一种分离测定LCZ696及其杂质的方法与流程

本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种分离测定lcz696及其杂质的方法。
背景技术：
：lcz696是一种兼具血管紧张素受体阻断作用和中性肽链内切酶抑制剂双重作用(arb-nepi)的单分子前体药。口服给药后，lcz696释放血管紧张素受体阻断剂(arb)缬沙坦和中性肽链内切酶抑制剂(nepi)前体药物ahu377，后者随后转化为活性nep抑制剂lbq657。拟用于治疗高血压和心力衰竭。其分子式为c48h55n6o8.2.5(h2o).3na，化学名为：l-缬氨酸，n-(1-氧代戊基)-n[[2’-(2h-四唑-5-基)[1’1-联苯]基-4-基]甲基-，化合物，与α-乙基(αr,γs)-γ[(3-羧基-1-氧代丙基)氨基]-α-甲基-[1’1-联苯基]-4-戊酸酯，钠盐，水合物(2:2:6:5)结构式如式(a)所示。在合成该化合物的过程中，有几步重要的中间体和未知杂质可能会由于去除不完全而影响药物的纯度和质量，这些已知中间体和未知杂质以及产生的降解产物即为药物质量控制中通常所说的有关物质(即杂质)。对于lcz696的合成主要控制的已知杂质有二十一个，分别是：杂质sm1、杂质ipa、杂质ahud、杂质ipe、杂质ahue、杂质ipc、杂质val-2、杂质e-val-4-z、杂质val-c、杂质ahuf、杂质ahug、杂质ahuh、杂质ahui、杂质ahuj、杂质ahuk、杂质ahul、杂质ahum、杂质ahun、杂质ahuo、杂质ahup、杂质ahuq，结构式分别如式(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)所示。可见，lcz696的杂质较多，且结构类似，给分离带来难度。此外，各杂质的极性各不相同，在满足lcz696与各杂质分离的前提下，还要满足杂质与杂质之间的分离，导致检测难度较大。采用常规的检测手段方法难以实现lcz696与杂质以及杂质与杂质之间的有效分离，严重影响lcz696及其制剂的质量控制。为了准确地控制lcz696及制剂产品的质量，有必要研究一种能简单、快速、准确地分离检测出lcz696及其制剂有关物质的方法。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种分离测定lcz696及其杂质的方法，其操作简单、方便，可有效分离测定lcz696及其杂质，有效控制lcz696及其产品的质量。本发明的技术方案是：一种分离测定lcz696及其杂质的方法，具有以下步骤，1)制备试样溶液取lcz696或含有lcz696的制剂，加稀释剂溶解，得到浓度为0.1-10mg/ml的试样溶液；2)制备对照溶液取步骤1)得到的试样溶液，加稀释剂稀释50-1000倍，得到对照溶液；3)采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，设置流动相的流速为0.8-1.2ml/min，所述流动相由流动相a和流动相b组成，流动相a为浓度是0.0001-1.0mol/l的缓冲溶液，100体积份的缓冲溶液中添加有0.0001-10体积份的三乙胺，流动相b为乙腈-甲醇混合液，乙腈、甲醇的体积比为55-45:45-55，流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相a的体积百分数为58％～62％，流动相b的体积百分数为42％～38％；0分钟至20分钟，流动相a的体积百分数线性减少至42％～38％，流动相b的体积百分数线性增加至58％～62％；20分钟至50分钟，流动相a的体积百分数线性减少至22％～18％，流动相b的体积百分数线性增加至78％～82％；50分钟至55分钟，流动相a的体积百分数为22％～18％，流动相b的体积百分数为78％～82％；55分钟至55.1分钟，流动相a的体积百分数线性增加至58％～62％，流动相b的体积百分数线性减少至42％～38％；55.1分钟至60分钟，流动相a的体积百分数为58％～62％，流动相b的体积百分数为42％～38％；4)分别向高效液相色谱仪进样等体积的步骤1)试样溶液、步骤2)对照溶液，进样量为5μl-100μl，利用200nm至280nm波长检测，记录色谱图，完成试样溶液中杂质的分离测定。