钠浓度的缓冲液中冷却固体支持物上封固 的组织切片。在一个具体的实施方案中，缓冲液是TBS-T。在另一个具体的实施方案中，氯 化钠以约2M的浓度存在。
[0050] 在一个实施方案中，固体支持物上封固的组织切片的染色包括基于抗体的染色。 在一个具体的实施方案中，基于抗体的染色包括使用一抗和二抗。在一个更具体的实施方 案中，一抗是CD31结合抗体。在一个甚至更具体的实施方案中，一抗是CD31单克隆抗体 (mAb)克隆JC70。在一个具体的实施方案中，二抗是抗小鼠抗体。在一个更具体的实施方 案中，二抗是与能够将底物转化成一种或多种产物的酶共价结合的。在一个甚至更具体的 实施方案中，二抗是与辣根过氧化物酶（HRP)共价结合的。
[0051] 在于37°C将固体支持物上封固的组织切片与一抗一起温育1小时时，发现基于抗 体的染色提供最佳的结果，其中氯化钠以2M的浓度存在。在一个实施方案中，于34至40°C 实施固体支持物上封固的组织切片与一抗的温育。在一个实施方案中，将固体支持物上封 固的组织切片与一抗的温育实施0. 5至1. 5小时。在一个实施方案中，在存在0. 5至3. OM 氯化钠的情况中实施固体支持物上封固的组织切片与一抗的温育。一个具体的实施方案 中，于约37°C实施固体支持物上封固的组织切片与一抗的温育。在另一个具体的实施方案 中，将固体支持物上封固的组织切片与一抗的温育实施约1小时。在又一个具体的实施方 案中，在存在约2. OM氯化钠的情况中实施固体支持物上封固的组织切片与一抗的温育。在 一个更具体的实施方案中，于约37°C将固体支持物上封固的组织切片与一抗的温育实施约 1小时，其中氯化钠以约2M的浓度存在。
[0052] 在湿度室中于室温将与二抗的温育实施2小时，其中氯化钠以2M的浓度存在。在 一个实施方案中，于16至24°C实施固体支持物上封固的组织切片与二抗的温育。在一个 实施方案中，将固体支持物上封固的组织切片与二抗的温育实施1. 5至2. 5小时。在一个 实施方案中，在存在〇. 5至3. OM氯化钠的情况中实施固体支持物上封固的组织切片与二抗 的温育。在一个具体的实施方案中，于约20°C实施固体支持物上封固的组织切片与二抗的 温育。在另一个具体的实施方案中，将固体支持物上封固的组织切片与二抗的温育实施约 2小时。在又一个具体的实施方案中，在存在约2. OM氯化钠的情况中实施固体支持物上封 固的组织切片与二抗的温育。在一个更具体的实施方案中，于约20°C将固体支持物上封固 的组织切片与二抗的温育实施约2小时，其中氯化钠以约2M的浓度存在。
[0053] 在一个实施方案中，固体支持物上封固的组织切片的染色进一步包括由与二抗 共价结合的酶催化的酶-底物反应。如此，在一个具体的实施方案中，染色包括使用经标 记的抗体。酶可以选自下组：过氧化物酶和碱性磷酸酶。过氧化物酶（诸如HRP)能够转 化选自下组的底物：3, 3' -二氨基联苯胺（3, 3' -diaminobenzidin, DAB)、3_氨基-9-乙 基味 P坐（3-amin〇-9-ethylcarbazol，AEC)、4_ 氯-1-萘酸（4-chlor-1-naphthol，CN)和 对苯二胺二盐酸盐（p-phenylendiamin dihydrochloride)。碱性磷酸酶能够转化选自 下组的底物：萘酸as-mx-磷酸盐、六氮化三氨基-三甲苯基-甲氯化物（hexazotizing triamino-tritolyl-methanchloride)、萘酸 AS-BI-磷酸盐、萘酸 AS-TR-磷酸盐、 5-溴-4-氯-3-吲噪磷酸（5-brom-4-chlor-3_indoxylphosphat，BCIP)、硝基蓝四挫 (nitroblue-tetrazolium, NBT)、鹏硝基四挫紫（iodnitrotetrazolium-violett, INT)、 Fast Red TR、Fast Red LB、Fast Blue BB 和 Fast Garnet GBC0
[0054] 在一个具体的实施方案中，能够转化底物的酶是HRP。在一个具体的实施方案中， 被HRP转化的底物是DAB。在一个实施方案中，在存在0. 5至3. OM氯化钠的情况中实施DAB 染色。在一个具体的实施方案中，氯化钠以约2M的浓度存在。在一个实施方案中，于室温 将DAB染色实施5-20分钟。在一个具体的实施方案中，于室温将DAB染色实施约10分钟。
[0055] 在一个实施方案中，固体支持物是膜载玻片。在一个具体的实施方案中，固体支持 物是适合于LCM的膜载玻片。在一个具体的实施方案中，膜载玻片是聚萘二甲酸乙二醇酯 膜载玻片。已经显示了商品化膜载玻片（诸如聚萘二甲酸乙二醇酯膜载玻片）不适合于根 据本描述的方法。商品化膜载玻片在加热经包被的膜载玻片上封固的组织切片以修复表位 的步骤期间没有提供对FFPET切片的足够粘附。为了改善加热步骤期间膜载玻片和FFPET 切片之间的粘附，用聚-L-赖氨酸包被膜载玻片，所述膜载玻片以将FFPET切片稳定附着于 膜载玻片的方式提高膜载玻片和FFPET切片之间的粘附。
