作为冰冻切片的替代物的超快诊断组织制剂的制作方法
【专利摘要】用于处理所述实体组织的改进的方法和系统。该方法可人工或自动地实施。该系统具有诸如(i)切割模块，其中将新鲜组织切片以制备组织标本，(ii)硬化模块，硬化组织标本，(iii)浸渗模块，浸渗硬化过的组织标本，和(iv)包埋模块，其包埋硬化并浸渗过的组织标本。将新鲜的(即非固定或冰冻的)组织切割为约0.6mm，所述新鲜的组织被切割，以诊断疾病或评估外科手术治疗。优选在通过与化学混合物接触来切割期间开始但不完成新鲜组织的硬化。优选用干冰、热电装置或气体冷凝器来冷却含有已包埋的标本的金属模具。将其切片，然后用显微镜检测，作为冰冻切片的组织学检测的替代物，以避免不一致和延迟诊断所针对的已知的问题。
【专利说明】作为冰冻切片的替代物的超快诊断组织制剂
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2011年9月29日提交的申请号为61/540947的美国专利申请的权益。
【技术领域】
[0003]本发明涉及用于诊断组织制剂的化学方法和机械装置。在手术过程中从病人身体切下的实体组织的新鲜(即不是固定的或冰冻的)样本可以作为冰冻切片的组织学检测的替代品来制备(即切割后再加工)，并且不会遭遇后者的伪迹(artifact)。这些方法和这些系统使得能够通过石蜡切片的组织学检测来进行术中诊断，这避免了检测冰冻切片时会遭遇的伪迹。
【背景技术】
[0004]用于组织处理的方法和系统已被描述(见W099/09390、WOO1/44783, WOO1/44784和W02005/40763)。它们需要一种至少为酮和醇的混合物，用于化学处理。在此，证明了并不需要醇。可从手术中的病人来获得组织样本。可将其样品加工成组织块，该组织块被切片，组织切片由解剖病理学家检测。所述组织切片的组织学检测和诊断在病人离开手术之前完成。本发明相对于冰冻切片的优势是在显微镜下观测到的组织切片的形态保持在组织块中。无论所述块是通过常规处理法或本发明来制备，来自组织块的切片的质量都显得是相同的。主要由在冰冻切片的组织学检测过程中观察到的伪迹造成的不一致或延迟的诊断将通过本发明的应用而避免。
[0005]手术中病理学会诊涉及在手术中从病人获取的样本的巨检和镜检。最常见地，在显微镜下的组织切片的组织学检测通过染料染色来实现，以检测组织形态。常规地，这是在来自实体组织的“冰冻”切片上实现，以至于解剖病理学家在病人离开手术之前(即手术中)诊断是可能的。见Keeney&Leslie，JAMA300:1074-1075 (2008)。Wilson研发的冰冻切片技术的历史在其发表一百周年由 Gal&Cagle，JAMA294:3135-3137 (2005)和 Lechago, Arch.Pathol.Lab.Med.129:1529-1530(2005)详细叙述。
[0006]由美国病理学家学会(College of American Pathologists, CAP)认证的实验室认证要求使用冰冻切片的手术中诊断通过从相同组织获得的所谓“永久”切片的后续研究来确认，所述“永久”切片包埋在石蜡块中，先前用来获得冰冻切片。从CAP Q专题项目中的参与者的报告来看，在冰冻切片和永久切片之间存在至少约1% -2%的不一致(即手术中诊断中的足够的冰冻切片研究，其与石腊切片存在诊断不一致)。见Raab et al., Arch.Pathol.Lab.Med.130:337-342 (2006) ?因为该原因以及由延迟诊断导致的延迟，将需要提供通过本发明制备的来自组织块的切片的手术中诊断。但是，缩短制备源自手术样本、用于组织学检测的组织样品所需的时间以使得能实现手术中诊断对于现有方法和系统已作出的大量修改。
[0007]现在描述对于组织制备的方法和系统的这些改进。其特征在于:(i)将实体组织切割成约0.6mm的均一的厚度，和/或(ii)至少为酮和油的化学混合物，以使组织样品变硬，和/或(iii)冷却剂，以固化包含组织样本的块。优选地，在切割期间，组织样品先与化学混合物接触，以启动组织硬化，由此便于将它切成一个或多个组织样品。无组织学伪迹是相对于冰冻切片的常规组织学检测的改进，在现有技术中已知其可预期产生不一致和延迟的诊断。对永久切片的后续研究的要求变得毫无意义了，因为通过本发明获得了一致的形态。
[0008]本发明的其他优点在下面讨论或者通过该讨论将对本领域技术人员来说是显而易见的。
【发明内容】
[0009]本发明的一个目的是提供快速诊断组织制剂。在手术中从病人的身体切下的实体组织的样本作为组织标本来处理而无需提前冰冻。来自处理过的标本的块的组织切片具有与用常规处理法制备的石蜡块相似或相同质量的形态学特征。这相对于冰冻切片的组织学检测是一种改善，不会遭遇后者的形态伪迹，排除重新处理组织的需要并避免延迟。
[0010]本方法和系统与组织标本的加工是兼容的，以产生块，将所述块进行切片，来用于组织学、原位抗体结合、核酸杂交、其他蛋白质或遗传分析(例如片段的指纹鉴定或确定其序列)、形态和核酸的存档，以及其组合。
[0011]在第一个实施方式中，提供了一种方法，包括:(a)将组织标本在回音廊中硬化，其中所述标本与化学混合物以及微波能量接触；(b)在真空下浸渗组织标本，其中所述标本与熔化的基质和热能接触；以及(C)将组织标本包埋在块中，并使块固化，其中固体块可切片，用于在手术过程中组织学检测。优选对手术获得的组织标本切割为大体上均一的厚度(例如，最小尺寸约为0.6_)，与化学混合物接触以开始(但不完全)硬化。该组织标本厚度可为约0.1mm或更厚、约0.2mm或更厚、约0.3mm或更厚、约0.4mm或更厚，或者约
0.5mm或更厚。组织标本厚度可为约Imm或更薄、约0.8mm或更薄,或者约0.7mm或更薄。
[0012]在第二个实施方式中，提供了一种系统，包括:(a)硬化模块，以将组织标本硬化，
(b)浸渗模块，以浸渗硬化的组织标本，以及(c)包埋模块，以将经过硬化和浸透的组织标本包埋在固体块中。硬化模块包括(i)具有形状为回音廊的内部的第一腔室；(ii)当闭合时关闭第一腔室，对微波辐射无透过性，当开启时连通第一腔室的第一盖子；(iii)将化学烟雾和蒸发保持第一腔室的内部的第一垫圈；以及(iv)将微波能量传递到第一腔室的内部的辐射源。组织标本在第一腔室中与化学混合物接触。浸渗模块包括(i)具有能够提供相对于外部降低的压力的内部的第二腔室；(ii)当闭合时关闭第二腔室，当开启时连通第二腔室的第二盖子；(iii)保持第二腔室的内部和外部之间压差的垫圈；(iv)至少将第二腔室的内的压力降低到小于I巴的泵；以及(V)将热能传输至第二腔室的内部的加热器。在第二腔室中，将硬化的铸造标本与熔化的基质接触。包埋模块由从块(其中将处理过的组织标本包埋在基质中)传输热能致使基质固化的冷却器构成。
[0013]任选地，固定器(例如，由互锁的两半组装的卡盒，其侧面穿孔以使得溶液能够交换)可在第一模块或第二模块中，以及在其之间负载一个或多个相同类型的组织样品。可卸载固定器，将处理过的组织样品从固定器移除再放置于任选的模具的内部，组织样品被包埋在灌注有熔化的基质的模具中，并被固定器的至少一部分所(一半具有标明组织样品的标签)覆盖。优选模具通过冷却器的导热表面接触，模具的被接触的一面通过固定器部分与盖体相对。包埋过后，将组织样品脱模，含有组织样品的块保持与固定器部分相连，其可通过超薄切片机来使用以将所述块移动穿过切片的刀。三个模块可彼此独立，优选至少第一模块和第二模块为相同系统的独立的部分(即第三模块不与其他两个模块结合)，但三个模块均可为相同系统的独立的部分。
[0014]任选地，化学混合物包括非水溶液，包括⑴至少一种酮，其可为丙酮，以及(ii)至少一种油，其可为矿物油或者松树油；可进一步包括至少一种表面活性剂，其可为二甲亚砜。优选化学混合物不包括醛(例如，其为福尔马林)、醇、二甲苯或其组合。用于切割和处理的化学混合物优选在组成上是相同的，但它们可包括不同化学物质或配比不同。任选地，基质包括至少一种石蜡。优选基质不包括油、二甲苯，或者两者都不包括。
[0015]在第三个实施方式中，提供了切割系统和切割工具。