步骤1)、步骤2)所述稀释剂为甲醇和水的混合物，甲醇与水的体积比为65-95：35-5。甲醇与水的体积比为80：20。步骤3)中流动相a为浓度是0.001-0.01mol/l。步骤3)所述缓冲溶液为磷酸、或磷酸盐溶液或两者的混合物，磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二胺或任意混合，缓冲溶液的ph值为2.0-3.5。步骤3)流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相a的体积百分数为60％，流动相b的体积百分数为40％；0分钟至20分钟，流动相a的体积百分数线性减少至40％，流动相b的体积百分数线性增加至60％；20分钟至50分钟，流动相a的体积百分数线性减少至20％，流动相b的体积百分数线性增加至80％；50分钟至55分钟，流动相a的体积百分数为20％，流动相b的体积百分数为80％；55分钟至55.1分钟，流动相a的体积百分数线性增加至60％，流动相b的体积百分数线性减少至40％；55.1分钟至60分钟，流动相a的体积百分数为60％，流动相b的体积百分数为40％；步骤4)进样时，进样量为10μl，利用255nm波长检测，色谱柱的柱温为20-40℃。色谱柱的柱温为30℃。采用上述技术方案具有以下有益效果：1、本发明分离测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，采用梯度洗脱方式，确保能够使lcz696与杂质、杂质与杂质之间得到有效分离；100体积份的流动相a中添加0.0001-10体积份的三乙胺，有效改善了杂质的峰形，可以增强保留，改善分离度，确保色谱峰的良好对称性和较高的柱效。选用甲醇与水混合液作为稀释剂溶解样品，排除了溶剂峰的干扰和溶剂效应。2、本发明分离测定方法采用流动相a(缓冲溶液+三乙胺)、流动相b(乙腈+甲醇)梯度洗脱方式测定lcz696及其制剂的杂质，避免了传统的流动相采用一种有机相不能完全分离极性相似的杂质，可以有效将lcz696与已知杂质和未知杂质进行有效分离和测定，解决了分离测定lcz696与其杂质难分离的问题，从而保证了lcz696及其制剂的质量可控。3、本发明分离测定方法使用的稀释剂不干扰杂质测定，专属性强；各杂质灵敏度均符合要求。按加校正因子的自身对照法计算杂质含量，主峰与相邻杂质及相邻杂质间分离度均符合要求。本品及各杂质最小检测限为0.0006％，表明大于0.0006％的杂质均能被检出，准确度较高。下面结合附图和具体实施方式作进一步的说明。附图说明图1为实施例一甲醇-水混合液的液相色谱图；图2为实施例一混合对照溶液的液相色谱图；图3为实施例二试样溶液的液相色谱图；图4为实施例二对照溶液的液相色谱图；图5为实施例三试样溶液的液相色谱图；图6为实施例三对照溶液的液相色谱图；图7为实施例三空白辅料供试液的液相色谱图。具体实施方式仪器与条件高效液相色谱仪选用agilent1260型液相色谱仪及化学工作站，设置为自动进样。以zorbaxeclipseplusc18柱(3.5μm，100×4.6mm)为分离色谱柱。紫外检测器波长：255nm。流动相：以0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(100ml磷酸二氢钾溶液加入1ml三乙胺，用磷酸调为ph值为2.5)为流动相a，以甲醇-乙腈(体积比为50:50)为流动相b，进行梯度洗脱：0分钟，流动相a的体积百分数为60％，流动相b的体积百分数为40％；0分钟至20分钟，流动相a的体积百分数线性减少至40％，流动相b的体积百分数线性增加至60％；20分钟至50分钟，流动相a的体积百分数线性减少至20％，流动相b的体积百分数线性增加至80％；50分钟至55分钟，流动相a的体积百分数为20％，流动相b的体积百分数为80％；55分钟至55.1分钟，流动相a的体积百分数线性增加至60％，流动相b的体积百分数线性减少至40％；55.1分钟至60分钟，流动相a的体积百分数为60％，流动相b的体积百分数为40％。柱温为35℃，流速：0.6ml/min。进样体积为10μl。