[0056] 在一个实施方案中，自固体支持物上封固的染色组织切片切出感兴趣区域的步骤 包括显微切割或宏观切割感兴趣区域。在一个具体的实施方案中，显微切割的步骤包括自 组织样品切割并分离一种或多种特定细胞或感兴趣区域的过程。例如，可以使用激光捕捉 显微切割（LCM)通过用激光切割相关区域实施显微切割。在一个具体的实施方案中，宏观 切割的步骤包括通过使用诸如解剖刀或抹刀等工具从固体支持物（诸如显微镜载玻片）上 封固的组织切片刮出感兴趣区域的过程。
[0057] 在根据描述的方法中，在附着于膜载玻片的染色FFPET切片上使用LCM以从组织 切片切出感兴趣区域。随后，使用感兴趣区域进行RNA分离。在一个实施方案中，感兴趣区 域具有〇.5-5mm2的大小。在一个具体的实施方案中，感兴趣区域具有l-2mm2的大小。使 用本领域中公知的方法（诸如通过使用High Pure FFPET RNA Isolation Ki働(Roche Diagnostics GmbH))从感兴趣区域分离RNA。随后，将分离的RNA逆转录以获得cDNA。由 于有限量的cDNA并且为了提供对于qPCR实验足够的核酸，可以在通过qPCR扩增前对cDNA 实施预扩增步骤。如此，在一个实施方案中，根据描述的方法进一步包括以下步骤：f)自经 包被的膜载玻片上封固的染色组织切片显微切割感兴趣区域，g)从感兴趣区域分离RNA， h)将分离的RNA逆转录成cDNA，i)预扩增cDNA，并j)扩增和定量预扩增的cDNA。在一个 具体的实施方案中，通过实时PCR实施扩增和定量预扩增的cDNA的步骤。
[0058] 在一个具体的实施方案中，本描述涉及用于对经福尔马林固定的、经石蜡包埋的 组织切片的免疫组织化学染色的方法，其包括以下步骤：a)提供用聚-L-赖氨酸包被的膜 载玻片，b)将经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片封固到膜载玻片上，c)通过在二 甲苯中温育固体支持物上封固的组织切片自经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片除 去石蜡，d)于约60°C将膜载玻片上封固的组织切片加热16小时以修复表位，并e)通过使 用经标记的抗体染色膜载玻片上封固的组织切片，f)从膜载玻片上封固的染色组织切片显 微切割具有l_2mm2大小的感兴趣区域，g)从感兴趣区域分离RNA，h)将分离的RNA逆转录 成cDNA，i)扩增和定量cDNA，其中至少步骤e)在存在约2M氯化钠的情况中实施，且其中 通过实时PCR实施扩增和定量cDNA的步骤。
[0059] 本描述进一步涉及用于实施如上文描述的方法的试剂盒。如此，本描述进一步涉 及用于实施用于对经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片的免疫组织化学染色的方法 的试剂盒，所述方法包括以下步骤：a)提供固体支持物，b)将经福尔马林固定的、经石蜡包 埋的组织切片封固到固体支持物上，c)自经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片除去 石蜡，d)于50至70°C加热固体支持物上封固的组织切片达12至24小时以修复表位，并 e)染色固体支持物上封固的组织切片，其中至少步骤e)在存在0. 5至3. OM氯化钠的情况 中实施。在一个实施方案中，氯化钠以1. 5至2. 5M的浓度存在。在一个更具体的实施方案 中，氯化钠以约1. 8至2. 2M的浓度存在。在一个甚至更具体的实施方案中，氯化钠以约2M 的浓度存在。
[0060] 在一个实施方案中，用试剂盒实施的方法进一步包括以下步骤：f)从固体支持物 上封固的染色组织切片切割感兴趣区域，g)从感兴趣区域分离RNA，h)将分离的RNA逆转 录成cDNA，i)扩增和定量cDNA。在一个实施方案中，以一步PCR实施步骤h)和i)。在另 一个实施方案中，以两步PCR实施步骤h)和i)。在一个具体的实施方案中，通过实时PCR 实施扩增和定量cDNA的步骤。
[0061] 在一个实施方案中，用于实施根据描述的方法的试剂盒包含a)固体支持物，b)用 于表位修复的溶液，和c)用于免疫组织化学染色的溶液，其包含0. 5至3. OM浓度的氯化 钠。在另一个实施方案中，用于实施根据描述的方法的试剂盒包含a)用聚-赖氨酸包被 的膜载玻片，b)用于表位修复的溶液，和c)用于免疫组织化学染色的溶液，其包含0. 5至 3. OM浓度的氯化钠。在一个具体地点实施方案中，试剂盒进一步包含对于实施从RNA逆转 录成cDNA、cDNA的扩增和定量必需的所有试剂。在另一个具体的实施方案中，试剂盒包含 对于实施从RNA逆转录成cDNA、预扩增cDNA、和扩增和定量预扩增