旁腺机能亢进症患者，骨质疏松患者，高血钙患者均应进行维生素d代谢物的检查。国际通用的25-羟基维生素d的参考区间为：25-羟基维生素d小于20ng/ml为维生素d缺乏；20-30ng/ml为维生素d不足；30-100ng/ml为维生素d正常；大于100ng/ml为维生素d过量。由于维生素d的代谢物在体液中的浓度太低，使用免疫化学发光等其它分析技术，均无法做到精准定量。因此，现代分析技术中，维生素的质谱检测成为维生素检测的发展方向，也成为检测维生素d的代谢物的“金标准”。采用液相色谱-串联质谱技术测定维生素d的代谢物的测量过程包括使用含有内标准品的溶液对血清样本进行萃取，进行电喷雾离子化处理后，使用液相色谱-串联质谱技术系统进行分析。每种分析物对其相应的内标准品的响应程度与该分析物的浓度成正比。数据获取方式为多反应监控(mrm)模式。在此扫描模式中，每种分析物碰撞诱导后的产物在设定的时间段内被测量。数据采集与处理由系统内的软件包执行。该方法的检测范围为0.0-200ng/ml。专业术语的定义本发明所应用的专业术语及其解释如下：基质效应：指标本中除分析物以外的其它成分对分析物测定值的影响或基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。它包含四个部分的内容，即仪器、试剂、测量方法、被评价的样品(参考物质、校准品、质控品等处理过的样品)。准确性：测值与真值之间接近的程度。分析物：可定量测量的被指定分析的物质。偏倚：被评价方法的测定值与确定性方法/参考方法/指定对比方法的测定值间的差异，可用两者间的差值或百分数表示。基质：除了分析物之外的所有组成成分。处理过的样品：在本评价程序里特指被制备的样品，本专利中特指发明技术的校准品和质控品。质量控制：实验操作人员必须熟悉系统操作，能对样本进行正确处理，在确保仪器状态正常的情况下采用适当的校正品对仪器进行校准。为使实验操作人员理解正确操作的必要步骤，在进行线性评价之前，检测系统应在实验室中常规运行一段时间。液相色谱-串联质谱技术测定维生素d及其代谢物的检测原理和过程以下具体描述液相色谱-串联质谱技术测定维生素d及其代谢物的已公布的检测原理和过程。液相色谱-串联质谱法定量检测维生素及其代谢产物的基本原理是：是将含有稳定同位素内标的样本前处理溶液对血浆样本进行前处理，目的是将维生素从结合蛋白的形式游离出来，然后进行蛋白质沉淀，离心后得到上清液。此时维生素及其代谢物质均在上清液中。然后将上清液进行吹干，之后对吹干后的物质进行复溶。将复溶后的样本进入到液相色谱进行分离，利用色谱柱和流动相将样本中其它的物质与维生素及其代谢物分离。分离后的产物进入到质谱，通过建立校准品与目标分析物响应值之间的函数关系，采集质谱信号。实现对样本中目标维生素及其代谢产物的定量检测。在检测过程中，应严格遵循临床实验室质量体系的要求，先使用校准品对测定系统定值，然后测定质控品，如果质控品测定值与靶值的偏倚在控，说明测定系统正常。如果质控品测定值与靶值的偏倚超过了10％，说明该测定系统存在质量问题，需要进行纠正措施，直至质控品测定值与靶值的偏倚在控后，方可进行患者样本的检测。除了本发明中涉及的校准品和质控品以外，还需要的试验材料为已公布的样本前处理溶液和流动相；除了液相色谱-串联质谱仪器外，还需要配套移液器、离心机、水浴超声仪、96孔板氮吹仪、热封仪等配套辅助设备。检测过程：1、样本的采集(1)采血人员清洗双手并佩戴手套，消毒皮肤后，采用edta真空抗凝采血管进行采集静脉血2ml；(2)标本采集后，3000rpm离心10min分离血浆，建议标本采集6小时内离心分离血浆；(3)分离后的血浆应检测样本是否澄清，无明显肉眼可见固体，无溶血等异常现象，并登记造册；(4)将检查合格的血浆样本，置于ep管中，保存在2-8℃冰箱中，6小时内3000rpm离心10min分离血浆，24小时(5)以内递送至实验室进行检测；(6)新采集的样本在2-8℃可以保存24h，避免阳光直射，实验室不能在24h内完成检测，请将样本保存在≤-18℃环境中。