[0016]通过下列详述和权利要求及其概述，本发明的更多方面和优点对本领域的技术人员来说将是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1显示了将冰冻切片(例如，对切片并染色过的实体组织进行镜检)与通过不同方法制备的永久切片进行组织学比较的流程图。对实体组织进行切割。常规处理固定在甲醛中，用一系列梯度乙醇脱水，在二甲苯中透明，包埋在蜡中。用微波能量快速处理在酮和醇中硬化，然后在真空下浸渗，并通过热能包埋在石蜡中，以制备永久切片。冰冻切片的组织学检测并不需要固定、浸渗，或者包埋。相反，通过冰冻使新鲜样品硬化，然后不需包埋在蜡块中就切片。根据非限制性实施例1的超快制备法显示可用于被切割的组织样本(例如，新鲜样品与化学混合物接触来开始硬化，并由此使将样本切成组织标本变简单)，处理组织标本，然后包埋入块中，然后将块冷却以固化。将块用超薄切片机处理，以提供组织标本的组织切片。对组织切片进行脱蜡，然后染色(例如抗体或染料)，并检测其组织形态。
[0018]图2是处理具有两个储藏室的处理系统的示意图，储藏室中分别含有硬化组织标本的化学混合物和浸渗硬化的组织标本的熔化的基质。
[0019]图3为没有储藏室的另一处理系统的示意图。
[0020]图4为用于切割组织的系统的透视图。
[0021]图5为在组织切片之前的图4的切割系统的透视图。
[0022]图6为在组织切片期间的图4的切割系统的透视图，所述图4的切割系统从从本角度看不见。
[0023]图7为在组织切片期间的图4的切割系统的顶视图，所述图4的切割系统从本角度看不见。
[0024]图8为切割系统通过图7的直线8-8的横截面图，显示了被固定并切片的组织。
[0025]图9为切割工具的透视图。
【具体实施方式】
[0026]对于实体组织的处理和组织学分析，组织切片必须为约2 μ m至10 μ m，以在显微镜下通过放大来检测，然而用切割工具可以得到的新鲜组织的最薄的切片也超过其十倍厚。因此，为了制备适用于镜检的组织切片，有必要硬化组织以能够得到更薄的切片(例如用超薄切片机切片)。厚度为约0.6mm的标本足以提供约75个组织切片。
[0027]对于多种组织类型，组织块的超薄切片必须以一致且均一的方式来生产能接受的条带(即一系列)组织切片，所述组织切片能悬浮在水浴中而不会“突散”，并被置于载玻片上用于组织学染色的而不会“破裂”。在用超薄切片机切割之后，组织切片的该处理是对于基于在染色的组织切片中观察的形态来提供有效且可靠的组织学诊断来说必要的。缺失或者染色差的各部分组织切片均将推迟基于该切片中的组织形态的诊断，以此来降低诊断结果的可靠性。因此，用于病理学实验室的步骤和仪器要求根据已建立的方法的确认，以使得它们可以一致地且有效地实施；可处理多种组织类型，包埋在块中，并切片；可对它们应用用于多种疾病的不同诊断标准；并且能快速且准确地实施珍贵样本的组织学诊断(即通过用抗体或染料染色的方式来显现组织形态)。本发明具有下列优点:制备用于手术中诊断的具有识别的形态的“永久”切片取代具有高发生率的不一致或推迟的结果的冰冻切片。
[0028]在超薄切片期间，处理得很差的铸造标本不形成一系列的组织切片的条带，所述切片在悬浮在水浴中时会突散，并且在组织切片中存在破裂(即缺失部分)。可接受的处理结果不会有这样的缺陷，因为超薄切片产生在后续组织学分析中具有保持形态(例如，细胞结构和组织构造)的组织切片。可变的结果(例如来自同样组织标本的切片形态不一致，或者对于某些组织类型一致但对于其他组织类型则不令人满意)对组织学诊断是不可接受的。
[0029]在第一个实施方式中，组织标本的硬化可通过在回音廊内与化学混合物和微波能量接触来实施。然后可将硬化的组织标本在真空中通过熔化的基质和热能接触来浸渗。组织标本的硬化可通过在环境压力(例如I巴)下使用微波能量辐射加热来发生。化学混合物可包括至少一种酮和至少一种油(即在环境条件下是液态，且源自于动物、植物或石油的烷烃)。化学混合物可进一步包括至少一种表面活性剂。硬化组织标本的溶液优选不包括醇、醛、二甲苯，或其任意组合。化学混合物和/或微波能量可固定、脱水，以及任选地清洗组织标本。该组合可减少处理时间和/或可提高用于组织形态学检测的组织的质量。浸渗组织标本可通过在少于一个大气压(I巴)下与熔化的基质接触并利用热能进行热传导(例如电阻加热)来实施，以将化学混合物从组织标本抽出并将基质浸渗到组织标本内。真空通过促进扩散和降低可能存在于组织标本中的任何溶剂的蒸发温度来促进浸透。基质可包括至少一种石蜡和/或其他蜡(即在环境温度下是固态的并且来自动物、植物或石油的烷烃)，其任选地被脱气和脱水。浸渗硬化的组织标本的溶液优选不包括矿物油、二甲苯，或者两者。包埋组织标本可通过在模具中浇铸它和熔化的基质来进行，以生产块。然后，可通过冷却来固化所述块(例如冷冻剂压缩机或者珀尔帖效应)。然后用超薄切片机来切片包埋的组织。将将组织切片悬浮于水上，以放在显微镜载玻片上。组织切片放在载玻片上之后，从载玻片去除基质，剩下的组织切片黏附在玻璃上。然后将载玻片染色并用盖玻片盖上。
[0030]在第二个实施方式中，组织标本通过在回音廊中与化学混合物和微波能量接触来硬化，通过在真空中在腔室中与熔化的基质和热能接触来浸渗，并包埋在块中。微波能量(例如磁控管、速调管、行波管)或热能(例如电阻式加热器或者热泵)加热化学混合物和熔化的基质，以及其他内容物，例如组织切片。可使用搅拌(例如通气、真空的循环和增加的压力，摇动等)来促进溶液(例如化学混合物或熔化的基质)和组织标本之间的交换。接下来，通过冷却器单元将组织标本(例如热电冷却器或者气体冷凝器)包埋在块中。可将组织块与冷却器单元接触来固化，以使得块可以容易地切片，用于组织学检测(例如在显微镜下对于与组织切片特异性相连的抗体或染料的检测)。
[0031 ] 成功完成组织制备是由在超薄切片期间包埋在块中的组织的易于切片和在组织切片的组织学检测期间的形态的保持来表示的。尽管优选用手工转入微波单元和在微波单元和真空单元之间自动转移(任选自动转移到真空单元以及卸载站外)的方法和系统的半自动操作，可在回音廊和任选的第一储藏室(或腔室和任选的第二储藏室)之间转移化学混合物，所述第一储藏室彼此间以流体相连(例如管子或管道、阀门，以及带控制电路的泵，以确定时间、速度和溶液流动的方向)。
[0032]可用化学物质的混合物来硬化组织标本，所述化学物质的混合物可以是包括至少一种酮(例如丙酮、甲基乙基酮)以及至少一种油(例如矿物油、松树油)的非水溶液。对于酮和油的非水溶液，两种试剂的体积比可在约12:1至约6:1之间(尽管这些极值可改变处理时间，或者结果可能不可靠)；小于约12:1，小于约11:1，或者小于约10:1 ;大于约6:1,大于约7:1,或者大于约8:1 ;约9:1,或者其任何中间范围(例如,在约10:1至约8:1之间)。化学混合物可进一步包括可加速硬化的表面活性剂:例如二甲亚砜(DMSO)、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(例如吐温80)、二甲基磺基琥珀酸酯钠(sodium dimethylsulfosuccinate)、温和家用清洁剂等。化学混合物还可通过酸和碱的适当应用来缓冲，但非水溶液中不需要包括醋酸。
[0033]组织标本可在化学混合物中孵育在约3分钟和约6分钟之间的一段时间；超过约3分钟，超过约4分钟，或者超过约5分钟；少于约4分钟，少于约5分钟，或者少于约6分钟；或者其任何中间范围(例如，从约4分钟至约5分钟)。温度可为在约40°C和约60°C之间；高于约45°C，高于约50°C，高于约55°C，或者高于约60°C;低于约60°C，低于约65°C，低于约70°C，或者低于约75°C ;或者其任何中间范围(例如，在约45°C和55°C之间)。
