一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，包括：载玻片洁净处理，然后取洁净的载玻片，朝上面标记，滴加200ul浓度为0.lmg/ml多聚赖氨酸工作液；另取载玻片标记面向下，在注有溶液的载玻片上从一端相互反向将溶液推向另一端，直至标记处停止，平放，烘干，干燥后分开，得到防脱玻片；用冰冻切片包埋剂预先浸润组织表面，固定到切片托上，冷冻腔放置，待组织块至表面白色，全部冷冻后放入切片机冷冻夹上进行切片，即得。本发明中玻片易于标准化制作，操作简单，节约试剂，切片制作参数固定，特征明显，易于学习。
【专利说明】-种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于冰冻切片的制备领域，特别涉及一种microRNA原位杂交的冰冻切片 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 载玻片洁净处理（陈志忠，陈小岩，陈冰，陈惠玉等·介绍一种免疫组化染色防脱 片制作方法[J]·诊断病理学杂志· 2011. 18(6) :479-479),将载玻片无规则散放入专用桶， 经3%加酶洗衣粉溶液浸泡12-24h，适当震荡2-3次；流水冲洗至不再产生泡沫。蒸馏水冲 洗>5次，至无群集泡沫产生.沥干后入95%乙醇4-8h，取出置60%烤箱中烤千备用。
[0003] 制备防脱片剂工作液，现有的防脱片剂包括多聚赖氨酸和APES，将防脱片剂原液 与蒸馏水按一定比例配制成工作液，储备于染色缸中备用。防脱片制作，戴塑料薄膜手套 取出洁净后的载玻片，逐片竖直放入多聚赖氨酸工作液中，以相邻的载玻片之间不存气泡 和间隙为标准，转入若千片后一齐层叠取出，并让层叠玻片外缘的工作液流千，然后玻片 面向上平放入塑料平底容器，以相叠的玻片间不存气泡和间隙为标准.将盛片容器平稳放 于60°C烤箱中，烤片8-24h，烤千即可取出冷却。
[0004] 现有方法缺点：1、玻璃表面凹凸不平，其表面层的厚度和表面粗糙度大（张功 学，方淑玲，郭世安，丁凯，等·一种节约型叠加法防脱玻片的制作方法[J]·中国民 族民间医药.2009. 24. (1) :202-202)，因多聚赖氨酸防脱片剂是水溶性溶液，故载玻片 上杂质油脂如不去除干净，会成为载玻片表面与多聚赖氨酸防脱片剂间的接触障碍（徐 婷，钟声旺，邱冬梅，等.改良多聚-L-赖氨酸法防脱片载玻片的制备□?南通大学学 报.2011. 31 (4) :311-312)，现有的方法只用洗衣粉和无水乙醇处理玻片，这样很难保证后 续玻片涂胶质量。
[0005] RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶，除细胞内RNA酶外，环境中的灰尘、各种实 验器皿和试剂、人类皮肤的汗液、唾液中均存在RNA酶，且RNA酶耐热、耐酸碱，煮沸也不能 使之完全失活,蛋白变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。所以在进行 关于RNA实验操作中须避免外源性RNA酶的污染，现有方法并没有关于灭活外源性RNA酶 的相关步骤。
[0006] 现有的方法中常用的浸泡法，不仅试剂用量大，而且由于玻片在浸泡时堆放叠 压，易使溶液涂布不均，即使一张一张地将玻片从多聚赖氨酸浸泡液中提出，玻片表面溶 液呈水膜状，但在沥千或晾千的过程中，由于液体的分子热运动和表面张力作用，会使黏 附剂溶液不断移动，面积缩小，玻片干燥后，留下不均匀分布的斑块状黏附剂痕迹，影响 防脱片效果。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方 法，本发明玻片易于标准化制作，操作简单，节约试剂。
[0008] 本发明的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，包括：
[0009] (1)将载玻片浸入水中，捞出后加入热的洗衣粉水溶液中，热闷0. 5-lh，然后冲 洗，浙千，浸入乙醇中过夜，冲洗，进入重铬酸钾洗液中过夜，冲洗，洗涤，烘干，进行热处理， 得到洁净的载玻片；