2、仪器watersuplc色谱仪+ab4000qtrap质谱仪样本或其它型号液相质谱串联的仪器。3、校准品、质控品和样本的前处理校准品的前处理：精密吸取0.18ml校准品溶液，分别置5ml样品瓶中，再加入前处理溶液2ml，涡旋震荡20s，4℃3148×g离心10min，吸取上清液0.8ml置进样管中，室温下氮气吹干。质控品的前处理：精密吸取0.18ml校准品溶液，分别置5ml样品瓶中，再加入前处理溶液2ml，涡旋震荡20s，4℃3148×g离心10min，吸取上清液0.8ml置进样管中，室温下氮气吹干。血清样本的前处理：精密吸取0.18ml校准品溶液，分别置5ml样品瓶中，再加入前处理溶液2ml，涡旋震荡20s，4℃3148×g离心10min，吸取上清液0.8ml置进样管中，室温下氮气吹干。4、样本复溶用双蒸馏水复溶样本，准备上机。5、配制好流动相，对仪器进行排气，检查仪器状态良好，激活质谱仪，平衡色谱柱30min，至基线平稳、色谱柱压力波动小于20psi，确认色谱柱性能良好，监测器灵敏度无异常。6、校准品上机定值将校准品上机检测，得到校准品和质谱信号之间的函数关系。7、质控品上机检测将质控品上机检测，得到测值，计算测值与靶值之间的相对偏差bias。如果质控品测定值与靶值的偏倚在控，说明测定系统正常。如果质控品测定值与靶值的偏倚超过了10％，说明该测定系统存在质量问题，需要进行纠正措施，直至质控品测定值与靶值的偏倚在控后，方可进行患者样本的检测。8、血清样本的检测在测定系统在控的状态下，对处理后的患者血清样本进行检测，得到检测结果。本发明所要解决的技术问题如上所述，检测过程中的测值来源为校准品的定值，测定系统的质量控制依赖于质控品的测定值与质控品靶值的偏倚来控制。所以，为了保证维生素d及其代谢物质谱检测的准确性，必须有可靠的配套校准品和质控品。校准品的范围应覆盖0.0～200ng/ml，基本设定为0.0ng/ml、5(1±15％)ng/ml、50(1±15％)ng/ml、100(1±15％)ng/ml、200(1±15％)ng/ml。然而，由于正常人的混合血清含有20～35ng/ml维生素d代谢物，依靠正常采血的办法，无法得到0.0ng/ml的维生素d代谢物质空白血清。现有技术中有利用维生素d代谢物质抗体柱从正常人的混合血清中提取维生素d代谢物质，制备成维生素d代谢物空白血清的方法，但该方法成本昂贵，不适宜于工业化生产和应用。目前，常用的维生素d代谢物的校准品和质控品均为维生素d代谢物纯品的甲醇或乙醇溶液，该溶液与血清基质存在非常显著的差别，使测定的准确度偏差较大，无法满足临床精准测定的需要。因此，如何得到0.0ng/ml的空白样本及其它梯度的校准品或质控品，有效控制血清样本检测过程中的基质效应，提高检测的准确度，是目前液相色谱-串联质谱技术测定维生素d及其代谢物的亟需解决的技术问题。技术实现要素：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供基于液相色谱-串联质谱检测技术的维生素d及其代谢物的校准品和质控品。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明在对维生素d及其代谢物在体内的生物代谢途径和理化性质进行大量研究的基础上，开发适用于质谱检测维生素d的校准品和质控品的基质配方，经大量组分的筛选组合和对比，发现将多糖类物质、蛋白类物质和磷脂复配，辅以电解质调节剂和适当的表面活性剂得到的基质具有高度稳定性，且能够有效降低维生素d及其代谢物在血清样品检测过程中的基质效应，显著提高质谱检测的精确度和准确度。