[0034]可用熔化的基质来浸渗组织标本，熔化的基质可为包括至少一种石蜡的蜡溶液。优选基质为市售的蜡配方、具有不同熔点的蜡的混合物(蜡在室温下为固体，具有依赖于其键长的熔点，而矿物油在室温下为液体)等。它们可进一步包括一种或多种添加剂，以改变基质的结晶性能。组织标本可在熔化的基质中孵育约3分钟和约6分钟之间的一段时间；超过约3分钟,超过约4分钟,或者超过约5分钟；少于约4分钟,少于约5分钟,或者少于约6分钟；或者其任意中间范围(例如，从约4分钟至约5分钟)。蜡溶液可在室温下为固体(例如，在约25°C以下，或者在约30°C以下)，在约55°C以上或者约60°C以上熔化。温度可为在约50°C和约70°C之间；高于约50°C，高于约55°C，高于约60°C，或者高于约65°C;低于约65°C，低于约70°C，低于约75°C，或者低于约80°C ;或者其任意中间范围(例如，在约55°C和65°C之间)。优选在减压条件下(例如，高于约0.5巴，高于约0.6巴，或者高于约0.7巴；低于约0.7巴，低于约0.8巴，低于约0.9巴，或者低于约I巴；或者其任意中间范围)实施孵育。
[0035]在切片前，可将浸渗过的组织标本包埋在同样基质中，以形成组织块。例如，可将浸渗过的组织标本置于金属模具中，可加入更多熔化的基质来填充模具，并形成组织块，将组织块固定在平台上(例如，前面所用的卡盒或者具有识别信息的其他固定器)，所述平台与用于切片的超薄切片机相连。可通过在含有有机溶剂和干冰的液浴中，或者在含有有机溶剂和液氮的混合物的液浴中，或者在使用压缩的制冷剂或珀尔帖效应冷源的冷却器单元的表面，通过在干冰上冷却模具来加速包埋。切片之后，可以通过在高于约100°c的温度下熔化来去除基质(现在是固体)。
[0036]回音廊或者反应腔室可包括下列各项的任意组合:适于将其从其与周围环境隔离并且提供通向其内容物的通路的盖子(例如，由对微波辐射和/或可见光无透过性的材料制得)；在盖子和回音廊或者反应腔室之间的垫圈(例如，由橡胶或硅树脂制得)，以将化学烟雾保持在前者(回音廊)(以及任选地加热储藏室)中，和/或在后者(反应腔室)中保持减压；热绝缘材料，以将热量保持在回音廊或者反应腔室中；至少一个温度和/或压力探头，以监测其中的条件；密封条，以将电子元件与回音廊形或者反应腔室中的化学物质和冷凝隔离开来；以及控制电路，其接收来自至少一个探测器和/或计时器的输入。类似地，储热器可包括热绝缘材料、至少一个温度探测器和/或压力探测器、密封条，以及接收来自至少一个探测器和/或计时器的输入的控制电路的任意组合。
[0037]在一个优选实施方式中，预混合化学混合物，并在使用前将其储存在瓶子中。打开所述瓶子，并将其内容物的至少一部分通入一个(第一)储藏室以进行预加热，在加入组织标本之前，转移入第一模块的回音廊中，在组织标本移动(人工地或自动地)到第二模块之前，转移回(第一)加热储藏室以排空回音廊。可在第二模块的腔室中直接融化固体基质。或者，固体基质可在(第二)加热储藏室中融化，然后通入那个腔室。化学混合物在组织处理期间可在(第一)加热储藏室和第一模块的回音廊之间转移。而熔化的基质在组织处理期间可保持在第二模块的反应腔室中。在一天结束时，化学混合物可以转移回瓶中，熔化的基质则可以转移回第二腔室，然后它们可以安全地处理掉或者储存以备再次使用。
[0038]或者，单个反应腔室可用于将微波和真空功能两者结合在单个单元中的模块中。化学混合物和熔化的基质可以分别从各自的第一储藏室和第二储藏室转移到共同的反应腔室，然后再转移回去。
[0039]这种系统可人工或自动操作(即在用机械传送装置在模块之间传递组织标本)。该系统可进一步包括装载和/或卸载站。组织标本可装载到系统中，分批处理或作为单独的标本来处理。组织标本可在装载站加入系统，从卸载站离开系统，任选地它们可在卸载站被收集。控制电路(例如，电脑以及程序)可用于通过系统移动组织标本来防止操作期间进入反应模块，以修改一个或多个反应参数(例如，本方法中的时间、温度、压力，或者溶液的量)，或者其任意组合。
[0040]组织标本是固体块，可装到超薄切片机上以生产在约I微米和约50微米之间的组织切片，或者在约2微米和约10微米之间的组织切片。组织切片可进一步处理用于组织学染色、结合抗体、原位核酸杂交或者扩增，或者其组合。例如，可将黏附于玻璃上的多个组织切片加热到高于100°C的温度，以熔化固化的基质，去除熔化的基质，将玻璃上余下的组织切片用抗体或染料染色，并在显微镜下通过放大来观察。但是用于检测细胞特性的其他技术可用来检测处理过的组织标本(例如，片断的指纹识别、分馏和印迹、测序)。组织块可存储用于存档目的或者回顾性研究。
[0041]细胞表型(例如，与细胞特异性抗体的反应性、化学染色)可以通过移除固体基质(例如，脱蜡)和分割组织(例如，蛋白水解消化和机械消化)来进行分析。个体细胞通过喷射分散，并用流式细胞仪分析。或者，可将脱蜡的组织切片装到显微镜载片台上，用激光和/或显微操作仪来分割成大致均匀的细胞群，并通过物理、化学或遗传技术分析不同的细胞类型。
[0042]本发明与从处理过的组织制备核酸(DNA或RNA)是相容的。因此，对于在临床病理学实验室中常规收集的组织标本进行遗传学研究是可能的。这些技术的组合的能力很好。组织学观察可与通过由染色(例如，特异的抗体或染料)分析组织切片，并从邻近组织切片制备核酸用于遗传学分析的方式进行的遗传学研究相关。例如，可比较相同组织切片的带病的和正常的区域以检测遗传学差异(例如，突变，转录水平)，疾病进展可通过比较在几个时间点采取的样本中的遗传学差异来表征，并且肿瘤进化可通过跟踪从原发癌到转移癌的遗传学差异的积累来评估。实质上均一的或仅仅丰富的细胞可通过用流式细胞仪或者显微切割从组织切片分选细胞来获得。
[0043]突变可为生殖细胞突变，并用于追踪疾病的遗传倾向，或者突变可为体细胞突变，并用于确定疾病发病机理中的基因的改变。疾病可为代谢或神经失调、恶性(肿瘤)、发育缺陷，或由传染原导致。本发明通过简单步骤，在室温下储存来保存用于遗传分析的材料。它可通过原位杂交来分析，或者可从组织提取核酸。
[0044]苏木精-伊红染色法常用于组织分析，并可认为是用于与其他解剖病理学家比较的标准。此外，其他可相容的染色法包括三色染色、网状纤维染色、粘蛋白卡红染色，以及弹性纤维染色法，诸如 Thompson (Selected Histochemical and HistopathologicalMethods, C.C.Thomas, Springfield, Illinois, 1966)、Sheehan 和 Hrapchak(Theoryand Practice of Histotechnology,C.V.Mosby,St.Louis, Missouri, 1973)以 及Bancroft 和 Stevens(Theory and Practice of Histological Techniques, ChurchillLivingstone, New York, New York, 1982)等文献通常所描述的。这些染色方法将花30分钟至几小时来完成，但从飞世尔科技(Fisher Scientific)公司可获得仅需要5分钟的快速染色方法。
[0045]可由手术活体组织检查或者切除获得实体组织。在癌症手术期间，从染色的组织切片提供病理诊断的能力将给外科医生提供可在病人离开手术室之前(即，手术中诊断)使用的信息。例如，源自解剖病理学家的癌症局限在被切除的组织的指示可允许外科医生在治疗中保守，并保存邻近的健康组织。或者，源自解剖病理学家的癌症不局限在被切除的器官的发现将在病人还在手术室中时允许进行更加积极的外科治疗。与常规的冰冻切片的组织学检查相反，新鲜标本的超快诊断制备可提供具有更好组织形态的组织切片，并降低对用来自与获得冰冻切片相同的组织的石蜡切片后续确认的需求。
[0046]可处理的示例性的组织包括:阑尾、膀胱、骨、肠、脑、乳房、癌、子宫颈(鳞状上皮)、胆囊、心脏、肾、肝、肺、卵巢、腮腺、胎盘、前列腺、皮肤、脾、睾丸、甲状腺、扁桃体和子宫(子宫肌层和子宫内膜)。也可处理淋巴网状内皮细胞组织和脂肪组织。矿化组织需要在用本发明的方法处理之前脱钙。接下来的分析将包括检测DNA突变和RNA表达、基因组分析、组织化学、免疫化学和蛋白质组分析。