[0010] (2)取洁净的载玻片，朝上面标记，滴加200ul浓度为〇· lmg/ml多聚赖氨酸工作 液；另取载玻片标记面向下，在注有溶液的载玻片上从一端相互反向将溶液推向另一端，直 至标记处停止，平放，烘干，干燥后分开，得到防脱玻片；
[0011] (3)预先用冰冻切片包埋剂-OCT (optinum cutting temperature compound)浸 润组织，固定到切片托上，冷冻腔放置，待组织块至表面白色，全部冷冻后放入切片机冷冻 夹上进行切片，即得。
[0012] 所述步骤（1)中冲洗为流水冲洗，冲洗时间均为5-15min。
[0013] 所述步骤（1)中洗衣粉水溶液的质量百分浓度为5-8% ;乙醇为无水乙醇。
[0014] 所述步骤⑴中热的洗衣粉水溶液的温度为80-100?。
[0015] 所述步骤（1)中重铬酸钾洗液的为重铬酸钾、灭菌水、浓硫酸的混合溶液，其中重 铬酸钾、灭菌水、浓硫酸的比例为20g :40ml :500ml。
[0016] 所述步骤（1)中热处理在实验室用热风循环烘箱中完成，温度为160°C -180°C，处 理时间为5h-6h。
[0017] 所述步骤（2)中多聚赖氨酸工作液的配制为：配制lmg/ml的多聚赖氨酸母液， 0. 22um除菌滤膜过滤，分装后，-20?避光保存；取出多聚赖氨酸母液与灭菌水按1:9比例 配制成〇. lmg/ml多聚赖氨酸工作液。
[0018] 所述步骤（2)中滴加用移液枪（配去除RNA酶的进口枪头）吸取2〇Oul多聚赖氨 酸工作液，浓度为〇· lmg/ml，滴加到载玻片上。
[0019] 所述步骤（2)中烘干温度为3〇_40°C。
[0020] 所述步骤（2)中切片的具体工艺参数为：冷冻腔-2〇°C，冷冻摇臂-2 5°C，切片厚度 20um，冷冻腔放置时间为3〇_6〇min。
[0021] 所述步骤（2)所得冰冻切片保存在-80°C。
[0022] 所述步骤⑶中包埋剂选用美国进口 SAKURA Tlssue-I^fcilO· C_ Τ· Compound (Order Number 4583)冰冻切片包埋剂。包埋剂（〇CT)是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合 物，目前已广泛用于免疫组化实验室中，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连 续性，减少皱折及碎裂。又因0CT混合物为水溶性，故在漂片时可溶于水，所以在以后的染 色中不会增加背景染色。
[0023] 原位杂交技术以其高的敏感性和特异性等优点，广泛用于基因分析和诊断方面的 定性、定位和定量分析，但是对于用原位杂交方法检测的 microRNA本底含量本身就很低的 情况，有效的抑制RNA酶活性是要解决的首要任务，并且原位杂交过程步骤多、切片经高温 孵育和缓冲液的长时间浸泡后，往往会部分或全部从载玻片上脱落，这就进一步要求提高 组织切片对物理化学的耐受能力，否则产生组织脱片，造成人力物力的损耗并延长，因而影 响整个实验的进度。购置商品化的防脱载玻片费用较高。本发明建立了一种用于microRNA 原位杂交实验的多聚赖氨酸防脱片载玻片的制备方法，其效果较好。
[0024] 制作防脱玻片的首要工作就是要彻底清除载波片上的杂质灰尘及油脂，除了热的 碱性洗涤液达到除脂去污的双重作用，随后用无水乙醇处理，降低表面粗糙度，加强脱脂。 然后再用重铬酸钾过夜处理载玻片，尽可能去除残留杂质及各种粘附污染物，进一步的改 善载玻片表面的光学性，否则载玻片上的杂质会使多聚赖氨酸水膜在不均匀的表面张力作 用下产生不均匀分布，达不到防脱的效果。
[0025] 用于microRNA原位杂交的玻片除了涂布多聚赖氨酸，使其分子中的阳离子基团 与组织上的阴离子紧密结合达到防脱效果外，还要注意灭活RNA酶，保证实验的准确性。 RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶，耐热、耐酸碱，DEPC或高温处理都能使其失活，但是 DEPC有很强的吸入毒性，本发明选用180°C高温加热6h达到灭活玻片表面RNA酶的预期效 果。
