对从染色的FFPET切片显微切割的材料的RT-qPCR分析的制作方法
【专利说明】对从染色的FFPET切片显微切割的材料的RT-qPCR分析
[0001] 发明背景
[0002] 本描述涉及用于经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片的免疫组织化学染色 的方法，其包括以下步骤：a)提供固体支持物，b)将经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织 切片封固（mount)到固体支持物上，c)自经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片除去 石錯，d)于50至70°C加热固体支持物上封固的组织切片达12至24小时以修复（retrieve) 表位，并e)染色固体支持物上封固的组织切片，其中至少步骤e)在存在0.5至3. OM氯化 钠的情况中实施。本描述进一步涉及用于实施所述方法的试剂盒。
[0003] 福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE)是一种用于在临床常规中供诊断组织学和长期 贮存用的组织固定的公知规程。使用FFPE组织（FFPET)样品的大型档案进行生物标志物 发现研究及早期临床研究。此外，可以使用FFPET样品分离RNA，所述RNA可以在基因表达 分析中进一步应用。虽然来自FFPET样品的RNA显示高度降解，但是它对于RT-qPCR分析 仍然是足够的，只要使用足够量的材料进行RNA分离。可以使用此类分析来产生第一生物 标志物假设并仅进行假设测试（Lohmann等，Methods. 2013Jan ;59 (1))。
[0004] 为了能够自FFPE组织切片分离血管和肿瘤细胞巢并实施RT-qPCR分析，我 们组合下述技术：免疫组织化学染色后自FFPET的激光捕捉显微切割（laser capture micro-dissection, LCM)与 cDNA 的预扩增后的 RT-qPCR 分析。
[0005] 技术人员在组合自经IHC染色的FFPET切片的LCM，接着进行RT-qPCR分析时面 对的挑战是LCM后非常有限量的材料、样品组织固定后的RNA降解和另外免疫组织学染色 规程期间的RNA降解。经典的染色规程包括表位修复（例如于98°C的HIER方案）和与不 能在无 RNA酶条件下生成的缓冲液（抗体溶液、清洗缓冲液、染料）的温育时间。若RNA意 图在RT-qPCR分析中使用，则与LCM后非常有限量的材料组合的所描述RNA降解是此工作 流的主要问题。RNA降解导致LCM后基因表达分析（例如感兴趣生物标志物和参照基因之 间的比率）中不可靠的结果。mRNA稳定性是基因特异性的，并且因此它们在以不同程度降 解，导致用于基因表达分析的相对定量的错误结果。
[0006] 为了克服此RNA降解问题，已经建立了不同规程以使降解保持为最小值。例如，大 多数出版物使用新鲜冷冻（Fresh Frozen, FF)组织，其在用于RT-qPCR分析时具有较少降 解过程的优点。然而，主要的缺点是与FFPET相比FF组织是一种很大程度上有限来源的实 情（Buckanovich等·，Cancer Biol Ther. 2006Jun ;5 (6) :635-42 ;Gjerdrum等·，Diagn Mol Pathol 2004 (13)，p. 224 - 233)。经常难以获得足够量的FF组织来实施产生统计学显著结 果的研究。此外，可用于回顾测试的临床样品材料通常是FFPET。
[0007] 因此，此领域中的主要焦点是开发使RNA降解最小化的与LCM和RT-qPCR分析组 合使用FFPET的技术。开发出用于FFPET切片的超快染色规程以使染色期间的RNA降解最 小化。然而，分析来自此类显微切割的超快染色的FFPET切片的RNA显示了在以非常短的 温育期（2次5分钟）抗体温育后，与简单组织染剂（苏木精）相比仍有约90% RNA被降解 (Gjerdrum等·，Diagn Mol Pathol 2004(13))。另外，超快染色方案不适用于所有抗体，因 为一些需要几小时至过夜温育（Brown等，RNA Journal 2009 (15)，p. 2364-2374)。此类长 期温育规程导致大量RNA降解，从而基因表达分析是简直不可能的。
[0008] 因此，本说明书的目的是提供用于随后为RNA分离使用的FFPET切片的改善的染 色技术，其中改善的染色技术导致对于RNA分析（诸如基因表达分析）足够的自FFPET切 片分离的RNA的产量（yield)和质量。
[0009] 发明概述
[0010] 发现了对固体支持物上封固的组织切片应用的本文中描述的染色方法中0. 5至 3. OM氯化钠的高盐浓度阻止随后自组织切片分离的RNA的降解。根据描述的方法适合于染 色规程，其中在染色后分离RNA且其中需要高质量RNA，诸如用于基因表达分析。