[0047]可进一步处理组织切片，用于抗原修复和/或保存。阻断非特异性结合位点，将抗原结合到特异性抗体(即一抗)上，去除未结合的特异性抗体。抗原可以是蛋白质、碳水化合物或神经节苷脂；其抗原决定簇可为直链或非直链的氨基酸、糖、其他修饰物，或者其组合。如果用探针或信号生成部分来标记抗体，可直接检测一抗，但优选将探针与特异性结合一抗的扩增物(例如，二抗)相连。二抗可抗一抗的重链恒定区或者轻链恒定区。这扩增了由抗原-抗体结合产生的信号，因为每个一抗都将结合多个二抗。扩增可通过其他特异性相互作用(例如生物素-链亲和素)来进行。抗体结合可以很小的量来进行，以降低昂贵试剂的使用，并保持高的结合速率；可通过在湿度箱中孵育来降低此少量的挥发。该信号生成部分优选为不存在于组织中的酶。例如，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶可结合二抗或结合链亲和素。这些底物对于那些产生可在视觉上观察到的发色、发荧光或发冷光产物的酶都是可用的。
[0048]抗原的染色模式可用来定位通过复染的方式所揭示的细胞结构中的抗原的表达。抗原表达可识别细胞或组织类型、发育阶段、肿瘤预后标记、退行性代谢过程或被病原体感染。
[0049]抗原-抗体结合还可通过荧光显微镜、放射性自显影仪或电子显微镜利用荧光、放射性或胶体金属探针来显现。类似的探针可用于通过原位杂交来检测组织切片中的核酸，以识别基因突变或转录物；或者，核酸(DNA或RNA)可从组织切片提取，并在进一步遗传分析之前通过印迹法来直接分析或扩增。
[0050]组织制备可结合其他模块:(i)从新鲜组织生产组织标本的切割模块；(ii)产生基质包埋的组织标本块及其组织切片的包埋和切片模块；(iii)提供含有组织切片的玻片的超薄切片、染色和盖玻片模块；(iv)将有关组织切片的组织化学和/或免疫化学信号可视化的显影模块；(V )将组织切片的细胞分离成实质上均质的种群的显微切割模块；(Vi )在玻片上扫描组织切片的成像模块，将通过显微镜可视化的信号数字化，然后处理，储存，并传送这些图像；以及其任意组合。组织，尤其在分选和/或分离成实质上均质的种群之后，可通过其DNA或RNA序列、基因突变、基因表达的水平或方式的改变、蛋白质表达水平或方式的改变，以及其组合来进行分析。通过字母数字字符、条形码、近场或射频识别或其他标记来识别每个组织标本或其固定器来促进系统集成以及数据管理。随着特定的组织标本通过一系列机械系统时，相同或不同的标记可用于识别所述特定的组织标本。关于组织标本的标记和其他信息(例如，病人名字、日期、在器官中的位置、疾病或其他病理症状、组织类型、诊断、表型、基因型、基因组或蛋白质组学表征)可进入数据库管理系统，以储存、处理和读取数据。在数据库中挖掘这些信息可证明或反驳依照统计标准的关联性，并建议进一步的检查。
[0051]可在手术室、病理实验室或其他地方实施的本方法中的第一步用来提供适合超快诊断制备的组织的样品。后续步骤在病人体外(活体外)进行，优选甚至在病人不在时。一般来说，切割提供了目标组织的薄片。或者，超薄片或针状物可在活体检查期间获得。对于实体组织，由切割制备的样品提供了从约0.4mm至约0.8mm,优选从约0.5mm至约0.7mm,最优选约0.6mm的组织标本，以最小尺寸(即厚度)测量。优选地，通过切割与化学混合物接触的实体组织来启动硬化，但不完全硬化。切割步骤可在约5秒和约5分钟之间的时间段内实施；超过约I分钟；超过约2分钟；或超过约3分钟；少于约3分钟；少于约4分钟；或少于约5分钟；或其任何中间范围(例如，从约10秒至约3分钟)。例如，病人器官的切除的一块可放在切割板的接受组织凹槽内，其含有化学混合物，组织被凹槽底部表面支撑。将处理的组织标本可通过板的顶部表面上的金属滑轨导引的刀片切成大体均一的厚度，其大体上与顶部表面与凹陷平齐，任选地与化学混合物接触以启动硬化，并由此利于切成薄片。切割之后，组织标本可置于卡盒或其他固定器，其中在后续处理期间含有组织标本，直到组织标本包埋在准备切片的块中。将块通过冷却固化，并由此利于通过超薄切片机的切片。或者，采用套管针(例如用于活检)替代切割通过组织的打孔取样和碎化来提供合适厚度的组织标本，然后将其放入卡盒或其他固定器。尽管优选人工处理，仍可将卡盒放入载体或篮子，以使操作简便。然后将卡盒或固定器放置在化学混合物中，优选人工放置。
[0052]为了减少处理时间，建议减少切割板上的组织样本厚度，如W001/96830或W02010/027430中所述，以提供组织标本，其中例如用作组织处理的化学混合物填充在切割板上的凹陷内，而组织样品放在所述切割板的凹陷处，以切割成大体上均一的厚度(见实施例3)。为了简洁起见，优选使用与用于切割和硬化的化学混合物相同的化学混合物。
[0053]将组织标本、卡盒或固定器暴露在化学混合物中，所述化学混合物硬化所述组织标本，同时采用微波能量加热，可选择的进行搅拌。需要仅仅单个微波单元，因为能使用一种化学混合物。在几个处理周期中，可将硬化溶液保留在回音廊中，或者可相隔一段时间，硬化溶液在回音廊和储藏室(例如，在每个硬化周期之后，当所有组织标本被处理后，或者在当天的处理结束时移至储藏室)之间转移。优选将标本的载体或含有组织标本的卡盒在各反应腔室之间通过人工转移，或者通过电枢或轨道传输。
[0054]为了提供能加速处理的搅拌，可充入化学混合物或熔化的基质。为了通过空气提供更均一的搅拌，在回音廊或反应腔室的底部并贯穿其大部分的扩散板可用于使得全部容量的溶液的均匀通气。搅拌还可通过压力和真空(P/V)循环(例如，各周期中在有压力条件下占几秒，降低到部分真空，并重新返回压力条件下)，或者将溶液泵入和泵出回音廊或反应腔室(例如，自始至终循环溶液)或使用P/V循环来提供。
[0055]在一个优选的实施方式中，用于制备组织标本的系统可限制在3或4个分立的模块中:任选的切割单元、微波单元、真空单元，以及任选的冷却器单元。实体组织的新鲜样品的切割通过与启动硬化的化学混合物接触并切割成大体上均一的厚度来提供一个或多个组织标本。组织标本在微波单元中与相同或不同的化学混合物和微波能量接触以完成硬化。硬化的组织标本然后再在真空单元中与熔化的基质和热量接触来启动浸渗。在反应腔室(也称为反应罐或容器)中进行处理，其具有形状为回音廊(例如，微波单元)或圆柱形(例如真空单元)的内部。仅仅需要一个微波单元和一个真空单元；它们可整合到同一单元中。其中搅拌可用导致向其中充气、摇晃或振动、或者将超声能量转移到溶液中的机械装置提供。或者，可使用泵来用Ρ/ν循环或循环溶液来进行搅拌。将硬化并浸渗过的组织标本包埋在块中可在模具中浇铸(通过额外的熔化的基质)。组织块可通过与传导来自组织块的热能的表面接触的任选的冷却器单元来固化。
[0056]微波单元可包括(i)微波能量源(例如，包括谐振腔和任选的波导的回路，其可将微波能量从所述发射源传输到回音廊，使其尺寸和形状适应此目的)以及(ii)接收传输的微波能量并适应于通过硬化处理组织标本的回音廊。所述回音廊可包含多个不同标本。优选回音廊的内部几何形状被构造以实现微波能量和内容物加热的均匀分布。通过考虑两方面的因素来实现均匀性。
[0057]第一，回音廊的周长制成其中辐射的半波长的整数倍。通过波导的合适的安排进入回音廊，激发将在外壁周围传播的模式。该类型的模式通过主要在外壁附近的微波场来表征。类似的现象发生在声学中，其中声波非常有效地紧挨着实体墙传播。这些类型的模式称为回音廊模式。
[0058]第二个考虑是在回音廊中的溶液和其壁的边界之间的径向距离。最佳间距通过改变间距凭经验确定。如果间距过窄，则微波能量主要在反应腔室的进口附近被吸收。如果间距过宽，则回音廊变成共振腔，并且对化学混合物和其中固体(例如标本、卡盒或载体)的量敏感。通过合适的间距，实现了在内容物的非常大范围的高度下的溶液和固体的有效加热，如通过在回音廊外的液位监测器所测量的(即其中的容积)。即使低至整个高度(即总容积)的10%也能提供内容物的有效加热。
[0059]类似地，所述辐射源和波导被构造成能在微波能量的传输期间实现最小能量损失。用波导构造微波单元，以具有从所述辐射源到回音廊不超过约2%的能量损失。更高的能量损失将需要使用用于微波能量源的昂贵的屏蔽和其他保护装置。
