一组土壤线虫提取装置及提取方法与流程

本发明属于线虫提取技术领域，具体涉及一组土壤线虫提取装置及提取方法。

背景技术：

土壤动物是生态系统中必不可少的一部分，对其物质的循环以及能量的流动发挥着重要的作用。土壤线虫是土壤动物的主要功能类群，是土壤中最丰富的后生动物，适应于各种生境，在土壤生态系统碎屑食物网中扮演重要的角色。土壤线虫对外部环境的变化非常敏感，形态特征和群落组成与其生境息息相关，目前已被用于反映土壤质量状况的指示生物。从土壤中提取线虫是研究土壤线虫的前提条件，也是重要环节。现有土壤线虫提取方法主要有浅盘法、漂浮离心法和贝尔曼漏斗法。各方法优缺点并存，具体采用何种方法提取线虫，主要依据研究目标线虫的生物学特性和样本特征而定。以浅盘法提取线虫为例，在分离的过程中线虫会与植物根系或者土壤杂质混合在一起，不利于接下来的分析。但是仅使用浅盘法提取砂土中的线虫，难以得到澄清的线虫悬浮液。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种土壤线虫提取装置及提取方法，利用所述装置和方法，可得到澄清的线虫悬浮液，有利于后续分析。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一组土壤线虫提取装置，包括独立的组筛、浅盘装置和线虫悬浮液纯化体系；所述组筛包括上下罗列的上筛和下筛，所述上筛的筛孔直径大于下筛的筛孔直径；所述浅盘装置包括置于浅盘上的第一筛网，所述第一筛网的筛面上固定有滤纸，所述滤纸的上方中央位置放置有表面皿；所述线虫悬浮液纯化体系包括独立的蔗糖溶液、离心管、离心机和第二筛网，所述蔗糖溶液的浓度为1.18g/cm³。

优选的，所述上筛为60目筛，所述下筛为400目筛。

优选的，所述第一筛网为18目筛。

优选的，所述第二筛网为400目筛。

本发明还提供了一种提取土壤线虫的方法，包括以下步骤：(1)将土壤与水按照1g：(16～24)ml的质量体积比混合，静置后得泥浆；

(2)将所述泥浆置于所述组筛上，用水冲洗下筛网面，收集洗液；

(3)将所述洗液倾倒于所述浅盘装置中的表面皿上，静置后收集浅盘中的滤液；

(4)将所述滤液静置1～3h后，去除上层清液，得水、线虫和泥浆的混合物；

(5)将所述混合物置于离心管中经第一离心后，去除上清液，得泥浆层；

(6)将所述泥浆层与所述蔗糖溶液混合后进行第二离心，将上清液通过所述第二筛网，清水冲洗网面后，收集冲洗液；

(7)将所述冲洗液静置1～3h后，去除上层清液，得水和线虫的混合物；

(8)将所述水和线虫的混合物静置1～3h后，去除上层清液，得土壤线虫。

优选的，步骤(2)和步骤(6)所述冲洗均为用水冲洗所述下筛的背面。

优选的，步骤(5)所述第一离心和步骤(6)所述第二离心的转速独立为1800～2500rpm，离心时间为3～5min。

优选的，步骤(4)、步骤(7)和步骤(8)所述去除上层清液均为利用真空泵抽取。

优选的，所述去除上层清液时，利用软管连接真空泵和一移液枪枪头，将所述移液枪枪头沿杯壁、贴水面上方抽上层清液。

优选的，所述移液枪枪头为1ml枪头。

本发明提供了一组土壤线虫提取装置，包括独立的组筛、浅盘装置和线虫悬浮液纯化体系；所述组筛包括上下罗列的上筛和下筛，所述上筛的筛孔直径大于下筛的筛孔直径；所述浅盘装置包括置于浅盘上的第一筛网，所述第一筛网的筛面上固定有滤纸，所述滤纸的上方中央位置放置有表面皿；所述线虫悬浮液纯化体系独立的蔗糖溶液、离心管、离心机和第二筛网，所述蔗糖溶液的浓度为1.18g/cm³。利用本发明所述装置提取线虫时，采用浅盘提取结合漂浮离心法的方式，提取方便，且得到的线虫混悬液澄清，几乎无杂质，有利于后期镜检和计数。

