LC-MSMS法测定人血浆中七叶皂苷A、B、C、D的方法及其应用与流程

本发明涉及生物医学
技术领域：
，具体为lc-msms法测定人血浆中七叶皂苷a、b、c、d的方法及其应用。
背景技术：
：七叶皂苷的分子结构是由皂苷元和糖经糖苷键连接而成，分子极性较大，难溶于低极性的有机溶剂，用常规的液－液萃取方法难以将其从生物样品中提取出来，因此大多用甲醇沉淀蛋白或固相萃取的方法进行样品处理。七叶皂苷组成成分分子结构中缺乏生色团，hplc－uv等常规分析方法无法提供足够的灵敏度，因此其体内浓度分析成了限制七叶皂苷药代动力学研究的一个瓶颈。1991年，kunz等首次用免疫法(ria)测定了人血浆中β七叶皂苷的浓度，为全面了解七叶皂苷在人体内的药代动力学行为奠定了基础，2010年前报道的七叶皂苷的药代动力学研究大多是用ria完成的。但ria法具有很多局限性，如选择性差，容易受到结构类似物的交叉干扰，操作繁琐，无法对多种组分分别定量等，限制了其应用；液相色谱－质谱联用方法(lc－ms/ms)方法具有液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度和极强的定性专属特异性，是目前药代动力学研究领域中使用的主流工具。liu等开发了静脉给予七叶皂苷后同时测定生物样品中七叶皂苷a、b单体的lc－ms/ms方法，二者的检测定量下限依次为2.000ng/ml和1.500ng/ml，样品处理采用固相萃取。对七叶皂苷的单体七叶皂苷a、七叶皂苷b、七叶皂苷c和七叶皂苷d的研究显示，单体的绝对生物利用度均不足2％，口服给予七叶皂苷钠片七叶皂苷a、b、c、d的cmax分别为2.09±2.90ng/ml、1.10±1.54ng/ml、5.02±6.71ng/ml、2.06±2.75ng/ml。生物样品采用固相萃取，步骤繁琐，样本处理成本高，严重影响分析效率。生物基质中七叶皂苷a、b、c、d四个成分，仅部分测定或四种成分未达到基线分离，目前检测方法定量下限过高，无法满足口服给药后生物样品分析要求，七叶皂苷a和c,b和d存在相互转换，未见采取稳定措施。技术实现要素：本发明的目的在于提供lc-msms法测定人血浆中七叶皂苷a、b、c、d的方法及其应用，以解决
背景技术：
提出的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：lc-msms法测定人血浆中七叶皂苷a、b、c、d的方法，包括以下步骤：s1：取300μl酸化血浆样品(1ml血浆样品中加入20μl10％乙酸水进行酸化处理)于96孔板中，加入内标工作液45μl(甲苯磺丁脲10ng/ml)，再加入甲醇900μl，涡旋10分钟，室温下高速离心(4000rpm)15分钟，取上清900μl于另一96孔板中，将板放入96孔板氮吹仪吹干，吹干后加入150μl25％甲醇(含0.2％fa)复溶，涡旋5分钟，再在室温下高速离心(4000rpm)5分钟，进行lc-ms/ms分析，进样体积30μl。优选的，所述s1中，lc-ms/ms分析中的色谱条件如下：色谱柱：acquityuplchsst3，100*2.1mm，1.8μm；柱温：40℃；进样体积：30μl；进样器温度：4℃；运行时间：16min；流速：0.6000ml/min洗针液：50％甲醇水；流动相a/b：0.5％乙酸水溶液/0.5％乙酸乙腈溶液。优选的，所述s1中，lc-ms/ms分析中的质谱条件如下：离子检测方式：多反应离子监测(mrm)；离子极性：正离子；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(esi)；cad：medium；cur：20psi；gs1：45psi；gs2：35psi；tem：400℃；is：5500v。如上所述的lc-msms法测定人血浆中七叶皂苷a、b、c、d的应用，本法应用于七叶皂苷口服制剂临床药代动力学研究。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本法采用甲醇沉淀蛋白处理样品，氮气吹干复溶后进样，相比于固相萃取回收率稳定，处理时间大大缩短，成本明显降低，测定四个成分，定量下限明显分离，七叶皂苷a、b、c和d定量下限分别为20pg/ml、20pg/ml、40pg/ml和40pg/ml能满足口服药代动力学样品测定要求，将血浆加入酸化稳定剂，最终四个成分isr分析合格率均在95％以上，本法用于七叶皂苷口服制剂临床药代动力学研究，能完整描画其药动学行为。