具体地，本发明提供一种维生素d及其代谢物的质谱检测用配套品，所述配套品包括校准品和/或质控品，所述校准品或质控品包含基质和选自维生素d及其代谢物中的一种或多种；所述基质包含多糖类物质、蛋白类物质、磷脂、电解质调节剂和表面活性剂。优选地，所述基质包含如下组分：采用上述浓度配比的各组分复配能够更好地模拟血清样品基质在质谱检测过程中的组分情况，更有效地保证较低的基质效应。优选地，所述多糖类物质为天然或合成的可形成胶体状态的多糖类物质，选自甘油、甘露醇、山梨糖醇、明胶、右旋糖酐类、羟乙基淀粉中的一种或多种。所述蛋白类物质为选自动物血清白蛋白中的一种或多种。所述磷脂为选自大豆磷脂、蛋黄磷脂中的一种或多种。所述电解质调节剂包括氯化钠，氯化钾、氯化镁中的一种或多种。所述表面活性剂为非离子表面活性剂中的一种或多种。所述非离子表面活性剂的亲水基团可以为甘油、聚乙二醇和山梨醇等多元醇；亲油基团可以为长链脂肪酸、长链脂肪醇、烷基或芳基，以酯基或醚基与亲水基团结合。作为本发明的优选实施方式，所述多糖类物质为羟乙基淀粉，所述磷脂为蛋黄磷脂，所述蛋白为牛血清白蛋白。血清中的多糖类物质、脂类和蛋白质的种类和数量繁多，组成十分丰富，然而本发明通过筛选最简单的成分组合发现，采用羟乙基淀粉、蛋黄磷脂和牛血清白蛋白三种组分复配使用，即能够很好地模拟血清样品基质在质谱检测中的物质组成和状态，更有效地降低检测过程中的基质效应。进一步优选地，所述基质中，所述羟乙基淀粉和所述蛋黄磷脂的质量比为(50～150)：1。采用上述配比的羟乙基淀粉和蛋黄磷脂能够更好地模拟真实血清样品的基质。更进一步优选地，所述羟乙基淀粉和所述蛋黄磷脂的质量比为(50～100)：1。作为本发明的优选方案，所述基质包括如下组分：添加表面活性剂能够维持基质溶液的油水体系稳定，本发明所述表面活性剂包括非离子表面活性剂lutensolon60、triton100、brij35中的一种或多种。本发明发现采用triton100作为表面活性剂，不仅能够更好地与基质组分复配稳定基质溶液，同时在制备为不同浓度的校准品和质控品时，也能很好地与维生素d或其代谢物配合，更好地保证校准品和质控品的体系稳定性。作为本发明的更优选方案，所述基质包括如下组分：作为本发明的最优选方案，所述基质包括如下组分：本发明的校准品和质控品可以根据检测需要配置为含不同浓度的维生素d或其代谢物。为与质谱检测的浓度范围相匹配，优选地，本发明所述的校准品或质控品中，所述维生素d或其代谢物的浓度为0～200ng/ml；进一步优选地，所述质控品中，所述维生素d或其代谢物浓度为20～100ng/ml。作为本发明的一种优选方案，所述质控品设置两个不同的浓度，分别为25(1±20％)ng/ml和40(1±20％)ng/ml。本发明提供的上述任一质控品或校准品为采用如下方法制备得到：(1)制备溶液a：向水中加入防腐剂、电解质调节剂，至完全溶解，得到溶液a；(2)制备溶液b：将表面活性剂完全溶解于水中，得到溶液b；(3)制备溶液c：将多糖类物质和蛋白类物质完全溶解于水中，得到溶液c；(4)将溶液a、b、c混合后得到空白基质；(5)将维生素d或其代谢物和磷脂以有机溶剂完全溶解，得到溶液d；(6)将溶液d与所述空白基质混合，得到高值溶液；(7)以所述空白基质为稀释剂，按不同比例梯度稀释所述高值溶液得到不同浓度的校准品和质控品。上述步骤(5)中所述有机溶剂应选择能够较好地溶解维生素d或其代谢物的溶剂，同时应保证不影响校准品和质控品的稳定性。优选地，所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、丙醇中的一种或多种。