一种细胞蜡块定型固定板及用其制作细胞蜡块的方法与流程

本发明属于细胞病理学实验方法技术领域，涉及一种细胞蜡块制作器具及制作方法，具体涉及一种细胞蜡块定型固定板及用其制作细胞蜡块的方法。

背景技术：

细胞病理学是通过检测体液样本中细胞进行疾病诊断的临床病理学的重要分支学科，在疾病诊断，尤其是良恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断发挥着重要的作用。总所周知，在恶性肿瘤进展和侵袭转移中，常常会伴随出现不同程度的浆膜腔积液(如胸水、腹水等)，而采用细胞病理学技术从上述样本中检测恶性细胞和肿瘤特异性标志物成为进行肿瘤诊断和鉴别诊断的最重要、最有效的方法。同时，尿液、外周血以及肿瘤细针穿刺获得的穿刺物或囊液也是进行肿瘤诊断和鉴别诊断的常见细胞病理学检测样本。但是，由于体液样本中细胞数量有限，采用直接涂片、离心后沉淀物涂片或直接离心涂片等传统制片方法常常并不能获得足够数量的目的细胞，难以满足细胞学诊断对目标细胞数量的最低要求。而且，由于样本量有限，现有方法也只能制备少数几张涂片，难以进行多种染色和多个分子靶标的检测。虽然，离心后沉淀物涂片和直接离心涂片虽然能够在一定程度上提高目标细胞的数量和涂片质量，但仍不能解决细胞学制片数量有限，难以进行多种染色和多个分子靶标检测的问题。因而，直接影响到了细胞学涂片的质量和最终的诊断，导致阳性细胞检出率低、且假阴性率居高不下的局面长期难以改善。

因此，提高细胞学样本的制片质量成为细胞病理学面临的迫切技术问题。在很多年以前，人们就已认识到了这一问题，并提出将体液样本制备成细胞蜡块(cellblock，cb)的设想和方法，以达到富集体液样本中的目标细胞的目的(karnauchowpn,etal.1982.)(gillgw.2013)。

目前，细胞蜡块技术已成为处理体液样本的重要技术，其优点也日益显现(bhanvadiavm,etal.2014；thunnissene,etal.2012；隋燕霞,等.2017；徐小艳,等.2015；rahbarm,etal.2012；azamis,etal.2016)。与传统的细胞学制片方法相比，细胞蜡块技术克服了传统细胞学涂片细胞数量少、厚薄不一、细胞重叠、结构不清，只能制备少数涂片、敏感性低、假阴性率高、难以进行多种染色和多个分子靶标检测的缺点，不仅能获得更多的目的细胞，且经固定、脱水处理的切片细胞结构更为清晰，在最大程度上提高了细胞学样本的制片质量和诊断的敏感性、特异性、准确性，并部分达到了组织病理学诊断的水平，成为一种介于传统脱落细胞学和组织病理学之间的体液样本制片方法。尤其是获得的细胞蜡块还能经切片获得数十张连续切片，可同时采用多种染色方法和对多种分子靶标的检测，为肿瘤分子诊断、预后监测、治疗方案选择提供了更为可靠的实验室证据。此外，细胞蜡块可以长期保存、有助于对患者进行随访和回顾性研究。

目前，细胞蜡块技术已成为处理各类体液样本的常规技术，并陆续有学者研究提出蛋清法(孙武刚.2017)、琼脂法(ardenghj,etal.2007)、明胶海绵(郭秀云,等.2013)和细胞离心管法(何洪敏,等.2013；何洪敏,cn103543057a[p].2014)等多种细胞蜡块制作方法：

(1)对于细胞成分比较丰富的体液样本，采用直接离心沉淀法即可获得较多数量的脱落细胞沉淀物，加入固定液直接固定后，常可使细胞沉淀凝结成团，用擦镜纸或其它非脂溶性透水膜包裹放入包埋盒中，按照常规组织样本脱水、浸蜡、石蜡包埋，即可制作出细胞蜡块(顾维娜,等.2015)。

(2)对于目的细胞数量较少的体液样本，常规离心沉淀法并不能使细胞沉淀物凝结成团，且很容易在后续操作中散开，无法制作出符合要求的细胞蜡块。为此，有学者加入蛋清(杜萍,等.2014)或者琼脂凝胶作为细胞粘附基质，以增强凝集成块的效果(王永生，等.2006)，再经固定液固定，擦镜纸或其它非脂溶性透水膜包裹放入包埋盒中，按照常规组织样本脱水、浸蜡、石蜡包埋，即可制作出细胞蜡块。