附图说明图1为本发明中空白样品的典型图谱；图2为本发明中七叶皂苷a、b、c、d和内标的保留时间的典型图谱；图3为本发明中待测样品的典型图谱。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。请参阅图1-图3，本发明提供一种技术方案：lc-msms法测定人血浆中七叶皂苷a、b、c、d的方法，包括以下步骤：s1：取300μl酸化血浆样品(1ml血浆样品中加入20μl10％乙酸水进行酸化处理)于96孔板中，加入内标工作液45μl(甲苯磺丁脲10ng/ml)，再加入甲醇900μl，涡旋10分钟，室温下高速离心(4000rpm)15分钟，取上清900μl于另一96孔板中，将板放入96孔板氮吹仪吹干，吹干后加入150μl25％甲醇(含0.2％fa)复溶，涡旋5分钟，再在室温下高速离心(4000rpm)5分钟，进行lc-ms/ms分析，进样体积30μl。进一步地，s1中，lc-ms/ms分析中的色谱条件如下：色谱柱：acquityuplchsst3，100*2.1mm，1.8μm；柱温：40℃；进样体积：30μl；进样器温度：4℃；运行时间：16min；流速：0.6000ml/min洗针液：50％甲醇水；流动相a/b：0.5％乙酸水溶液/0.5％乙酸乙腈溶液。进一步地，s1中，lc-ms/ms分析中的质谱条件如下：离子检测方式：多反应离子监测(mrm)；离子极性：正离子；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(esi)；cad：medium；cur：20psi；gs1：45psi；gs2：35psi；tem：400℃；is：5500v。lc-msms法测定人血浆中七叶皂苷a、b、c、d的应用，本法应用于七叶皂苷口服制剂临床药代动力学研究。本实施例色谱条件中的梯度程序如下表：时间(min)a％b％0653513.5623813.659514.659514.7653516.0controlstop本实施例的化合物参数见下表：化合物检测离子对dpcecxp(v)ep(v)采集七叶皂1131.6-807.270201510450七叶皂1131.6-807.270201510450七叶皂1131.6-807.270201510450七叶皂1131.6-807.270201510450甲苯磺271.1-154.863261510450本实施例的标曲及质控浓度的设定如下：七叶皂苷-a浓度：标准曲线浓度：20.00、40.00、200.0、400.0、2000、5000和10000pg/ml。质控浓度：60.00、1000和8000pg/ml。定量下限：20.00pg/ml。七叶皂苷-b浓度：标准曲线浓度：20.00、40.00、200.0、400.0、2000、5000和10000pg/ml。质控浓度：60.00、1000和8000pg/ml。定量下限：20.00pg/ml。七叶皂苷-c浓度：标准曲线浓度：40.00、80.00、400.0、800.0、4000、10000和20000pg/ml。质控浓度：120.0、2000和16000pg/ml。定量下限：40.00pg/ml。七叶皂苷-d浓度：标准曲线浓度：40.00、80.00、400.0、800.0、4000、10000和20000pg/ml。质控浓度：120.0、2000和16000pg/ml。定量下限：40.00pg/ml。定量下限(七叶皂苷a、b、c、d和内标的保留时间依次为7.16、8.31、10.21、11.27和5.75分钟)。本法采用甲醇沉淀蛋白处理样品，氮气吹干复溶后进样，相比于固相萃取回收率稳定，处理时间大大缩短，成本明显降低，测定四个成分，定量下限明显分离，七叶皂苷a、b、c和d定量下限分别为20pg/ml、20pg/ml、40pg/ml和40pg/ml能满足口服药代动力学样品测定要求，将血浆加入酸化稳定剂，最终四个成分isr分析合格率均在95％以上，本法用于七叶皂苷口服制剂临床药代动力学研究，能完整描画其药动学行为。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。当前第1页12