[0060]可通过在约10秒至25秒的循环中循环能量开-关来控制加热，因为微波源的阴极的加热特性要求最短的时间。但是这将燃烧组织，因此可通过可变电流源来控制加热，以允许在微波源传递到反应腔室的能量能够有连续的变化。这种燃烧或过煮以组织结构具有均质染色的特征而无需区别细胞特征。优选后者以降低峰值能量输出。微波单元可进一步包括适用于配合反应腔室并接收至少一个组织标本的容器(例如篮子)的任意组合；至少一个温度探测器和/或压力探测器，以监控反应腔室中的条件；一个或多个能量探测器，以监控从所述辐射源发出、通过波导传输和/或由反应腔室接收的微波能量；适用于配合反应腔室并将反应腔室与操作者环境相隔离的隔离体；热绝缘材料，以保持反应腔室中的热量；屏蔽，以将电子元件与反应腔室中的化学物质相隔离；以及控制电路，以接收来自至少一个探测器或计时器的输入数据，并由此调节至少一种来自所述辐射源、通过波导传输和/或由反应腔室接收的的微波能量。所述容器优选对微波辐射有透过性的，因此能量不会在其加热时被消耗。
[0061]用于真空密封的材料可根据其将反应腔室或储藏室与环境密封隔离的能力、保证与盖子的紧密配合的柔韧性，以及对本方法的溶液的耐化学腐蚀性来选择。反应腔室或储藏室可用以下办法进行改进(i)减少蒸发的盖子和垫圈/封口，以及(ii)绝热能够将操作微波单元或真空单元所需的能量降低两倍或三倍。
[0062]所述各模块可在相同空间，和/或所述组织标本可保持固定。在本方法的不同时间中，可调整微波或热能，并将其输入相同空间，或到固定的组织标本上。可将化学溶液和/或蒸汽移入或移出相同空间，或使其与固定的组织标本接触或不接触。优选通过使用两个反应腔室并通过管子或管道将不同的化学组合物从各自的储藏室和/或废料腔室转移到一个反应腔室来使系统的空间要求最小化。控制器可接收来自反应腔室和/或来自对该处理循环的该部分计时的输入数据，并由此调整不同化学组合物的传输。
[0063]将不同溶液输入和输出反应腔室，或者在含有不同溶液的反应腔室之间转移篮子可导致处理步骤的改变。将篮子保持在上述反应腔室内部几秒钟，使得在转移篮子之前，将多余的溶液通过底部和/或侧壁的一个或多个开口流回。因此，篮子在各反应腔室之间转移的顺序(每个反应腔室都含有特定组成的组织处理化学物质)和篮子在每个反应腔室中孵育的时间将决定完成根据本发明的方法所必需的一系列化学反应。
[0064]可移去盖子；可将垫圈贴附于盖子上并随盖子移动。对含有组织标本的当前单元和将要随后转入组织标本的下一单元两者都实施移去盖子和垫圈的步骤。然后移去篮子，可将篮子和卡盒中包括的剩余的化学混合物从篮子和卡盒中通回反应腔室几秒钟，将篮子转移到下一个含有熔化的基质的反应腔室中。不要求冲洗管子/管道和清洁反应腔室，因为剩下的溶液的量极少。最后，将盖子和垫圈放回去。该转移的总时间约为I分钟。
[0065]根据本发明，可设想对上述实施方式的改变。组织处理系统的多种结构变化是可能的，任选的各模块可被连接上，以形成该系统的一部分。所选的特定结构可取决于临床实验室每天要处理的组织标本的平均数量，和/或组织学或病理学报告必须被准备好的速度。
[0066]该系统可人工操作或自动操作。人工操作尤其适合于快速处理单个组织标本或少量组织标本的设备。对于自动系统，组织标本可通过机械传输设备(例如机械臂、由传送带和滚轴形成的轨道)来转运，和/或化学组合物可通过抗腐蚀管道来转移。因此，可通过将组织样品在固定的模块之间以特定顺序转移、进料和排空具有不同化学物质的模块以使得固定的组织标本以特定的顺序孵育，或其任意组合来自动地处理。控制组织处理参数的程序(例如，系统的开启和关闭、装载和卸载多个组织标本、诸如反应时间的条件、组织标本通过系统的进度)可在屏幕上监控；组织处理的参数(例如，一个或多个组织标本在反应腔室中约2、3、4、5、6或7分钟，从约2至约7分钟，或其间的任意中间范围)可由操作者通过键盘来预先设置或选择。
[0067]电枢传送可例如通过类似钳子的装置抓取含有一个或多个组织标本的载体，或者通过类似钩子的装置抓住载体。机械臂可为铰接的，以实施类似人的动作；或者可装在固定的坐标轨道上，实施线性或二维运动，以及任选的由改变机械臂相对于该系统的高度来提供的另一维度的运动。轨道传输工具可由弹性或粘性材料制成，以通过摩擦来将载体固定在含有一个或多个组织标本的轨道上，或者可存在有规律的一系列隆起物或壁，以将载体限制在其间。轨道可制成作为搬运载体的连续传送带或者一系列传送带，所述传送带被滚轴或链轮齿装置带动。载体可为篮子，所述篮子包括多个卡盒，每个卡盒具有单个组织标本，并适用于传送，所述传送是通过具有要被抓住的杆(有或没有结)或要被机械臂抓住的环，或嵌入轨道的凹槽或凹口中。或者，载体可含有单个或几个组织标本(例如，一个卡盒)，载体适用于通过电枢传送或轨道传送的运输。
[0068]可使用电动机和控制器来通过操作者的实时指令或者选择储存在计算机存储器中的程序来运输组织标本。控制组织标本花在每个模块中的时间的一个简单机械装置将以一定速度移动组织标本或其载体，并调整通过每个模块的路径的长度，以达到所需的孵育时间。
[0069]挠性管或刚性管以及其他管道元件应由耐化学腐蚀性材料制得，以防止腐蚀(例如，玻璃、不锈钢、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯)。可使用控制器和泵/阀门，以将化学组合物(例如，化学混合物和/或熔化的基质)从储藏室腔转运到反应腔室，从反应腔室转运到储藏室腔(如果组合物可以重复使用)，从反应腔室转运到废料腔室(如果组合物要从系统中冲洗掉)；以向储存腔室进料；以通过操作者的实时指令或者选择储存在计算机存储器中的程序来冲洗废料腔室。蒸汽密封和/或冷却可能是将化学混合物的腐蚀性蒸汽与系统的机械元件和电学元件隔离开所必需的。加热的储藏室和加热的管道元件可能对维持组合物在反应温度或保证熔化的基质保持在可运输的流体状态是必需的。[0070]所有专利、专利申请和其他出版物均通过引用的方式并入本文中。
[0071]下列实施例意在阐释本发明，但这些实施例不能以任何方式限制或局限本发明的实施。
[0072]实施例
[0073]实施例1
[0074]将新鲜(即非冰冻的也非预先固定的)组织切割成约为0.6mm(例如从约0.4mm至约0.8mm)的大体均一的的厚度，以提供用于处理的一个或多个组织标本。优选当通过将新鲜组织与化学混合物接触来将实体组织切片时，开始硬化，所述化学混合物可与在切割期间用于处理(见下文)的化学混合物相同或不同。按照新方法，将来自于多个不同的剩余的组织和患病皮肤、肺、脾、肝脏、子宫、胎盘、肠、卵巢、癌(例如乳房、肾、睾丸)、肉瘤和平滑肌瘤制成永久切片。
[0075]将组织标本在含有约90% (v/v)的丙酮、约10% (v/v)的矿物油和约0.1% (v/v)的二甲基亚砜(DMSO)的化学混合物中处理。在3.8L体积中混入两种主要成分，往其中加入5ml的DMS0。将组织标本在该化学混合物中，在约50°C下孵育约4_5分钟；通过搅拌化学混合物(例如，通气)来促进溶液交换。将组织标本和化学混合物两者都通过微波能量加热。
[0076]在组织标本硬化之后，将其在约62°C减压(约640mm Hg)条件下在熔化的石蜡中浸渗约4-5分钟。利用P/V循环通过搅拌熔化的石蜡来促进浸渗。在约8-10分钟的总处理时间之后，将组织标本包埋在熔化的石蜡中。硬化过以及最初浸渗过的组织标本和熔化的石蜡在金属模具中浇铸，然后将它们与干冰(约_78°C)接触约1-3分钟。将含有组织标本的固化块用超薄切片机切片，将组织切片悬浮在液体中，在载玻片上作为系列切片收集，通过在烘箱(约104°C)中熔化来去除石蜡。脱蜡后的标本准备好了用于后续组织学分析(例如染色和盖玻片)、化学分析(例如通过提取并至少部分纯化来从组织切片或其一部分中分离蛋白质、DNA或RNA)，或者在室温下稳定地储存。
[0077]实施例2
[0078]可使用本发明的一个实施方式(在图2中显示)采用以下列方式进行组织处理。在微波单元中，在内部形状为回音廊的腔室中，将化学混合物和微波能量与组织标本接触，以硬化组织标本。辐射源M在硬化模块中提供微波能量。在微波单元中的搅拌可通过通气(泵BP)来提供。化学混合物可使用由阀门、液位监测器和泵LP调控的管线在其储藏室和其腔室之间转移。然后，在真空单元中，将硬化的铸造标本与熔化的基质和热能在真空(泵AP)下、在用于浸渗的腔室中接触。焦耳热源H提供在浸渗模块中的热源。真空单元中的搅拌可通过使用同样的泵AP的P/V循环来提供，其还可将熔化的基质在其腔室和其储藏室之间通过由阀门和液位监测器调控的管线来转移。组织标本输入和/或输出一个单元的任何转移可为手动或自动的；在微波单元和真空单元之间的转移优选为自动的。在冷却单元中，将硬化且浸渗过的标本包埋在模具中，所述标本在与导热表面接触时固化，直至形成了固体基质块。通过在包埋模块中的珀耳帖冷却源C从模具中散热。
