P-糖蛋白生物亲和色谱柱的制备方法及其应用与流程

本发明属于医药
技术领域：
，涉及一种p-糖蛋白生物亲和色谱柱的制备方法及其应用。
背景技术：
：p-糖蛋白（p-gp）是一种分子量170kd的跨膜糖蛋白，它具有能量依赖性“药泵”功能。是依赖atp酶的药物输出泵，也是ca2+和cl-的通道。其通过atp直接或间接地将药物泵出细胞，使细胞内药物泵出细胞外，减低了细胞内的药物浓度使细胞产生耐药性。抑制p-gp转运底物的物质被称为p-gp抑制剂。p-gp抑制剂可通过阻断药物外排来提高治疗药物的生物利用度，近年来，它已被广泛用于临床上提高化疗药物的疗效。很多药物及试剂等均被证实为p-gp抑制剂，如维拉帕米、人参皂甙rg3、柚皮素、川芎、丹皮、胡椒碱、辣椒素等。现有的体外筛选p-gp底物和抑制剂的方法常见为双向转运、摄取外排和atp酶活性测定法，但是这些方法均存在实验周期长（一般培养21天以上）且细胞模型只能一次性使用，不适合大批量靶点药物的筛选的问题。本申请技术方案旨在提供一种可进行多次使用的p-糖蛋白靶点药物初步筛选方法，而且每次筛选只需数十分钟或数小时。技术实现要素：本发明旨在提供一种具有专属性强、亲和吸附性强、系统稳定性能好、使用寿命长等优点的p-糖蛋白生物亲和色谱柱，应用于p-糖蛋白靶点药物的检测。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种p-糖蛋白生物亲和色谱柱的制备方法，包括如下步骤：提取caco-2细胞中含有p-糖蛋白的质膜层于透析袋中，透析后得到富含p-糖蛋白的质膜溶液，将质膜溶液与氨基键合硅胶混匀后静置离心，沉淀物加入tris-hcl溶液混匀后得到的p-糖蛋白质膜固定相混悬液，将p-糖蛋白质膜固定相混悬液注入空白柱芯，装柱完全后得到p-糖蛋白生物亲和色谱柱。进一步地，所述的质膜合并层为在对caco-2细胞进行质膜提取后通过westernblot方法选择富含p-糖蛋白的质膜层的合并层。所述的质膜溶液与氨基键合硅胶的用量比为0.6ml∶0.6~1.2g。所述装柱完全为检测装柱后流出液时不应检出总蛋白和总胆固醇含量。本发明还提供了依照上述方法制备的p-糖蛋白生物亲和色谱柱在筛选p-糖蛋白靶点药物中的应用，所述的应用为采用色谱分析方法，以乙酸铵为流动相，色谱柱为p-糖蛋白生物亲和色谱柱，进行高效液相色谱分析，当待测样品中有色谱峰保留说明待测样品中含有p-糖蛋白靶点药物，否则则无；所述有色谱峰保留是指待测样品中色谱峰的保留时间长于对照空白柱，且出峰范围较宽。进一步地，色谱分析中所述流动相乙酸铵的浓度为5~15mmol/l；所述高效液相色谱的色谱柱温为37℃，流动相流速为0.2~0.4ml/min。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从caco-2细胞中提取富含p-糖蛋白的质膜，与氨基键合硅胶构建p-糖蛋白生物亲和色谱柱，将构建的p-糖蛋白生物亲和色谱柱应用在色谱分析中验证其能与p-糖蛋白为靶点的药物特异性结合，对p-糖蛋白阳性药物维拉帕米具有特异性亲和吸附功能，而对非p-糖蛋白靶点的药物无吸附。为p-糖蛋白靶点药物的筛选提供了新的方法，具有广阔的应用前景。发明制备的富含p-糖蛋白生物亲和色谱柱经过性能评价，证明具有很强的专属性、稳定性、使用寿命长，具有良好的应用前景。附图说明图1是离心后的caco-2细胞质膜分层情况图；图2是caco-2细胞质膜p-糖蛋白表征情况图；图3是caco-2细胞质膜的免疫荧光成像图，图中，a为caco-2细胞质膜的空白对照；b为提取的p-gp蛋白质膜免疫荧光成像图；图4是p-糖蛋白质膜硅胶固定相电镜表征图，图中，a是空白硅胶，b是p-糖蛋白质膜硅胶的生物亲和硅胶固定相；图5是流动相乙酸铵浓度分别在5mmol/l、10mmol/l和15mmol/l时p-糖蛋白生物亲和色谱柱对维拉帕米的吸附性能对比图；图6是流速分别为0.2ml/min、0.3ml/min和0.4ml/min时p-糖蛋白生物亲和色谱柱对维拉帕米的吸附性能对比图；图7是柱温分别为27℃、37℃和47℃时p-糖蛋白生物亲和色谱柱对维拉帕米的吸附性能对比图；图8是p-糖蛋白生物亲和色谱柱专属性评价图；图中，a是吡嗪酰胺-空白柱色谱图，b是维拉帕米-空白柱色谱图，c是吡嗪酰胺-p-糖蛋白生物亲和色谱柱色谱图，d是维拉帕米-p-糖蛋白生物亲和色谱柱色谱图；图9是p-糖蛋白生物亲和色谱柱在第0天、第30天和第90天时的保留时间对比图；图10是p-糖蛋白生物亲和色谱柱在使用时间为0小时、48小时、96小时、120小时和200小时的保留时间对比图。