但是，单纯使用蛋清或琼脂并不能很好地解决细胞沉淀物凝结不牢固、在后续操作中易于散开、导致细胞蜡块制作质量不高甚至失败的难题。而且，采用琼脂凝胶还需在制作过程中对琼脂进行加热才能熔化，不仅操作不便，加热过程还有可能对细胞形态、结构和功能造成不可逆的损伤，直接影响后期的镜下观察和最终诊断。

因此，也有人采用细胞离心管技术和“乙醇--吸管”法(程凯,等.2017)获取细胞沉淀经固定后制作细胞蜡块(吴菡,等.2015)。但是，该方法仅能使细胞沉淀聚集，细胞凝结并不牢固，很容易在后续操作中散开。

再者，还有学者利用不同固定剂的特征，通过改良固定剂和固定时间以期提高细胞沉淀物凝结成团的效果(赵洁,等.2013；荣辉,等.2014；侯芳,等.2017.)。例如，有学者选择10％乙醇-乙酸酸甲醛制剂、aaf(95％乙醇34ml+冰醋酸2毫升+福尔马林4毫升)、9％的乙醇+40％的甲醛、100％乙醇和10％的甲醛等量混合液、bouin溶液(饱和的酸+冰醋酸+福尔马林)作为固定剂来制作细胞蜡块，或者用福尔马林或异丙醇蒸汽进行固定(frederickm,etal.2010)，至少固定2小时(vinayakamurthys,etal.2016)。

虽然传统的细胞蜡块制备方法也能制备出相应的细胞蜡块。但并不能从根本上上解决离心后细胞沉淀物内细胞间粘附不牢固，在后续操作中易于散开的关键问题。此外，琼脂糖等添加剂还需在操作过程进行加热，还会对样本产生不可预期的不良影响。

因此，摸索新的细胞蜡块制备方法，在不影响细胞形态、功能及后续分子靶标检测的前提下，增强细胞沉淀物凝结成团的牢固性，是目前细胞蜡块制备面临的关键问题，而且具有重要临床医学价值和经济意义。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种细胞蜡块定型固定板及用其制作细胞蜡块的方法，该细胞蜡块定型固定板结构设计合理，使用方便，能够实现细胞沉淀物的良好塑型固定；该细胞蜡块制作方法操作简单，能够使细胞沉淀物以近似规整的形态被包埋于石蜡块中。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种细胞蜡块定型固定板，包括定型固定板，在定型固定板上开设有若干定型固定孔；

定型固定孔为柱形孔，底部平整或底部呈u型，用于盛装细胞沉淀物；

定型固定孔的直径、孔深均可调。

优选地，所述定型固定孔在定型固定板上呈阵列分布。

优选地，所述定型固定孔(1)的直径为3～10mm，深度为5～15mm。

本发明还公开了一种细胞蜡块的制作方法，该方法基于上述的细胞蜡块定型固定板实现，包括以下步骤：

1)样本前处理

将待制备的样本液体静置，获得细胞沉淀，离心处理，去上清液获得细胞沉淀物，将该细胞沉淀物转移至定型固定板上开设的定型固定孔中；

2)添加增稠剂

根据步骤1)获得的细胞沉淀物的体积，按照1：0.5～1的体积比，向细胞沉淀物所在的定型固定孔中加入水性增稠剂蛋白水溶液，充分混匀；

3)制作细胞蜡块

向添加有水性增稠剂蛋白水溶液的定型固定孔中加入95％酒精，静置处理，直至观察细胞沉淀物凝结成团，然后用擦镜纸或非脂溶性透水膜包裹，置于包埋盒中进行固定处理，最后将固定好的细胞沉淀物样本经脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋处理，制得细胞蜡块。

优选地，步骤2)中，水性增稠剂蛋白水溶液是将0.2～5g水性增稠剂和5～10g辅助蛋白溶于100mlpbs缓冲液中配制而成。

优选地，所述水性增稠剂为黄原胶、藻蛋白酸钠、果胶、藻蛋白酸丙二酯、羧甲基纤维素、阿拉伯树胶和瓜尔豆胶中的一种或几种。

优选地，所述辅助蛋白采用卵清蛋白或牛血清白蛋白。

优选地，根据含有水性增稠剂蛋白水溶液的细胞沉淀物的体积，按照1:5～10的体积比，缓慢加入95％酒精，静置10～15分钟进行预固定。

优选地，步骤3)中，在盛有10％中性福尔马林固定液的固定缸内固定处理4～24小时。

优选地，还包括将获得的细胞蜡块切片处理制得石蜡切片的操作；

所得石蜡切片，用于观察细胞结构和检测特异性分子靶标，或用于提取蛋白、核酸类分子进行相应的检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的定型固定板可以实现对细胞沉淀物的良好塑型固定，而且该器具结构简单、使用方便，实验结果证实，采用本发明提供的方法和器具制备的细胞蜡块，细胞沉淀物凝结紧密，在后续操作中不易出现散裂、破碎的现象。