[0079]可手动或自动地将化学混合物转移到硬化模块中，往浸渗的模块中加入石蜡颗粒。将化学混合物预热，在处理组织标本之前熔化石蜡。抽真空，升压，以在需要的时候转移溶液。分别通过鼓泡(泵BP)或P/V循环(泵AP)来搅拌回音廊2或反应腔室3中的溶液。可任选地使用空气压力来将溶液从储藏室转移到微波单元的回音廊或反应腔室中。可使用流体连接(例如挠性管)和连接上系统的不同元件的连接口来在第一储藏室和回音廊之间用泵LP和电磁阀转移溶液。在真空单元中仅浸渗需要用气泵减压，因为微波单元中的处理(例如硬化和开始浸渗)可在大气压下进行。
[0080]将溶液和反应腔室加热到合适的操作温度。例如，在转移入其回音廊2之前，化学混合物可通过在微波单元的第一储藏室I中的电加热器来预热，并且在将熔化的基质转移到其反应腔室3之前，在真空单元的第二储藏室4中用热能(例如焦耳热源)熔化固体基质。从储藏室的所述转移通常在(每天)操作的开始完成，然后在(每天)操作的末尾通回储藏室。在微波单元中，通过微波热源M将化学混合物的温度保持在约50°C ;在真空单元中，通过辐射加热源R将熔化的基质的温度保持在约62°C。在⑴第一储藏室I和回音廊2之间或(ii)第二储藏室4和腔室3之间的管子和阀门提供了双向流体连接。分别用于化学混合物和熔化的基质的储藏室I和储藏室4是分开的。在微波单元或真空单元中溶液和/或篮子的存在或缺失可使用一个或多个液位监测器检测溶液的体积或位移来确定。
[0081]在卡盒中装载打过孔的含有组织标本的篮子。装载站是可选地，因此篮子可放在装载站(如果有)的空反应腔室中，然后通过传送装置自动转移到回音廊2。但是优选将篮子手动转移到回音廊2 (即，没有装载站)。将含有化学混合物的回音廊2通过微波能量加热。传送装置优选为能可逆地与篮子连接的带钩子的机械臂；将带有可替换的吸收剂衬垫的盘子连在机械臂上，在篮子下面转动以接住滴下的化学混合物或熔化的基质(未显示)。将盖子与回音廊或反应腔室通过铰链相连；每个盖子用橡胶垫圈与回音廊或反应腔室形成密封，并用电动机驱动链来开启/关闭(未显示)。优选在回音廊2和反应腔室3之间自动转移篮子。最后，当组织处理完成时，将装载的篮子从反应腔室3转移。卸载站是可选的，因此可将篮子放在卸载站(如果存在)的空反应腔室中。在站之间转移篮子所需的时间少于约10秒钟。在处理后，可将组织卡盒从篮子移出，来进行后续超薄切片和染色(见图1)。
[0082]可在本系统中使用实施例1中所述的方法。在将含有组织标本的篮子加入微波单元之前，将预热过的化学混合物从第一储藏室I转移到回音廊2。类似地，在将含有组织标本的篮子加入真空单元之前，将熔化的基质从第二储藏室4转移到腔室3。将篮子转移到回音廊2中，使得一个或多个组织标本与化学混合物接触，关闭回音廊的盖子，在微波辐射的作用下继续硬化一个或多个组织标本。当孵育完成时(即组织标本已被恰当地硬化)，打开盖子，并将篮子转移到含有熔化的基质的反应腔室3，在其中孵育一个或多个组织标本，直到完成处理。
[0083]用焦耳热源将含有熔化的基质的反应腔室3可传导地进行加热。或者，电加热器保持与基质接触的管子中的循环水的温度，以使基质保持在熔化状态。例如，管子可在反应腔室3中盘绕；然后该加热盘管可将热传导给内容物。优选通过用将热通过壁导入反应腔室的内容物的电线包裹反应腔室的外壁来去除加热盘管。可通过P/V循环以0.35Kg/cm2的公称压力和500mm Hg真空来实施真空单元中的搅拌。
[0084]每个硬化以及初始浸渗过的组织标本在含有熔化的基质的模具5中灌注。然后灌满的模具通过与具有表面6的冷却单元接触来冷却，所述表面6用珀尔帖冷却源可导热的加热。冷却单元可以或者不可以整合到与微波和真空单元相同的系统中。类似地，切割单元(未显示)可以或者不可以整合到与微波和真空单元相同的系统中。[0085]本文中描述了其他条件(例如孵育的时间和温度)。系统可封入操作室中，以控制可能存在的任何烟雾，并将其排出(烟雾控制)。桌面系统可使用自动传送装置传递组织标本，或可将其人工传递。或者，当没有篮子移动时，具有身体高度的带玻璃窗的门使得操作者能够接触系统，以将篮子装入系统或从系统卸载篮子，并观察篮子的移动。出于安全起见，当回音廊或反应腔室上的机械臂或盖子移动时，优选关闭门。具有膝盖高度的另一扇门使得操作者能够(i)将具有化学混合物的瓶子连接到通向第一储藏室I的口，所述第一储藏室与微波单元相连；并且(ii)在与真空单元相连的第二储藏室4中熔化石蜡。
[0086]图3显示了一个可选的实施方式，与上述系统类似，不同之处在于，没有储藏室。
[0087]在图2和图3两者中，所有单元可在单个装置中实施，它们可在分开的装置中实施，或者微波单元和真空单元可在一个装置中实施，而冷却单元在另一个装置中实施。
[0088]实施例3:实体组织的切割
[0089]可以下列方式使用本发明的另一个实施方式(在图4至图9中显示)来实施组织切割。切割系统包括可消毒的底座20、组织支持物30和组织固定器40。组织支持物30和组织固定器40可用弹性塑料材料(例如丙烯酸)来制备。每个都有大体上平坦的粗糙的表面(例如，具有与新鲜组织相近面积的多个倒钩、钉或锯齿)；在切割期间，两个粗糙表面都与组织接触。固定器在顶部有一手柄，在底部具有粗糙表面。或者，可用手指替代固定器，来给实体组织施加轻微的压力，并将它推向支持物(未显示)。
[0090]组织支持物30通过用手指推入可紧密地与接收孔24相配合，使得支持物30的上表面和底座20大体上互相平齐，并使得当在刀片导轨22的底部和底座20的顶部之间移动时，刀片能组织切片，其中导轨22的至少两个刀鞘延伸到底座20的顶部表面之上。支持物30包括在接收组织的凹陷周围形成的边缘，所述凹陷的深度为约0.6mm(例如，从约0.4mm至约0.8mm,更优选从约0.5mm至约0.7mm)。在将实体组织放到接收组织的凹陷之前,凹陷中可填充用于硬化的化学混合物。作为与底座20分开的支持物30的替代物，支持物30和底座20可作为一个整体形成，从而没有接收孔(未显示)。
[0091]实体组织60可用切割工具50切割。当将组织60放到支持物30的接受组织的凹陷中时，化学混合物可与组织60接触，从接收组织的凹陷中排出，并且溢入邻近孔26。支持物30可通过摩擦保持在其接收孔24中，可通过穿越邻近孔26并用手指撬动它来人工移除支持物30。在底座20中，可将孔26的底部设定得比孔24的底部更高/更低。通过在至少两个在刀片导轨22的底部和底座20的顶部之间所形成的狭缝中移动刀片，切割工具50将组织60切割到约0.6mm (例如，从约0.4mm至约0.8mm,更优选从约0.5mm至约0.7mm)的厚度。切割实体组织提供了具有大体上均一的厚度的组织标本，因为支持物的底部表面和底座的顶部表面大体上互相平行。优选地，导轨22的至少两个刀鞘至少分开成接受组织的凹陷的宽度，和/或延伸到底座的顶部表面以上，至少是接收组织的凹陷的长度。
[0092]手术刀或切割工具(图9)可用于将实体组织切割成一个或多个组织标本。切割工具包括把手52、固定器54和可移动刀片58。固定器具有两个相对的末端:一个末端永久固定在把手上，相对的末端具有在其中形成的间隙。刀片通过螺栓56固定在间隙中，以与刀片和把手的平面垂直的方向行进。将固定器的块放在把手的手柄和刀片之间能通过工具的合适的重量来促进水平的切片运动。
[0093]实施例4:在组织切片中探测抗原[0094]在每个微波单元和真空单元中，将组织标本处理4-5分钟。将每个组织标本都包埋在含有过量石蜡的单个模具中。可通过辅助冷却使组织块固化。在超薄切片机中将石蜡切片切成3微米的厚度，放在水浴中，并悬浮在载玻片上。组织切片中的蜡在玻片上熔化，然后将其在二甲苯浴中脱蜡。使玻片上的切片组织在一系列浓度依次降低的乙醇溶液中再水化，每种浓度一分钟(两个纯乙醇浴，两个95 %的乙醇浴，一个90 %的乙醇浴)，并通过浸没在水中2分钟来清洗。
[0095]用35ml的6%的过氧化氢(H2O2)和140ml的甲醇孵育15分钟来阻断内源性过氧化物酶。将玻片浸没在水中2分钟，然后浸没在磷酸盐缓冲液(PBS)中2分钟来清洗，最后干燥。