[0011] 如此，本描述涉及对经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片的免疫组织化学 染色的方法，其包括以下步骤：a)提供固体支持物，b)将经福尔马林固定的、经石蜡包埋的 组织切片封固到固体支持物上，c)自经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片除去石蜡， d)于50至70°C加热固体支持物上封固的组织切片达12至24小时以修复表位，并e)染色 固体支持物上封固的组织切片，其中至少步骤e)在存在0. 5至3. OM氯化钠的情况中实施。
[0012] 此外，本描述涉及用于实施如本文中描述的方法的试剂盒，其中试剂盒包含a)用 聚-赖氨酸包被的固体支持物，b)用于表位修复的溶液，和c)用于免疫组织化学染色的溶 液，其包含〇. 5至3. OM浓度的氯化钠。
[0013] 附图简述
[0014] 图1 :图显示了分离的RNA的光谱光度测定浓度分析（spectral photometric concentration analysis)的结果。描绘了来自从未染色的FFPET切片（未染色）分离的、 从在没有氯化钠的情况中（没有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分离的和从在存在氯化钠 的情况中（具有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分离的提取物的RNA浓度的中值+/-标 准差。各从三个独立重复获得数据。
[0015] 图2 :图显示了参照基因 HPRT (次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶）的RT-qPCR 分析的Cp值。描绘了来自RT-qPCR实验的Cp值的中值+/_标准差。RNA是从未染色的 FFPET切片（未染色）分离的、从在没有氯化钠的情况中（没有NaCl)用CD31染色的FFPET 切片分离的和从在存在氯化钠的情况中（具有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分离的。各 从三个独立重复获得数据。
[0016] 图3 :图显示了参照基因 ALASl (delta-氨基乙酰丙酸合酶1)的RT-qPCR分析的 Cp值。描绘了来自RT-qPCR实验的Cp值的中值+/_标准差。RNA是从未染色的FFPET切 片（未染色）分离的、从在没有氯化钠的情况中（没有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分 离的和从在存在氯化钠的情况中（具有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分离的。各从三 个独立重复获得数据。
[0017] 图4 :图显示了分别相对于参照基因 HPRT标准化的标志物1和标志物2的表达。 分别描绘了来自显微切割的肿瘤细胞和血管细胞的标志物1和标志物2的相对基因表达。 一式两份实施实验。
[0018] 发明详述
[0019] 列出以下定义以例示并定义本文中使用的各项术语的意义和范围。
[0020] 除非上下文另有明确指示，术语"一个"、"一种"和"所述/该"一般包括复数提及 物。
[0021] 如本文中使用的，与数值结合的术语"约"通过延伸高于和低于该值的边界来规定 该值。一般地，术语"约"通过高或低5%的差异规定高于和低于叙述值的数值。例如，"约 100"的值意指"95至105"的范围。
[0022] 术语"扩增"一般指从靶核酸生成多个核酸分子，其中引物与靶核酸分子上的特定 位点杂交以提供通过聚合酶延伸的启动位点。可以通过本领域中公知的任何方法（诸如但 不限于：标准PCR、长PCR、热启动PCR、qPCR、RT-PCR和等温扩增）实施扩增。
[0023] 如本文中使用的，术语"抗体"指完整的免疫球蛋白，诸如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM 或指抗体片段，诸如Fab、Fv或Fe或融合抗体、融合抗体片段或抗体的任何其它衍生物。术 语"经标记的抗体"指用酶、荧光染料、化学发光物质、生物素、亲合素或放射性同位素标记 的抗体。
[0024] 术语"表位"指化合物（诸如蛋白质、碳水化合物或脂质）的抗原性区域。抗原性 区域通常由5至8个氨基酸组成。表位被相应抗体的抗原结合位点特异性识别。
[0025] 术语"固定的组织或细胞"在本文中如本领域技术人员已知的那样使用，并且指通 过化学固定方法保存而免于腐烂的生物组织或细胞。此类方法阻止此类生物组织或细胞内 的自溶或腐败。固定终止生物化学反应，并且提高经处理组织的机械稳定性。
[0026] 术语"免疫组织化学"指用于用能够特异性结合组织学样品中的抗原的抗体检测 所述抗原的存在的技术。通常通过用经酶标记的抗体的生色反应或通过荧光标记的抗体进 行对抗体-抗原复合体的检测。
[0027] 如本文中使用的，术语"宏观切割"指通过使用诸如解剖刀或抹刀等工具从固体支 持物（诸如显微镜载玻片）上封固的组织切片刮出感兴趣区域的过程。
[0028] 如本文中使用的，术语"膜载玻片"指在激光捕捉显微切割（LCM)中使用的固体支 持物或显微镜载玻片。对于显微切割，可以使用用膜覆盖的玻璃载玻片或可以用各种膜