[0026] 在DNA/RNA away擦拭的通风处内涂布多聚赖氨酸，用无 DNA/RNA酶枪头吸取 0· lmg/ml多聚赖氨酸溶液，在每张玻片上注200ul。另取玻片标记面向下，在注有溶液的玻 片上从一端反向将溶液推向另一端，直至标记处停止。此时溶液在两玻片之间均匀分布， 无气泡和空隙。将夹有多聚赖氨酸的两玻片平放，40Γ烤箱内烘干后，千燥后分开。此法能 延长防脱片剂在载玻片有效贴片表面的滞留时间及扩大有效粘附面积，不会产生盲区，达 到更高效的防脱作用。-80?保存玻片，能有效的延长防脱片剂的保质期。
[0027] 有益效里
[0028] (1)未经酸碱洗涤的玻璃表面凹凸不平，其表面层的厚度和表面粗糙度大，本方法 能有效的去除表面残留杂质及各种吸附污染物，从而使其表面粗糙度进一步降低，最终使 玻璃表面层的杂质厚度下降到最小，这样就为防脱片剂的涂胶与载玻片表面的连接提供了 可靠保证；
[0029] (2)未选用高毒性的DEPC试剂，仅用实验室常用仪器-烘箱，在其能达到的温度范 围内，有效地去除玻片上的外源RNA酶，并通过细节注意，避免了操作环境中的RNA酶；
[0030] (3)采用多聚赖氨酸载玻片的夹心的方法，可使多聚赖氨酸涂布均匀，玻片透明度 好，保证不产生气泡及白色结晶，也不会存在多聚赖氨酸分子涂布盲区；
[0031] (4) -般玻片只使用一面，所以仅一面涂布防脱剂在满足实验要求的前提下，能节 省试剂，所以玻片一面贴标记胶纸既方便辨识有效防脱面又方便记录样品特征；
[0032] (5)组织黏附于玻片后完全可以耐受多重物理化学环境剧变，可运用于冰冻切片 的原位杂交以及常规免疫组化；
[0033] (6)玻片易于标准化制作，操作简单，节约试剂；
[0034] (7)切片制作参数固定，特征明显，易于学习。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1为制作后的防脱玻片其中A为正面（即使用面），B为反面；
[0036]图2为使用自制防脱玻片用于原位杂交实验，其中A为原位杂交实验之前；B为原 位杂交实验之后。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0038] 实施例1 [0039] 1、防脱玻片清洗：
[0040] 1)、将载玻片依次投入盛有水的塑料盆中，使载玻片表面和水充分接触。
[0041] 2)、将载玻片捞出，投入热的5%洗衣粉水溶液中，热闷lh。
[0042] 3)、逐个拿出载玻片擦干，取出流水洗10min。
[0043] 4)、沥干，无水乙醇过夜。
[0044] 5)、制备重铬酸钾洗液
[0045] 重铬酸钾20g
[0046]灭菌水 40ml [0047]浓硫酸 500ml
[0048]先用灭菌水将重铬酸钾溶解，缓慢加入浓硫酸，充分搅拌。
[0049] 6)、从无水乙醇中捞出载玻片，流水冲洗l〇min。
[0050] 7)、投入重铬酸钾洗液中过夜。
[0051] 8)、流水洗 lOmin。
[0052] 9)、蒸馏水二次洗涤，烘箱烘千。
[0053] 10)180。〇处理611。
[0054] 2、多聚赖氨酸配制
[0055] 1)、配制lmg/ml的多聚赖氨酸母液，0· 22um除菌滤膜过滤，分装到EP管中，-20°c 避光保存。
[0056] 2)、取出多聚赖氨酸母液1ml与灭菌水按1:9比例配制成工作液。
[0057] 3、防脱玻片的制作
[0058] 1)取出洁净的载玻片后，面朝上贴标记胶纸，用移液枪配进口去除RNA酶枪头吸 取0· lmg/ml多聚赖氨酸工作溶液，在每张玻片上注200ul。另取玻片标记面向下，在注有 溶液的玻片上从一端相互反向将溶液推向另一端，直至标记处停止。
[0059] 2)将夹有多聚赖氨酸的两玻片平放，40?烤箱内烘干后，干燥后分开。
[0060] 3)、-80? 保存待用
[0061] 4、冰冻切片的制备
[0062] 1)、设定参数，冷冻腔-20°c，冷冻摇臂-25°C，切片厚度20um。