附图说明

图1为本发明所述提取装置中组筛的实物图；

图2为本发明所述提取装置中浅盘装置的第一筛网实物图；

图3为本发明所述提取装置中真空泵抽提滤液图；

图4为利用不同方法提取得到的线虫悬浮液照片；

图5为利用不同方法提取得到的线虫悬浮液计数照片。

具体实施方式

本发明提供了一组土壤线虫提取装置，包括独立的组筛、浅盘装置和线虫悬浮液纯化体系；所述组筛包括上下罗列的上筛和下筛，所述上筛的筛孔直径大于下筛的筛孔直径；所述浅盘装置包括置于浅盘上的第一筛网，所述第一筛网的筛面上固定有滤纸，所述滤纸的上方中央位置放置有表面皿；所述线虫悬浮液纯化体系包括独立的蔗糖溶液、离心管、离心机和第二筛网，所述蔗糖溶液的浓度为1.18g/cm³。

在本发明所述土壤线虫提取装置中，所述组筛、浅盘装置和线虫悬浮液纯化体系为分别独立的三个装置，可分别对应到土壤线虫提取方法的不同步骤中。

本发明所述组筛如图1所示中，所述上筛的优选为60目筛，所述下筛优选为400目筛。在本发明中，所述上筛可以隔绝大块杂质，所述下筛可以拦截线虫，使线虫留在下筛的筛面上。

本发明所述浅盘装置中，所述浅盘的直径大于所述第一筛网的直径，使所述第一筛网可以完全落入浅盘中。本发明在所述第一筛网的筛面上固定有滤纸，所述滤纸的上方中央位置放置有表面皿，所述第一筛网优选为18目筛。本发明所述滤纸优选可以完全覆盖所述第一筛网的筛面，更优选的规格为210mm×210mm。本发明对所述滤纸的来源和种类并没有特殊限定，优选为常规的市售面巾纸，本发明实施例中采用“心心相印”面巾纸。本发明优选采用两张所述面巾纸交错置于第一筛网上，使面巾纸覆盖筛孔，同时四周仍有富余，如图2所示。本发明所述固定优选为利用铁丝固定，在固定时优选将所述铁丝弯曲成与所述第一筛网的内径相同的圆环，使其正好与所述第一筛网的内径嵌合并将面巾纸撑展。

本发明所述线虫悬浮液纯化体系包括独立的蔗糖溶液、离心管、离心机和第二筛网，所述蔗糖溶液的浓度为1.18g/cm³。本发明所述第二筛网优选为400目筛。本发明所述蔗糖溶液的密度大于线虫(1.08g/cm³)密度，可用于离心抽提。

本发明还提供了一种提取土壤线虫的方法，包括以下步骤：(1)将土壤与水按照1g：(16～24)ml的质量体积比混合，静置后得泥浆；

(2)将所述泥浆置于所述组筛上，用水冲洗下筛网面，收集洗液；

(3)将所述洗液倾倒于所述浅盘装置中的表面皿上，静置后收集浅盘中的滤液，将所述滤液转移至烧杯中；

(4)将所述烧杯中的滤液静置1～3h后，去除上层清液，得水、线虫和泥浆的混合物；

(5)将所述混合物置于离心管中经第一离心后，去除上清液，得泥浆层；

(6)将所述泥浆层与所述蔗糖溶液混合后进行第二离心，将上清液通过所述第二筛网，清水冲洗网面后，收集冲洗液；

(7)将所述冲洗液静置1～3h后，去除上层清液，得水和线虫的混合物；

(8)将所述水和线虫的混合物静置1～3h后，去除上层清液，得土壤线虫。

本发明所述方法中，将土壤与水按照1g：(16～24)ml的质量体积比混合，静置后得泥浆。本发明所述土壤与水的质量体积比优选为1g：(18～22)ml，更优选为1g:(19～21)ml，最优选为1g：20ml。在本发明实施例中，利用烧杯称取50g土壤，并将所述土壤转移至量杯中，加1l左右的水混合均匀。本发明所述混合过程中伴随玻璃棒搅拌，使所述土壤快速成为泥浆。本发明对所述搅拌的速度并没有特殊限定。本发明所述静置优选为在室温下进行静置，所述静置的时间优选为0.6～1.5min，更优选为0.8～1.2min，最优选为1min。