本发明提供的细胞蜡块制作方法简单，使得细胞沉淀物能以大致规整的形态被包埋于石蜡块中。同时，本发明利用了水性增稠剂良好的悬浮固体物质、增加溶液粘稠度的特性，且对温度、酸、碱、盐、氧化剂和蛋白酶稳定，易溶于水和不溶于酒精的特点，将其配制成增稠剂蛋白水溶液，并以酒精作为预固定剂，很好地解决了传统细胞蜡块制备方法中细胞沉淀物凝结效果不好，容易在后续操作中碎裂、导致细胞蜡块制作失败的缺点。

本发明通过具体的实验证明，本方法制备的细胞蜡块对细胞结构和后续分子靶标检测无任何影响，也不影响后续实验对分子靶标的检测。而且，该方法操作简单、成本低廉，由此细胞蜡块制备的石蜡切片，经he染色后，细胞形态完整、亚细胞结构清晰，易于判读，免疫组织化学染色和原位杂交检测结果也均可获得满意的检测结果。因此，本发明提供的方法和器具很好的解决了现有细胞蜡块制备方法中的关键性技术问题，能在一定程度上达到组织病理学切片的水平，完全满足细胞病理学诊断和分子靶标检测的需要。

附图说明

图1为本发明的细胞蜡块定型固定板的结构示意图；

图2为本发明的细胞蜡块定型固定板剖面结构示意图；

图3为经固定放入包埋盒内的细胞沉淀物凝结团照片；

图4为制备好的细胞蜡块及相应的石蜡切片；

图5为采用本发明方法和传统方法制作的细胞团完整性比较结果照片；

图6为采用本发明方法和传统方法制作的细胞蜡块完整性比较结果照片；

图7为采用本发明方法和传统方法制作的细胞蜡块切片的完整性比较结果照片；

图8为采用免疫组化方法比较不同方法制作的细胞蜡块中ca125的表达结果。

其中：1-定型固定板；2-定性固定孔。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

1、细胞蜡块制作器具

参见图1，为本发明的一种细胞蜡块制作器具，即细胞蜡块固定板，包括定型固定板1，定型固定板1上密布有若干定型固定孔2，所述定型固定孔2为圆柱形孔，且底部平整。或者定型固定孔2呈u型，定型固定孔2的直径和深度均可调，根据实际需要调整尺寸。

建议定型固定孔2的直径为3～10mm，深度为5～15mm。

所述细胞蜡块固定板能够根据材质的不同，采用注塑、吹塑或钻孔等工艺加工而成。

2、主要试剂和材料

配制含有适量增稠剂和辅助蛋白的增稠剂蛋白水溶液。

其中，所使用的增稠剂可以是黄原胶、藻蛋白酸钠、果胶、藻蛋白酸丙二酯、羧甲基纤维素、阿拉伯树胶和瓜尔豆胶中的一种或多种，优选黄原胶。

所使用的辅助蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。

增稠剂蛋白水溶液采用如下方法配制：先采用pbs缓冲液溶解辅助蛋白，配制成终浓度为5％～10％的辅助蛋白溶液，再用该辅助蛋白溶液溶解增稠剂配制成增稠剂蛋白水溶液，增稠剂蛋白水溶液中增稠剂终浓度为0.1％～2.0％。

3、细胞蜡块的制作方法和流程

(1)体液样本的前处理

按照送检的胸腹水、尿液等各种体液样本的体积，选择合适大小的离心管和相应细胞离心机，以1000～3000r/min离心10～15min，弃上清后，获得含有细胞的沉淀物，将该沉淀物留在离心管内或者将其用吸管转移至定型固定板1上的尺寸合适的定型固定孔2内。

(2)增稠剂蛋白水溶液的添加

按照离心管或定型固定孔内沉淀物的体积，并按照沉淀物的体积比(1:0.5～1)加入上述配制好的增稠剂蛋白溶液并混匀。

(3)样本的固定

1)预固定：依据离心管或定型固定孔内待固定沉淀物的体积，按照1:5～10的体积比沿定型固定孔内边缘缓慢加入95％酒精，静置固定10～15分钟至细胞沉淀物凝结成团。

