本发明涉及医学病理检测技术领域，特别是一种术中冰冻切片免疫组化染色方法。
背景技术：
术中冰冻快速病理是在病人手术期间对其切除的小部分组织镜下冰冻切片，快速给予初步病理诊断(<30min)，初步病理诊断将指导医生下一步手术治疗方案，具有重要的临床价值。然而冰冻诊断具有一定局限性，不少肿瘤诊断仅依靠术中冰冻染色技术不能明确诊断，需要待术后石蜡标本免疫组化检查方可明确诊断，对这种情况，术中快速冰冻病理诊断就丧失了其指定手术治疗方案的临床价值。若能在快速冰冻病理诊断过程中快速获得可靠的免疫组化染色结果将大大提高快速冰冻病理诊断的临床价值。
随着免疫组化技术的不断改进，免疫组化染色的质量不断提高，为手术中同时进行冷冻切片快速免疫组化染色提供可能性，提供快速病理诊断增加手术操作性。如何能快速、便捷的在术中获得可靠的实验结果，是临床应用的关键点。在免疫组化染色过程中，一般需要将组织和细胞的原有结构尽可能完整的保存下来地固定细胞，避免组织和细胞发生降解、自溶和变形等，使细胞和组织内各种酶失去活性等；但是固定细胞在染色过程中占据一定时间且部分固定液会造成细胞收缩、对抗原损害、对蛋白质有破坏等问题。
技术实现要素：
为了克服现有技术的上述缺点，本发明的目的是提供一种术中快速冰冻切片免疫组化染色方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种术中快速冰冻切片免疫组化染色方法,包括以下步骤：
(1)将标本放在冷冻切片机内冰冻后切片，切片厚度为5μm，粘贴在载玻片1/3与2/3之间，空气干燥25～35s；
(2)滴加一抗在40℃下孵育4min；
(3)用pbs清洗三次，每次4～7s；
(4)滴加二抗在40℃下孵育4min；
(5)用pbs清洗三次，每次4～7s；
(6)滴加dab试剂，显色1～2mim；
(7)用苏木素染液染色3～10s。
作为本发明的进一步改进：所述步骤(1)中采用冰冻切片技术，避免石蜡切片存在的抗原修复问题，冷冻切片组织新鲜，没有进行化学处理，不存在抗原封闭途径，因此也不需要做抗原修复。
作为本发明的进一步改进：所述步骤(1)中标本取材不宜太大太厚，否则冰冻费时，太大难以切片，标本长宽不超2.5cm为宜，高不超3mm。
作为本发明的进一步改进：所述步骤(1)中标本不需要进行固定，不需要镜下内源性阻断，节约实验时间同时保证结果更可靠及稳定。
作为本发明的进一步改进：还包括苏木素染液染色后用流水冲洗反蓝,冲洗时间为10s，冲洗后用中性树胶封片。
作为本发明的进一步改进：所述步骤(2)和步骤(4)在恒温箱内进行孵育，恒温箱恒定温度为40℃。偏高的温度加快了反应时间，缩短实验时间。
作为本发明的进一步改进：所述步骤(2)中一抗为ck、cd20、cd79a、cd163、cd68、gfap、plap、sall-4、cd117、h3k27m、sstr2a、stat-6、s-100、syn、cd34、braf、ck19、tpo、glectin-3、d2-40、inhibin-a其中一种。
作为本发明的进一步改进：所述步骤(3)和步骤(5)中清洗时间为5s。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：染色过程免固定，免内源性阻断，提高孵育温度，加快反应时间，与石蜡免疫组化结果有较好的重复性和可比性，缩短实验过程时间，免去可省略步骤缩短染色时间，在时限上使免疫组化染色协助术中快速冰冻切片病理诊断提供可能性，提高冰冻病理诊断的准确度。
具体实施方式
现结合实施例对本发明进一步说明：一种术中快速冰冻切片免疫组化染色方法，包括以下步骤：
(1)将标本放在冷冻切片机内冰冻后切片，切片厚度为5μm，粘贴在载玻片1/3与2/3之间，空气干燥25～35s；
(2)滴加一抗在40℃下孵育4min；
(3)用pbs清洗三次，每次4～7s；
(4)滴加二抗在40℃下孵育4min；
(5)用pbs清洗三次，每次4～7s；