得泥浆后，本发明将所述泥浆置于所述组筛上，用水冲洗下筛网面，收集洗液。本发明将所述泥浆缓慢倒入组筛中，边倒边振荡组筛，以防因倾倒速度过快，水充满下层的400目筛子而从边缘溢出，造成线虫丢失。本发明对所述倒的速度并没有特殊限定，优选以泥浆不飞溅且不从下层400目筛的边缘溢出为宜。本发明对所述振荡的频率并没有特殊限定，优选以泥浆不从下层400目筛的边缘溢出为宜。本发明将所述泥浆倒入组筛后，优选还包括用1l自来水继续清洗3次。本发明所述清洗的步骤与所述泥浆倒入的操作相同。待所述清洗完成后，本发明用水冲洗下筛网面，收集洗液。本发明所述冲洗优选为用水冲洗所述下筛的背面，同时倾斜所述下筛，将洗液承接于烧杯中。本发明对所述冲洗的出水量以及出水压力并没有特殊限定，以防水花飞溅造成线虫丢失即可。本发明收集洗液后，优选的还包括静置3～5min。

得洗液后，本发明将所述洗液倾倒于所述浅盘装置中的表面皿上，静置后收集浅盘中的滤液，将所述滤液转移至烧杯中。本发明对所述倾倒的速度并没有具体限定，优选的倒时泥浆不产生飞溅，泥浆不蔓延至面巾纸的边缘即可。本发明在所述倾倒结束后，优选还包括用清水清洗盛装洗液的装置和表面皿，并将清洗后的液体重新倾倒。本发明在所述倾倒结束后静置，所述静置的时间优选为20～30h，更优选为22～25h，最优选为24h。

本发明将所述烧杯中的滤液静置1～3h后，去除上层清液，得水、线虫和泥浆的混合物。本发明将所述滤液转移至烧杯后，优选的静置2h以上。本发明所述去除上层清液优选为利用真空泵抽取，如图3所示具体包括：将真空泵与一个移液枪枪头通过软管连接，将枪头沿杯壁、贴水面上方抽水，勿伸入水面以下，以防吸走线虫，只保留下层大约50ml水、线虫和泥浆的混合物。本发明所述移液枪枪头优选为1ml枪头。

得水、线虫和泥浆的混合物后，本发明将所述混合物置于离心管中经第一离心后，去除上清液，得泥浆层。本发明所述离心管优选为100ml离心管。本发明所述第一离心的转速优选为1800～2500rpm，更优选为1850～2200rpm，最优选为2000rpm。本发明所述第一离心的时间优选为3～5min，更优选为4min。本发明在所述第一离心后，优选倾倒掉上清液，保留泥浆层，因为线虫的密度为1.08g/cm³，比水的密度略大，所以水与线虫和泥土分层，线虫和泥土混合在一起。

得泥浆层后，本发明将所述泥浆层与所述蔗糖溶液混合后进行第二离心，将上清液通过所述第二筛网，清水冲洗网面后，收集冲洗液。在本发明实施例中，将泥浆层与10ml所述蔗糖溶液进行混合并摇匀，然后进行第二离心。本发明所述第二离心的转速优选为1800～2500rpm，更优选为1850～2200rpm，最优选为2000rpm。本发明所述第二离心的时间优选为3～5min，更优选为4min。本发明在所述第二离心后，因为线虫的密度比蔗糖溶液的密度小，所以线虫与泥土分离，飘浮于蔗糖溶液中，由于泥土的密度较大，所以沉积在离心管底部。本发明将所述第二离心的上清液通过所述第二筛网，清水冲洗网面后，收集冲洗液。本发明所述第二筛网优选为400目筛。本发明将所述上清液通过第二筛网后，优选还包括清水通过所述第二筛网，以防止线虫在蔗糖溶液中脱水变形。本发明利用清水冲洗网面后，收集冲洗液，所述冲洗的步骤与步骤(2)相同，不再赘述。

得冲洗液后，本发明将所述冲洗液静置1～3h后，去除上层清液，得水和线虫的混合物。本发明所述静置的时间优选为2h。本发明所述去除上层清液的步骤与步骤(4)相同，只保留下层大约50ml水和线虫的混合物，不再赘述。

得水和线虫的混合物后，本发明将所述水和线虫的混合物静置1～3h后，去除上层清液，得土壤线虫悬浮液。本发明优选将所述水和线虫的混合物转移至100ml大试管中，并用自来水洗净盛装水和线虫的混合物的装置，静置2h以上。本发明所述去除上层清液优选为：用真空泵抽去100ml大试管上部的水，保留2～3ml水和线虫混合物，此时线虫全部沉积在大试管底部，抽水时注意不要晃动大试管，以防线虫被重新搅起而被吸走。