上述步骤(6)中，将溶液d与所述空白基质混合后，进行过滤，将滤液置于37～45℃孵育24～48h，得到高值溶液。本发明还提供所述配套品的制备方法，包括如下步骤：(1)制备溶液a：向水中加入防腐剂、电解质调节剂，至完全溶解，得到溶液a；(2)制备溶液b：将表面活性剂完全溶解于水中，得到溶液b；(3)制备溶液c：将多糖类物质和蛋白类物质完全溶解于水中，得到溶液c；(4)将溶液a、b、c混合后得到空白基质；(5)将维生素d或其代谢物和磷脂以有机溶剂完全溶解，得到溶液d；(6)将溶液d与所述空白基质混合，得到高值溶液；(7)以所述空白基质为稀释剂，按不同比例梯度稀释所述高值溶液得到不同浓度的校准品和质控品。上述步骤(5)中所述有机溶剂应选择能够较好地溶解维生素d或其代谢物的溶剂，同时应保证不影响校准品和质控品的稳定性。优选地，所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、丙醇中的一种或多种。上述步骤(6)中，将溶液d与所述空白基质混合后，进行过滤，将滤液置于37～45℃孵育24～48h，得到高值溶液。所述空白基质中维生素d或其代谢物的浓度为0ng/ml。所述高值溶液中维生素d或其代谢物的浓度为200～240ng/ml。上述维生素d代谢物的校准品可以为含有25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3、1，25-羟基维生素d2、1，25-羟基维生素d3中的任意一种的校准品，或者为含有两种、三种或四种的混合物的校准品。当所述校准品为含有25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3、1，25-羟基维生素d2、1，25-羟基维生素d3中的两种、三种或四种的混合物的校准品时，所述校准品中，各种维生素d代谢物的浓度范围均为0～200ng/ml。上述步骤(7)中，不同浓度的校准品的制备方法如下：将所述高值溶液设为校准品⑤，将所述空白基质设为校准品①溶液，取一定量的校准品⑤溶液和一定量的校准品①溶液，1:1混合，得到校准品④溶液，将一定量的校准品④溶液和一定量的校准品①溶液，1:1混合，得到校准品③溶液，将得到校准品③溶液用校准品①稀释10倍，得到校准品②溶液。上述校准品①、校准品②、校准品③、校准品④、校准品⑤的浓度范围分别为0.0ng/ml、5(1±15％)ng/ml、50(1±15％)ng/ml、100(1±15％)ng/ml、200(1±15％)ng/ml。为便于长时间保存和运输，可以将校准品进行冻干，制备为冻干制剂。所述冻干过程可采用常规的冻干工艺(例如：将校准品分装于3ml药用棕色玻璃瓶进行常规冻干)，但需保证冻干过程的升温温度最高不能超过45℃。冻干结束后，即得到校准品①、校准品②、校准品③、校准品④、校准品⑤的半成品。本发明还提供所述校准品的定值方法，包括：在液质联用系统上，采用nistsrm972a按一定比例稀释后的溶液定标，测定维生素d代谢物校准品。测定方式为：每天测定两次，上午一次，下午一次，一次测定3瓶，连续测定5天。每个浓度得到30个数据，分析数据的精密度，cv应≤5％。如果cv＞5％。应对测定系统进行检查，直至cv≤5％为止。对这30个数据取中位数，即为维生素d代谢物校准品的标示值。上述步骤(7)中所述不同浓度的质控品的制备方法如下：将所述高值溶液与所述空白基质按1:8混合，得到质控品水平1溶液，质控品水平1溶液的浓度范围分别为25(1±20％)ng/ml。将所述高值溶液与所述空白基质按1:5混合，得到质控品水平2溶液，质控品水平2溶液的浓度范围分别为40(1±20％)ng/ml。为便于长时间保存和运输，可以将质控品进行冻干，制备为冻干制剂。