2)固定：将离心管或定型固定孔内凝结成团的细胞沉淀物用擦镜纸或其他非脂溶性透水薄膜包裹后再放入常规带盖的一次性活检标本包埋盒内，并进行编号记录，然后将其放入盛有足量10％中性福尔马林固定液(按照被固定物的体积与固定液的体积比为1:5～10)的固定容器内，固定4～24小时，结果如图3所示。

(4)脱水和包埋

将经良好固定的细胞凝结物按照常规活检组织脱水、浸蜡、透明、包埋程序处理，进行石蜡包埋，即可制获得细胞蜡块，再经常规的切片处理，获得的细胞切片，结果如图4。

4、本发明方法与传统方法制作的细胞蜡块的完整性比较实验

选择送检的胸腹水量大于100ml以上的样本35例，同时采用本发明方法和传统离心沉淀法分别制作细胞蜡块，并从制作的细胞团、细胞蜡块、he切片的大体形态、细胞结构以及检测蛋白的亚细胞定位等方法进行比较，分析本发明方法的特点。

具体实验条件和方法如下：先分别取等量(50ml)胸腹水样本倒入两支细胞离心管中进行离心(2000转/分钟)15分钟后弃上清，其中，一份样本按照本发明的方法将该沉淀物留用吸管转移至定型固定板1上的尺寸合适的定型固定孔2内再依次加入等体积增稠剂蛋白溶液并混匀，然后用95％酒精静置预固定10分钟，再加入足量10％中性福尔马林固定液固定4小时；另一份样本按按照传统离心法直接沿离心管壁加入足量10％中性福尔马林固定液固定4小时。然后将经两种方法固定后的细胞团分别用镊子小心转移至相应编号的包埋盒内进行脱水、浸蜡、透明、包埋，即可制获得细胞蜡块，再经常规的石蜡切片和he染色，获得的细胞切片。同时采用免疫组化法检测ca125在胸腹水样本中的表达。结果如图4。

完整性比较主要体现在细胞团、细胞蜡块、he切片以及检测蛋白表达等方面，结果显示如下：

1)细胞团

如图5所示，图5中a-j：采用本发明提供的方法制备的细胞团，k-l：采用传统离心沉淀法制作的细胞团，可以看出，采用传统离心沉淀法制作的细胞团松散，难以凝结成团，而采用本发明的方法制得的细胞团粘合紧密。

2)细胞蜡块

如图6所示，图6中a-d：传统离心沉淀方法制作的细胞蜡块；e-h：采用本发明提供的方法制备的细胞蜡块，可以看出，传统离心沉淀法制得的细胞团松散，而采用本发明方法制得的细胞团粘合紧密，结构完整。

3)he切片

如图7所示，图7中a：传统离心沉淀法制作的细胞蜡块的he切片，b：采用该发明提供的方法制备的细胞蜡块，可以看出，传统离心沉淀法制备的he切片细胞松散，难以形成完整的结构；而采用本发明制备的he切片显示细胞团粘合紧密，结构完整。

4)ca125的表达

如图8所示，图8中a：传统离心沉淀法制作的细胞蜡块，ca125蛋白表达于细胞浆，但细胞结构不清晰，细胞膜不完整。b采用本发明提供的方法制备的细胞蜡块，ca125蛋白表达于细胞浆，细胞结构清晰，细胞膜完整。

5.细胞蜡块的应用

采用石蜡切片机对按照本发明提供的方法制备好的细胞蜡块进行切片，即可获得所需的石蜡切片，该石蜡切片可用于he染色、特殊染色以及采用免疫组织化学、原位杂交等原位组织细胞学方法检测蛋白、核酸类分子靶标。

综上所述，本发明设计了专门用于对细胞沉淀物进行塑形固定的定型固定板，并利用水性增稠剂，尤其是黄原胶的生物学特性，并将其与卵清蛋白或牛血清白蛋白配制成水性增稠剂蛋白水溶液，以等体积比加入到细胞沉淀物中混匀后以95％酒精作为预固定剂进行预固定，使得细胞沉淀物凝结成团，再用10％中性福尔马林作为固定液进行固定，最后经脱水、浸蜡、包埋，即可获得细胞蜡块。该方法从根本上解决了传统细胞蜡块制备方法使细胞沉淀物凝结不良，在后续操作中易于散裂的缺点。同时，所用的黄原胶等增稠剂和辅助蛋白在细胞蜡块制备中不会对细胞的形态和结果产生任何不良影响，同时，也不影响后续实验对分子靶标的检测。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。