(6)滴加dab试剂，显色1～2mim；
(7)用苏木素染液染色3～10s。
(8)用流水冲洗反蓝10s，冲洗后用中性树胶封片。
所述步骤(2)中一抗为ck、cd20、cd79a、cd163、cd68、gfap、plap、sall-4、cd117、h3k27m、sstr2a、stat-6、s-100、syn、cd34、braf、ck19、tpo、glectin-3、d2-40、inhibin-a等其中一种。
作为本发明的进一步改进：所述步骤(2)和步骤(4)在恒温箱内进行孵育，恒温箱恒定温度为40℃。
对比案例一：
(1)取新鲜组织置于恒冷切片机上，冷冻后切片，切片厚度6μm；
(2)将冷冻切片裱在载玻片上，空气干燥30s；
(3)用95％酒精固定2min；
(4)用pbs冲洗三次，每次30s；
(5)滴加一抗在37℃温箱孵育5min后用pbs冲洗三次，每次10s；
(6)加入聚合物增强剂在37℃温箱孵育5min后用pbs冲洗三次，每次10s；
(7)滴加二抗在37℃温箱孵育5min后用pbs冲洗三次，每次10s；
(8)滴加dab试剂在37℃下染色1min，双蒸水冲洗三次，每次5s；
(9)用苏木素染液复染15s，用45℃水返蓝15s，封片观察。
对比案例二：
(1)取新鲜组织置于恒冷切片机上，冷冻后切片，切片厚度5μm；
(2)将冷冻切片贴在涂有l-多聚赖氨酸防脱片剂的载玻片上；
(3)将切片放置在丙酮中固定1min，用pbs冲洗三次，每次10s；
(4)滴加3％过氧化氢，放入孵育盒内加盖后置于微波炉中微波低档作用1min后用pbs冲洗三次，每次10s；
(5)滴加血清，放入孵育盒内加盖后置于微波炉中微波低档作用5min；
(6)滴加一抗，放入孵育盒内加盖后置于微波炉中微波低档作用8min后，用pbs冲洗三次，每次10s；
(7)滴加二抗，放入孵育盒内加盖后置于微波炉中微波低档作用5min后，用pbs冲洗三次，每次10s；
(8)滴加dab试剂在37℃下染色30s；
(9)用苏木素染液复染后烘干，中性树胶封片。
实施案例一：
(1)将冰冻后的标本在冷冻切片机内切片，切片厚度为5um，粘贴在载玻片1/3与2/3之间，空气干燥30s；
(2)滴加一抗在40℃恒温箱下孵育4min；
(3)用pbs清洗三次，每次5s；
(4)滴加二抗在40℃恒温箱下孵育4min；
(5)用pbs清洗三次，每次5s；
(6)滴加dab试剂，显色1mim；
(7)用苏木素染液染色5s；
(8)流水冲洗10s，用中性树胶封片。
实施案例二：
(1)将冰冻后的标本在冷冻切片机内切片，切片厚度为5um，粘贴在载玻片1/3与2/3之间，空气干燥30s；
(2)滴加一抗在40℃恒温箱下孵育4min；
(3)用pbs清洗三次，每次5s；
(4)滴加二抗在40℃恒温箱下孵育4min；
(5)用pbs清洗三次，每次5s；
(6)滴加dab试剂，显色90s；
(7)用苏木素染液染色8s；
(8)流水冲洗10s，用中性树胶封片。
由对比案例与实施案例对比得，本发明免固定快速免疫组化染色方法步骤简单，耗时较短，对比案例一中完整染色流程耗时22min，对比案例二中染色流程耗时22min30s，而本发明染色流程耗时12min，步骤简单，免去可省略步骤。
本发明对新鲜标本进行免疫组化染色，免固定、免内源性阻断，含一抗、二抗反应及苏木素染液染色和中性树胶封片，实验时间共计12分钟，在保证实验结果的同时大大缩短实验时间，从时间上为免疫组化染色协助术中冰冻诊断提供可能性。
本发明的主要功能：染色过程免固定，免内源性阻断，提高孵育温度，加快反应时间，与石蜡免疫组化结果有较好的重复性和可比性，缩短实验过程时间，在时限上使免疫组化染色协助术中快速冰冻切片病理诊断提供可能性，提高冰冻病理诊断的准确度。
综上所述，本领域的普通技术人员阅读本发明文件后，根据本发明的技术方案和技术构思无需创造性脑力劳动而作出其他各种相应的变换方案，均属于本发明所保护的范围。