[0096]将玻片转移入湿度箱中，并与普通马血清(NHS)接触十分钟，以阻断非特异性结合位点。从玻片倒出过量的普通马血清，在室温下在湿度箱中，在组织切片上孵育特异性一抗30分钟。使用含有PBS的塑料挤瓶并浸没入PBS浴2分钟，来回运动，来洗涤玻片。将过量的PBS从每个玻片干燥除去。往每个组织切片加入连接液(也称为二抗或生物素化的抗兔或抗鼠)，并在室温下在湿度箱中孵育25分钟。兔、大鼠和小鼠二抗(例如，抗Ig-M，抗Ig-G)可从Dako公司(Carpinteria，CA)获得，并以约1:600稀释来使用。使用含有PBS的塑料挤瓶并浸没入PBS浴2分钟来洗涤玻片。将过量的PBS从每个玻片干燥除去。
[0097]根据生产商的指南(Vector Laboratories)来将信号进行显影处理。往组织切片中加入抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)溶液，并在湿度箱中孵育25分钟。使用含有PBS的塑料挤瓶并浸没入PBS浴中的架子2分钟来洗涤玻片。将架子浸没入二氨基联苯胺(DAB)色原中6分钟，然后浸没在流水中，轻轻洗涤4分钟。在室温下，将组织切片用苏木精复染约15秒至90秒(染色时间将取决于苏木精的使用年限)。将玻片在流水下洗涤3分钟，以除去过量的复染剂，在从85%酒精到纯酒精的酒精浴中脱水(每个中约10秒钟)，在二甲苯中透明，并盖玻片。
[0098]除了常用的组织化学染色(例如，H&E和三色染色)，还可实施细胞角蛋白、ER、PR、Her2、E-钙粘蛋白、p63、PSA、EMA, HCA, RCA、AFP、HCG, CD10、CD30、CD31、CD45、CD68 和D2-40抗原的免疫组织化学染色。
[0099]实施例5:从处理过的组织切片提取DNA
[0100]将来自处理过的组织的固体块的两个石蜡切片(每个约5-10 μ m)用一次性刀片切碎。将它们放在1.5ml的微量离心管中，加入800μ I的二甲苯，并通过涡旋振荡器混合，加入400 μ I纯乙醇，并通过涡旋振荡器混合。在微量离心机中将微量离心管离心处理5min,倒出上清液。往沉淀物中加入800 μ I纯乙醇，并且通过涡旋振荡器混合。
[0101]离心之后倒出上清液，然后往沉淀物中加入100 μ I清洁剂和蛋白酶K溶液(1%的ΝΡ40或Triton Χ-100,2.4μ I的2.5mg/ml的蛋白酶K)，在55°C孵育一小时。通过95°C孵育10分钟来使蛋白酶K失活。在微量离心机中离心5分钟后，收集含有DNA的上清液。该材料准备用于PCR。它可以被沉淀和/或进一步提取，如果打算进行Southern印迹。可能需要更多的组织切片，以获得足够的DNA以用于不涉及扩增的分析。对于扩增，则需要较少的切片。
[0102]实施例6:从处理过的铸造切片提取RNA
[0103]将来自处理过的组织的固体块的十个石蜡切片(每个约5-10 μ m)用一次性刀片切碎。将它们放在50ml的离心管中，用20ml的二甲苯脱蜡。将余下的组织用纯酒精洗涤30分钟两次。将组织以0.5gm/ml的浓度悬浮在含有4M硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠pH7.0、
0.5%的N-十二烷基肌氨酸和0.1M的2-巯基乙醇的溶液中。通过涡旋振荡器混合该溶液，通过穿过18至22G (gauge，规格)的注射器针头来切取DNA。
[0104] 将含RNA溶液小心地铺在5ml离心管(Sorvall)中2.8ml的5.7M CsCl上，通过在Beckman L8-53超速离心机、SW55Ti转子，在18°C下以35000rpm的转速离心14小时来沉积RNA。小心地移去最上层的部分，以在离心管的底部留下RNA沉淀。将沉淀用不含RNA酶的水在微量离心管(Eppendorf)中重悬，将微量离心管以HOOOrpm的转速离心10分钟。留下含有RNA的上清液，测量紫外(UV)吸收值:IOD28tZcm的消光系数预计相当于约40 μ I/ml的RNA，并且OD26tZOD28tl的比应在约1.8和约2.0之间。通过变性胶电泳来分离18S和28S rRNA带。18S和28S rRNA条带以预期的比例出现并没有降解表示RNA纯化的质量良好。
[0105]在表述数值范围时,应注意,也描述了在范围之内的所有值(例如，一至十还包括在一和十之间的每个整数值，以及诸如二至十、一至五和三至八的所有中间范围)。用语“约”可指与数量值的测量或变化性相关的统计学不确定性，本领域的技术人员将理解它并不影响本发明的操作或其可专利性。
[0106]在权利要求的含义内和其法律等价物的范围内的所有修改和替换将包括在其范围内。使用连接词“包括”的权利要求允许包括将在所述权利要求的范围内的其他元素；本发明还通过使用连接短语“主要由……构成”(即允许包括将在权利要求的范围内的其他元素，如果它们不实质上影响本发明的操作)和“由……构成”(即除了通常与本发明相伴的杂质或不重要的活动之外，只允许在权利要求中所列的元素)而非“包括”用语的这些权利要求来描述。可使用这三种连接用语中任意项来主张本发明。
[0107]应理解，在本说明书中所描述的元素不应理解为对所主张的发明的限制，除非在权利要求书中有明确说明。因此，所授权的权利要求是确定法律保护范围的基础而非对权利要求作曲解的说明书中的限定。相反，现有技术不包括可以预见本发明或者破坏本发明新颖性的【具体实施方式】，从这个意义上来说现有技术明显不包括本发明。
[0108]此外，在权利要求的各限定之间或之中没有特别的关系，除非这种关系是在权利要求中明确指出的(例如，在产品权利要求中的成分的排列或在方法权利要求中的步骤的顺序并非对权利要求的限制，除非明确指出是限制性的)。在本发明中公开的个体元素的所有可能的组合和排列被认为是本发明的各个方面。类似地，本发明的说明书的概括被认为是本发明的一部分。
[0109]从上所述，对本领域技术人员来说将是显而易见的是本发明可以不偏离其精神或实质性特征的其他特定形式体现。所述的实施方式应认为是解释性的，而非限制性的，因为本发明所提供的法律包括的范围将被所附的权利要求书而非本说明书来指明。
【权利要求】
1.一种用于处理来自于实体组织的标本的系统，所述系统包括: (a)用来硬化标本的硬化模块，所述硬化模块包括(i)具有形为回音廊的内部的第一腔室；(ii)当闭合时关闭第一腔室，对微波辐射无透过性，当开启时连通第一腔室的第一盖子；(iii)将化学烟雾和蒸发保持第一腔室的内部的第一垫圈；以及(iv)将微波能量传递到第一腔室的内部的辐射源；其中所述标本在回音廊中与化学混合物接触； (b)用于浸渗硬化过的标本的浸渗模块，所述浸渗模块包括(i)具有能够提供相对于外部降低的压力的内部的第二腔室；(ii)当闭合时关闭第二腔室，当开启时连通第二腔室的第二盖子；(iii)保持第二腔室的内部和外部之间压差的垫圈；(iv)至少将第二腔室的内的压力降低到小于I巴的泵；以及(V)将热能传输至第二腔室的内部的加热器；其中，硬化的标本与熔化的基质在腔室中接触；以及 (c)用于固化包含硬化及浸渗过的标本的块的包埋模块，所述包埋模块包括从所述块传输热能的冷却器。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述硬化模块进一步包括第一搅拌器，所述第一搅拌器可为通气装置，以在所述回音廊中促进化学混合物与标本之间的溶液交换。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于，所述浸渗模块进一步包括第二搅拌器，其可为循环压力的阀门，以在腔室中促进在熔化的基质和标本之间的溶液交换。
4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述标本实质上被化学混合物、微波能量，或者这两者硬化。
5.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述标本实质上被浸渗，然后再用相同的基质包埋在块中。
6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，辐射源将第一腔室中的化学混合物保持在高于约45°C、高于约50°C、高于约55°C、高于约60°C、低于约60°C、低于约65°C、低于约70°C、低于约75°C或在其间任何范围内的温度下。