下面结合实施例对本发明提供的一组土壤线虫提取装置及提取方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

前期准备

编框：取2张面积尽可能大的面巾纸(210mm×210mm)平铺于18目筛子中，2张纸交错放置，使面巾纸覆盖筛孔四周并有富余，将铁丝卷成与筛子内径相当的圆环，使其正好与筛子内径嵌合并将面巾纸撑展。

上面放置60目筛子，下面放置400目筛子，形成一套组筛。

线虫提取

实验步骤1、2、3和4均在烘箱铁架上进行。

1.称取50g土壤样品于100ml烧杯中，将土样转移至量杯(容积大于1l)中，向量杯中加自来水1l，用玻璃棒搅拌使土块成为泥浆，静置1min。

2.缓慢将泥浆倒入组筛(上60目，下400目)中，边倒边振荡组筛，以防因倾倒速度过快，水充满下层的400目筛子而从边缘溢出，造成线虫丢失。

3.接下来继续加自来水1l，重复上述操作3次。

4.水龙头接一根橡皮软管，使水柱朝向400目筛子背面，倾斜筛子一侧，另一侧用250ml烧杯承接线虫和泥浆冲洗液，冲洗过程中调节水龙头出水量使水柱压力适中，以防水花飞溅造成线虫丢失，冲洗完毕后静置若干分钟。

5.将事先编好的18目筛子放入比筛子直径大的花盆托盘中，再将表面皿放置于面巾纸中央。

6.将250ml烧杯中的泥浆倾倒入18目筛子的表面皿中，注意倾倒时速度缓慢，小心泥浆倒在面巾纸的边缘，造成线虫悬浮液浑浊，倾倒完毕后用清水洗净烧杯和表面皿，静置24h。

7.取走网筛，将浅盘中的水全部转移至250ml烧杯中，静置2h以上。

8.真空泵连接的软管另一头连接一个1ml移液枪枪头，将枪头沿杯壁、贴水面上方抽水，勿伸入水面以下，以防吸走线虫，只保留下层大约50ml水、线虫和泥浆的混合物。

9.将混合物轻轻摇匀，转移至100ml离心管中，经调平后，放入离心机中进行第一次离心(转速2000rpm，时间4min)。倾倒掉第一次离心后的上清液，保留泥浆层。因为线虫的密度为1.08g·cm^-3，比水的密度略大，所以水与线虫和泥土分层，线虫和泥土混合在一起。

10.向离心管中加入密度为1.18g·ml^-1的蔗糖溶液10ml，经调平后，摇匀，放入离心机中进行第二次离心(转速2000rpm，时间4min)。因为线虫的密度比蔗糖溶液的密度小，所以线虫与泥土分离，飘浮于蔗糖溶液中，由于泥土的密度较大，所以沉积在离心管底部。

11.离心后，迅速将离心管内的上清液倒入400目筛子中，用自来水将蔗糖溶液冲洗干净，以防线虫在蔗糖溶液中脱水变形。

12.重复上述步骤4，冲洗完毕后静置2h以上，进行步骤8的操作，只保留下层大约50ml水和线虫的混合物。

13.将烧杯中水和线虫混合物转移至100ml大试管中，并用自来水洗净烧杯，静置2h以上。

14.用真空泵抽去100ml大试管上部的水，保留2-3ml水和线虫混合物，此时线虫全部沉积在大试管底部，抽水时注意不要晃动大试管，以防线虫被重新搅起而被吸走。

对得到的线虫悬浮液进行拍照，如图4-2和5-2所示，悬浮液澄清，计数容易。

根据本领域的常规手段，采用浅盘法进行线虫的提取，具体方法参考土壤线虫三种分离方法效率比较(毛小芳,李辉信,陈小云,胡锋.土壤线虫三种分离方法效率比较[j].生态学杂志,2004(03):149-151.)，对得到的线虫悬浮液进行拍照，如图4-1和5-1所述，悬浮液中杂质明显，且计数板内不容易计数。

本发明提供了一组提取土壤线虫的装置及提取方法，利用所述装置进行提取线虫时，悬浮液澄清，计数方便，有利于后续实验进行。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。