所述冻干过程可采用常规的冻干工艺(例如：将上述质控品分装于5ml药用棕色玻璃瓶进行常规冻干)，但需保证冻干过程的升温温度最高不能超过45℃。冻干结束后，即得到质控品水平1和质控品水平2的半成品。本发明还提供所述质控品的定值方法，包括：在液质联用系统上，使用已经定值的维生素d代谢物质校准品进行系统定值，测定质控品水平1和质控品水平2。测定方式为：每天测定两次，上午一次，下午一次，每次测定2瓶，连续测定20天。每个浓度水平得到80个数据，分析数据的精密度，cv应≤15％。如果cv＞15％。应对测定系统进行检查，直至cv≤15％为止。对这80个数据取中位数，即为维生素d代谢物质控品的标示靶值，以标示靶值±20％做为质控品的标识范围。本发明还提供所述配套品在制备利用质谱检测系统检测维生素d或其代谢物含量的试剂盒中的应用。优选地，所述维生素d代谢物包括25-羟基维生素d、1,25-羟基维生素d。其中，所述25-羟基维生素d包括但不限于25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3。所述1,25-羟基维生素d包括但不限于1，25-羟基维生素d2、1，25-羟基维生素d3。本发明进一步提供含有所述配套品的维生素d或其代谢物的检测试剂盒。本领域技术人员应该理解，为完成质谱检测，所述试剂盒还可以包括其他用于维生素d或其代谢物质谱检测的试剂，例如：维生素d或其代谢物质谱检测用的前处理试剂和流动相溶液等。本发明还提供一种维生素d或其代谢物的检测方法，为利用本发明所述的配套品或包含所述配套品的试剂盒进行质谱检测。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种与真实血清样本在质谱检测过程中表现一致的基质配方，该基质的组成成分简单、成本低廉、原料易获得、制备方便。利用该基质制备的校准品和质控品具有高度的稳定性，有效消除了液相色谱-串联质谱技术检测血清样本维生素d及其代谢物过程中产生的基质效应，显著提高了质谱检测维生素d及其代谢物的准确性和室内精密度(准确度bias≤5％、精密度cv≤5％)，为质谱检测维生素d及其代谢物技术的产业化和广泛应用解决了技术瓶颈。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1维生素d代谢物的质谱检测用校准品的制备(1)本实施例提供一种维生素d代谢物的质谱检测用校准品，用于配制校准品的基质的配方如下：羟乙基淀粉50g/l，牛血清白蛋白50g/l，蛋黄磷脂0.5g/l，triton1000.5ml/l，氯化钠9g/l，proclin3000.5ml/l，纳他霉素0.5ml/l。校准品由上述基质和不同浓度的维生素d代谢物组成。本实施例提供维生素d代谢物的质谱检测用校准品的制备方法(1l体积)，具体如下：1、空白基质的制备(1)溶液a的制备：准确吸取proclin3000.5ml，纳他霉素0.5ml，溶解到50ml双蒸馏水中，混合均匀。准确称取9g氯化钠(色谱纯级别)，完全溶解到上述proclin300和纳他霉素溶液中，定容至100ml，得到溶液a。(2)溶液b的制备：准确称取表面活性剂triton1000.5ml，加入到50ml双蒸馏水中，混合均匀，定容至100ml，得到溶液b。(3)溶液c的制备：准确称取羟乙基淀粉50g溶解在50ml的双蒸馏水中，搅拌至完全溶解；准确称取牛血清白蛋白50g，加入至上述溶液中，用封口膜封住容器口，于2℃～8℃放置24小时，取出，搅拌均匀，定容至100ml，得到溶液c。(4)空白基质的制备：将溶液a、b、c混合，搅拌均匀，使用双蒸馏水定容至1l。用0.45μm的滤膜对定容后的溶液进行过滤，收集滤液，即得空白基质溶液；上述制备的空白基质中不含有蛋黄卵磷脂，其中，维生素d代谢物的浓度为0ng/ml。