7.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，其中腔室中的压力高于约0.0Ol巴、高于约0.01巴、高于约0.1巴、低于约0.2巴、低于约0.3巴、低于约0.4巴、低于约0.5巴、低于约I巴，或者为其间任何范围内的压力。
8.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，加热器将第二腔室中的熔化的基质保持在高于约55°C、高于约60°C、高于约65°C、低于约65°C、低于约70°C、低于约75°C、低于约80°C、低于约85°C，或在其间任何范围内的温度下。
9.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，将冷却器保持在低于约-50°C、低于约-25°C、低于约(TC、低于约+5°C、高于约-200°C、高于约-100°C、高于约-50°C、高于约_25°C，或其间任何范围内的温度下。
10.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，进一步包括至少连接硬化模块和浸渗模块、浸渗模块和包埋模块，或硬化、浸渗和包埋模块的运送装置。
11.根据权利要求10所述的系统，其特征在于，所述运送装置包括连接连续模块的轨道或者电枢。
12.根据权利要求10或11所述的系统，其特征在于，进一步包括具有能让溶液在标本和混合物或基质之间交换的孔的多个载体，其中每个标本装入多个载体中的一个，每个载体可逆地与运送装置相连，使得成批的载体可以连续地被处理。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的系统，其特征在于，进一步包括组织标本进入系统，然后被运输至硬化模块的起始模块。
14.根据权利要求10至13中任意一项所述的系统，其特征在于，进一步包括终止模块，包埋的标本从包埋模块运输至所述终止模块，然后等待被收集。
15.一种用于处理来自于实体组织的标本的方法，包括: (a)在回音廊中硬化标本，其 中所述标本与化学混合物和微波能量接触； (b)在真空下将标本进行浸渗，其中标本与熔化的基质和热能接触；以及 (C)将标本包埋在块中，将所述块固化，其中的固体块被切片，用于手术中组织学检测。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，进一步包括将主体体外的新鲜组织切割以提供标本，其中最初将标本在化学混合物中硬化，所述化学混合物可与在切割期间处理时所用的化学混合物相同或不同。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，标本的厚度小于约1mm，小于约0.8mm,或小于约0.6mm。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述化学混合物为包括(i)至少一种可为丙酮的酮以及(ii)至少一种可为矿物油或松树油的油的非水溶液。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述化学混合物进一步包括至少一种表面活性剂，其可为二甲亚砜。
20.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述基质包括至少一种石蜡。
21.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述标本大体上被化学混合物、微波能量或者这两者硬化。
22.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述标本大体上被浸透，然后再使用相同基质包埋在块中。
23.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述化学混合物在高于约45°C、高于约50°C、高于约55°C、高于约60°C、低于约60°C、低于约65°C、低于约70°C、低于约75°C，或其间任何范围内的温度下。
24.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述真空为高于约0.001巴、高于约0.01巴、高于约0.1巴、高于约0.5巴、高于约0.6巴、高于约0.7巴、低于约0.2巴、低于约0.3巴、低于约0.4巴、低于约0.5巴、低于约0.6巴、低于约0.7巴、低于约0.8巴、低于约0.9巴或低于约I巴，或者其间任何范围内的压力。
25.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，熔化的基质的温度为高于约55°C、高于约60°C、高于约65°C、低于约65°C、低于约70°C、低于约75°C、低于约80°C、低于约85°C，或其间任何范围内的温度。
26.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，将块通过在低于约-50°C、低于约-25°C、低于约(TC、低于约+5°C、高于约-200°C、高于约-100°C、高于约-50°C、高于约_25°C，或其间任何范围内的温度下冷却来固化。
27.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，将标本至少部分地或完全地人工处理。
28.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，将标本至少部分地或完全地自动处理。
29.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在标本与化学混合物和微波能量接触少于约10分钟、少于约8分钟、少于约6分钟、多于约2分钟、多于约4分钟、多于约6分钟或者期间任何范围内的时间之后，标本大体上被硬化。
30.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在标本与熔化的基质和热能接触少于约10分钟、少于约8分钟、少于约6分钟、多于约2分钟、多于约4分钟、多于约6分钟或者期间任何范围内的时间之后，标本大体上被浸透。
31.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在标本被固化少于约5分钟、少于约4分钟、少于约3分钟、多于约I分钟、多于约2分钟、多于约3分钟或者期间任何范围内的时间之后，可切块。
32.一种用于切割实体组织的模块，包括:(a)底座，其包括具有长度和宽度的接收孔、大体上平坦的顶端表面，包括至少两个延伸到顶部表面以上并在期间形成至少两个狭缝的刀鞘的刀片导轨，和在接收孔旁边的邻近孔；以及(b)支持物，其具有与接收孔的长度和宽度大体上相同的长度和宽度，以使得支持物能很好地配合于接收孔内，所述支持物包括未延伸到底座的顶部 表面以上的边缘，具有由边缘形成的深度为约0.6mm的接收组织的凹陷，以及粗糙的大体上平坦的底部表面；其中，支持物的底部表面和底座的顶部表面大体上彼此平行；所述狭缝至少长为支持物的长度，至少以支持物的宽度分开。
33.根据权利要求32所述的模块，其特征在于，进一步包括包含顶部手柄和底部的粗糙表面的组织固定器。
34.根据权利要求1至14中任意一项所述的系统，其特征在于，进一步包括权利要求32或33所述的模块。
35.一种切割工具，其包括把手、固定器和可移动的刀片；其中所述固定器具有两个相反的末端，所述固定器的一个末端永久固定在把手上，所述固定器的相反的末端具有在其间形成的缝隙，刀片被螺栓固定在缝隙之中，并且螺栓沿与刀片和把手平行的平面相垂直的方向行进。
【文档编号】C12M1/42GK103975229SQ201280058253
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2011年9月29日
【发明者】阿佐里徳·R·莫拉莱斯 申请人:迈阿密大学