[0063] 2)、取出固定脱水处理过的小鼠大脑，用冰冻切片包埋剂（SAKURA O.C.T. Compound (Order Number 4583)冰冻切片包埋剂）预先浸润组织表面，固定到切片 托上，在冷冻腔放置45min。
[0064] 3)、待组织块至表面白色，全部冷冻后放入切片机冷冻夹上进行切片，用毛笔将制 作满意的切片展平，裱贴于载玻片上。
[0065] 4)、-80 X：保存。
【权利要求】
L 一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，包括： (1) 将载玻片浸入水中，捞出后加入热的洗衣粉水溶液中，保持较高的洗衣粉水温度 0· 5h-lh，然后冲洗，沥干，浸入乙醇中过夜，冲洗，进入重络酸钾洗液中过夜，冲洗，洗漆，烘 干，进行去除RNA酶的高温处理，得到洁净的载玻片； ' '?八 (2) 取洁净的载玻片，朝上面标记，滴加多聚赖氨酸工作液；另取载玻片标记面向下， 在注有溶液的载玻片上从一端相互反向将溶液推向另一端，直至标记处停止，平放，烘千， 干燥后分开，得到防脱玻片； '，、 (3) 预先用冰冻切片包埋剂浸润组织，固定到切片托上，冷冻腔放置，待组织块至表面 白色，全部冷冻后放入切片机冷冻夹上进行切片，即得。 …
2·根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在 于：所述步骤（1)中冲洗为流水冲洗，冲洗时间均为5-15min。 '、
3. 根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征 在于：所述步骤（1)中洗衣粉水溶液的质量百分浓度为5-8% ;较高的洗衣粉水温度为 80-100°C ;乙醇为无水乙醇。
4. 根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在 于：所述步骤（1)中重铬酸钾洗液的为重铬酸钾、灭菌水、浓硫酸的混合溶液，其中重络酸 钾、灭菌水、浓硫酸的比例为20g :40ml :500ml。
5. 根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在 于：所述步骤⑴中去除RNA酶的高温处理用热风循环烘箱完成，温度为i6(TC -18(TC，处 理时间为5h_6h。
6·根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在 于：所述步骤（2)中多聚赖氨酸工作液的配制为：配制lmg/ml的多聚赖氨酸母液,〇. 22um 除菌滤膜过滤，分装后，_2〇°C避光保存；取出多聚赖氨酸母液与灭菌水按1:9比例配制成 〇· lmg/ml工作液。
7. 根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在 于：所述步骤（2)中用移液枪吸取200ul多聚赖氨酸工作液，浓度为〇. lmg/ml，滴加到载玻 片上，其中移液枪所用枪头为去除RNA酶的枪头。
8. 根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在 于：所述步骤（2)中烘干温度为30-40°C。
9. 根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征 在于：所述步骤（2)中切片的具体工艺参数为：冷冻腔_ 2〇°C，冷冻摇臂-25?，切片厚度 20咖，冷冻腔放置时间为30-60min。
10. 根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在 于：所述步骤（2)所得冰冻切片保存在_80°C。
11. 根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在 于：所述步骤⑶中包埋剂为包埋剂-0CT。
【文档编号】G01N1/06GK104215471SQ201410469178
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】常雪莹, 周宇荀, 邓倩云, 仝莉, 肖君华, 李凯 申请人:东华大学