2、高值溶液的制备(1)溶液d的制备：准确称取蛋黄磷脂0.5g，溶解在1ml的乙醇中，准确称取维生素d代谢物(可根据需要选择25-羟基维生素d3、1,25-羟基维生素d3、25-羟基维生素d2、1,25-羟基维生素d2中的任意1种，或者2种、3种、4种的混合物)的纯品0.2mg溶解在上述溶液中，漩涡振荡，至完全溶解，得到溶液d。(2)将上述1中制备的溶液a、b、c混合，搅拌均匀，加入溶液d，搅拌均匀，使用双蒸馏水定容至1l。(3)将上述(2)中的混合溶液装入玻璃容器中进行37℃水浴孵育，时间为48小时。将反应液取出，即制得含有维生素d代谢物(25-羟基维生素d3、1,25-羟基维生素d3、25-羟基维生素d2和1,25-羟基维生素d2中的1种纯品，或者2种、3种、4种的混合物)的高值溶液。3、各浓度梯度维生素d代谢物校准品的制备将上述制备的高值溶液设为校准品⑤，空白基质设为校准品①溶液，以校准品①溶液(空白基质)作为稀释剂配制各中间浓度的校准品：取校准品⑤溶液200ml和校准品①溶液200ml，1:1混合，得到校准品④溶液，将校准品④溶液175ml和校准品①溶液175ml，1:1混合，得到校准品③溶液，将得到的校准品③溶液用校准品①稀释10倍，得到校准品②溶液。将上述校准品溶液分装于3ml药用棕色玻璃瓶，分装体积为1ml，进行冻干操作。冻干过程为常规的冻干工艺，冻干过程中，升温的温度最高为37℃。冻干结束后，即得到校准品①、校准品②、校准品③、校准品④、校准品⑤的半成品。4、维生素d代谢物校准品的定值在液质联用系统上，采用nistsrm972a按一定比例稀释后的溶液定标，测定维生素d代谢物校准品。测定方法为：每天测定两次，上午一次，下午一次，一次测定3瓶，连续测定5天。每个浓度得到30个数据，分析数据的精密度，cv应≤5％。如果cv＞5％。应对测定系统进行检查，直至cv≤5％为止。对这30个数据取中位数，即为维生素d代谢物校准品的标示值。以25-羟基维生素d3代谢物的校准品的定值过程为例，其定值过程的结果如表1所示，经过5天的定值，得到校准品②③④⑤的标示值为5.00ng/ml、50.20ng/ml、101.75ng/ml、204.44ng/ml，校准品①为空白基质，标示值为0ng/ml。表1维生素d代谢物校准品的定值过程实施例2维生素d代谢物质谱检测用质控品的制备(1)1、维生素d代谢物质质控品水平1和质控品水平2的制备用于质控品制备的空白基质和高值溶液的制备同实施例1。将高值溶液100ml和空白基质溶液800ml混合，得到质控品水平1(质控品l1)溶液。将高值溶液100ml和空白基质溶液500ml混合，得到质控品水平2(质控品l2)溶液。将上述溶液分装于5ml药用棕色玻璃瓶，分装量为3ml。进行冻干操作。冻干过程为常规的冻干工艺，冻干过程中，升温的温度最高温度为37℃。冻干结束后，即得到质控品水平1和质控品水平2的半成品。2、维生素d代谢物质控品的定值在液质联用系统上，使用已经定值的维生素d代谢物校准品进行系统定值，测定质控品水平1和质控品水平2。测定方式为：每天测定两次，上午一次，下午一次，每次测定2瓶，连续测定20天。每个浓度水平得到80个数据，分析数据的精密度，cv应≤15％。如果cv＞15％。应对测定系统进行检查，直至cv≤15％为止。对这80个数据取中位数，即为维生素d代谢物质控品的标示靶值，以标示靶值±20％作为质控品的标识范围。以25-羟基维生素d3两个质控品水平的定值过程为例，其定值过程结果分别如表2和表3所示，经过20天的定值，得到质控品水平1和质控品水平2的标示靶值分别为25.28ng/ml和40.20ng/ml。