实施例一：分别取杂质sm1、杂质ipa、杂质ahud、杂质ipe、杂质ahue、杂质ipc、杂质val-2、杂质e-val-4-z、杂质val-c、杂质ahuf、杂质ahug、杂质ahuh、杂质ahui、杂质ahuj、杂质ahuk、杂质ahul、杂质ahum、杂质ahun、杂质ahuo、杂质ahup、杂质ahuq(各杂质的纯度均在99％以上)各20mg，精密称量，置于100ml量瓶中，加甲醇-水(体积比为80：20)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备液；取lcz696约100mg，精密称定，置于50ml量瓶中，精密加入杂质贮备液2.5ml，加甲醇-水(体积比为80：20)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照溶液。分别取稀释剂(甲醇：水＝80：20)、混合对照溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图，结果如图1、图2所示。图1表明，甲醇-水的混合物及色谱系统不干扰测定。图2中依次出峰的顺序是杂质val-2、杂质ipa、杂质ahue、杂质val-c、val、杂质ahuq、杂质ipe、杂质ahuh、杂质ahup、ahu377、杂质e-val-4-z、杂质ahuj、杂质ahud、杂质ahum、杂质ahun、杂质sm1、杂质ahuo、杂质ahug、杂质ahuk、杂质ahui、杂质ahul、杂质ahuf、杂质ipc。图2表明，本发明分离测定方法可以有效分离lcz696中可能存在的未知结构的杂质和已知结构的杂质，且各杂质检测灵敏度均能符合要求，主峰与相邻杂质及各杂质间的分离度均符合要求，即本方法可以用于lcz696及其制剂的杂质的测定。实施例二lcz696原料药(由重庆三圣实业股份有限公司提供)的测定取lcz696100mg，精密称定，置于50ml量瓶中，加甲醇-水(体积比为80：20)超声处理溶解并稀释至刻度，摇匀，作为试样溶液；精密量取试样溶液0.5ml，置于100ml量瓶，用甲醇-水(体积比为80：20)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；按实施例一的色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图。试样溶液的色谱图中如有杂质峰(除溶剂峰外)，按加校正因子的自身对照法计算杂质含量。结果如图3、图4所示。检测结果如表1：表1杂质名称含量(相对于缬沙坦计算)val-2未检出ipa未检出ahue0.035％val-c未检出ahuq未检出ipe0.015％ahuh未检出ahup未检出e-val-4-z未检出ahuj未检出ahud未检出ahum未检出ahun未检出sm1未检出ahuo未检出ahug0.020％ahuk未检出ahui未检出ahul未检出ahuf未检出ipc未检出总杂0.07％实施例三lcz696片(由重庆三圣实业股份有限公司提供)的测定取lcz696片适量(约相当于lcz696100mg)，置于50ml量瓶中，加甲醇-水(体积比为80：20)超声处理溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为试样溶液；精密量取试样溶液0.5ml，置于100ml量瓶，用甲醇-水(体积比为80：20)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另按lcz696片处方比例取空白辅料适量，照试样溶液相同的方法制备空白辅料供试液；按实施例一的色谱条件进行液相色谱分析。记录色谱图，结果如图5、图6、图7所示。采用加校正因子的自身对照法计算试品中各异构体杂质含量，检测结果如表2：表2杂质名称含量(相对于缬沙坦计算)val-2未检出ipa未检出ahue0.036％val-c未检出ahuq未检出ipe0.015％ahuh未检出ahup未检出e-val-4-z未检出ahuj未检出ahud0.003％ahum未检出ahun0.003％sm1未检出ahuo未检出ahug0.019％ahuk未检出ahui未检出ahul未检出ahuf未检出ipc未检出未知单个最大0.010％总杂0.11％当前第1页12