表2质控品水平1的定值过程表3质控品水平2的定值过程对比例1本对比例提供一种维生素d代谢物质谱检测用校准品，其与实施例1的校准品的区别仅在于，以乙醇为基质(即校准品由乙醇和不同浓度的维生素d代谢物组成)。利用实施例1的制备方法分别制备得到校准品7(制备方法对应实施例1的校准品2)、8(制备方法对应实施例1的校准品3)、9(制备方法对应实施例1的校准品4)、10(制备方法对应实施例1的校准品5)。对比例2本对比例提供一种维生素d代谢物质谱检测用质控品，其与实施例2的质控品的区别仅在于，以乙醇为基质(即质控品由乙醇和不同浓度的维生素d代谢物组成)。利用实施例2的制备方法分别制备得到质控品l3(制备方法对应实施例2的质控品l1)和质控品l4(制备方法对应实施例2的质控品l2)。实验例1质控品和校准品对于维生素d代谢物检测过程中基质效应的影响基质效应的评价方法为本领域的常规方法，简要描述如下：1、材料1.1、被评价的试剂、校准品和仪器1.2、对照的试剂、校准品和仪器1.3、处理过的样品：即为本实验例的被评价对象(实施例1所制备的校准品和实施例2所制备的质控品)。1.4、新鲜人血清样品至少20例新鲜人血清样品，血清的浓度应覆盖线性范围。2、操作2.1、准备样品按照1的要求准备样品。2.2、被评价方法分析将处理过的样品夹杂在20例新鲜人血清中，重复测定三次，每次重新定标；测试在一天内完成。2.3、对照方法分析将实施例1制备的校准品和质控品分别夹杂在20例新鲜人血清中，按照2.2的程序进行同样的操作。3、数据分析3.1、平均值运算分别对20例新鲜人血清的测值取平均值，以对照方法为x轴，以被评价方法为y轴。3.2、置信区间的计算按照下面所示的公式计算一级方程或二级方程的置信区间：其中：y的预期值；n：新鲜的血清数；g：一阶线性时为2，二阶线性时为3；sy·x：回归的标准误；对照方法测值x的平均值；被评价方法测值x的平均值；对照方法测值x的总均值。4、判定标准如果处理过的样品的测值按照回归方程进行计算，落在置信区间内，则被评价的样品在被评价系统内不存在基质效应，反之，则存在基质效应。本实验例以25-羟基维生素d3为例，根据上述方法分析实施例1制备的25-羟基维生素d3校准品以及实施例2制备的25-羟基维生素d3质控品的基质效应：分别在waterstqd(方法一)和sciex4500(方法二)两台不同型号的液质联用的仪器上，使用国际参考血清(srm972a)进行系统校准，测定20例随机临床血清样本，每个样本平行测定三次，取均值，对两组均值进行回归，得到回归方程。测定本发明实施例1制备的校准品和实施例2制备的质控品，每个样本平行测定三次，取均值，将这些均值带入上述的回归方程中，计算置信区间的上下限，比较实测值是否在置信区间内。20例新鲜临床血清样本、实施例1制备的校准品和实施例2制备的质控品的各次测定结果如表4所示：表4用于评价基质效应的血清样本、实施例的质控品和校准品的测定结果将上述20例新鲜人血清的测定值的均值进行回归处理，构建回归方程的结果如表5所示。表5回归信息表回归方程的截距回归方程的斜率t-检验值标准误-0.14461.01112.43340.5082表6实施例的质控品和校准品的实测均值和计算得到的置信区间的上下限方法一实测平均值方法二实测平均值上限下限质控品l125.3325.2526.1224.43质控品l240.2740.1341.1339.49校准品25.035.005.823.85校准品349.8050.2050.7649.06校准品4101.04100.66102.87100.12校准品5200.68199.77204.75198.88本发明实施例1制备的校准品和实施例2制备的质控品的实测均值和计算得到的置信区间的上下限结果如表6所示，结果表明，采用方法一实测平均值和方法二进行测定得到的实测平均值均在置信区间上下限范围内，实施例1制备的校准品和实施例2制备的质控品在液质联用检测过程中不存在基质效应。在上述同样的仪器条件下，以25-羟基维生素d3为例，利用上述相同的方法分析对比例1和对比例2中使用乙醇作为基质的校准品和质控品的基质效应，20例新鲜临床血清样本、对比例1制备的校准品和对比例2制备的质控品的各次测定结果和平均值如表7所示。表7用于评价基质效应的血清样本、对比例的质控品和校准品的测定结果将上述20例新鲜人血清的测定值的均值进行回归处理，构建回归方程的结果如表8所示。表8回归信息表回归方程的截距回归方程的斜率t-检验值标准误0.79641.06162.43340.8617对比例1制备的校准品和对比例2制备的质控品的实测均值和计算得到的置信区间的上下限结果如表9所示，结果表明，方法一实测平均值和方法二实测平均值均在置信区间上下限范围以外，在与实施例1和2制备的校准品和质控品在同样的仪器条件下检测，对比例1制备的校准品和对比例2制备的质控品在液质联用测定过程中存在基质效应。表9对比例的质控品和校准品的实测均值和计算得到的置信区间的上下限实验例2校准品对于维生素d代谢物检测准确度的影响本实验例以25-羟基维生素d3为例，分析实施例1制备的25-羟基维生素d3的校准品对于维生素d代谢物检测准确度的影响。准确度的实验要求：测定国家标准品(编号：srm972a)，测量结果的相对偏差应≤±15％。准确度的实验方法：测定国家标准品(编号：srm972a)3次，按以下式计算相对偏差(b)，如果3次都符合，即判为合格。如果大于或等于2次结果不符合，即判为不合格。如果有1次结果不符合，则应重新连续测试20次，并分别按照式(2)计算相对偏差，如果大于等于19次测试的结果符合，则准确度符合要求。b＝(m-t)/t×100％式(2)式(2)中：m：测试结果；t：标示值。根据上述准确度的评价的实验方法评价利用实施例1制备的校准品进行维生素d代谢物国家标准品检测的准确度，结果如表10所示。表10准确度评价的实验结果测值127.82测值228.94测值328.66均值28.47靶值28.1相对偏差1-1.00％相对偏差22.99％相对偏差31.99％准确度的实验结果表明，实施例1的校准品在已知公开的溯源途径下进行定值，其准确度完全符合要求。实验例3质控品对检测系统室内精密度的控制本实验例以25-羟基维生素d3为例，分析实施例2制备的质控品对检测系统室内精密度的控制。分别复溶实施例2制备的25-羟基维生素d3的两个浓度水平的质控品l1和l2，复溶的量足够实验评价用。分装于1mleppendorf管里，-20℃贮存。每次实验前1小时取出，置于室温，待其融化。反复倒置eppendorf管后，分别将质控品l1和l2吸出，加入到样品杯中，进行测定。每天测定两批(run)，一批平行测定两次(replicate)，持续20天(day)，实验结束时，每个浓度水平，应收集80个数据。进行数据处理。分别计算测量值的平均值和标准差(sd)，按下面公式(3)计算变异系数(cv)：表11室内精密度评价的实验结果实施例2的质控品的室内精密度实验结果如表11所示，结果表明，实施例2制备的质控品l1和l2对测定系统的控制良好，cv在5％以内，符合临床需要。综上所述，本发明提供的基质以及利用该基质制备的校准品和质控品显著降低了维生素d及其代谢物检测过程的基质效应，提高了检测的准确性和室内精密度。本发明提供的维生素d及其代谢物质谱检测系统配套使用的校准品和质控品的制备方法适于工业化大规模生产，降低了生产成本，大大降低了质谱检测维生素d及其代谢物质的成本和价格，适于推广应用。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12