具体实施方式以下，将结合说明书附图及具体实施方式，对本发明的技术方案及优点做出更加详细的解释和说明。应当理解的是，说明书、具体实施方式及说明书附图中所呈现的内容，仅仅为了更加清楚地说明本发明的技术方案及其优点，并不对本发明的保护范围构成限制。本发明采用的仪器及试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。实施例1：培养caco-2细胞：caco-2细胞的培养条件为含10%胎牛血清，1%双抗和1%非必需氨基酸的高糖培养基，细胞量以长满20个25cm2细胞瓶计数，收集细胞。在收集到的caco-2细胞中加入质膜提取液，质膜提取液的成分为：1ml裂解液（1%triton-100，10mmol/ltris，150mmol/lnacl，2.5mmol/ledta）、10μl100mmol/lpmsf和75μl抑肽酶；轻轻打匀细胞后在4℃下进行研磨，研磨后静置15min，将细胞破碎液转移至专用离心管，后沿壁以细流水状依次缓慢加入体积比为2:2:1的80%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液、5%蔗糖溶液，蔗糖层出现分界面于4℃静置20min，在4℃，200000g离心条件下离心16h后取出；图1是离心后的caco-2细胞质膜分层情况图，如图1可见，离心后的caco-2细胞从上至下依次被分为7层肉眼可见的絮状层，其中，最下方为沉淀层。将以p-糖蛋白为表征蛋白分别对各个絮状层进行westernblot表征，鉴定收集提取富含丰富p-糖蛋白的质膜层；将收集到含有丰富p-糖蛋白的质膜合并层于3000da透析袋中在ph7.4的pbs中透析48小时得到富含p-糖蛋白的质膜溶液，放入-80℃冰箱保存待用。图2是caco-2细胞质膜中的p-糖蛋白表征情况图；图中，数字1-6依次表示第1层至第6层絮状层，数字7表示沉淀层；如图2所示，结果表明第3-6层富含丰富p-糖蛋白，而沉淀层p-糖蛋白几乎无表达；由此可见，收集提取的质膜层为第3-6层絮状层；以p-gp单克隆抗体为一抗、荧光标记的羊抗兔为二抗进行间接免疫荧光实验，对提取的富含p-gp的质膜合并层进行进一步验证。图3是caco-2细胞质膜的免疫荧光成像图，其中，a为caco-2细胞质膜的空白对照；b为提取的p-gp的质膜合并层免疫荧光成像图；如图3所示，将空白对照和提取的p-gp的质膜合并层置荧光显微镜下观察，观察到提取物发出特异性的荧光，进一步验证了收集到的p-gp的质膜合并层（第3-6层）富含p-糖蛋白，可充分提取p-糖蛋白。取0.6ml富含p-糖蛋白的质膜溶液与0.6g氨基键合硅胶在4℃下振摇48小时，静置离心，沉淀物加入100mmtris-hcl溶液混匀后，得到富含p-糖蛋白质膜固定相混悬液，备用。富含p-糖蛋白质膜固定相混悬液的鉴定：取0.1~1ml制备的质膜固定相混匀液置盖玻片上，于室温自然干燥。取该干燥粉末直接固定在导电胶上，进行喷金、扫描电镜拍摄表征。图4是富含p-糖蛋白质膜硅胶固定相电镜表征图，图中，a是空白硅胶，b是富含p-糖蛋白质膜硅胶的生物亲和硅胶固定相；如图4所示，与空白硅胶相比，富含p-糖蛋白的质膜包裹硅胶且未出现脱落现象，说明p-糖蛋白成功连接在硅胶表面，富含p-糖蛋白质膜硅胶固定相混悬液制备完成。准备色谱空柱芯、柱套，和对应的筛板。装柱前，先用双蒸水进行冲洗，后将柱芯按照柱套上箭头指示的方向装好，并在下端安装上筛板。采用50mpa的压力装柱，将制备的富含p-糖蛋白质膜固定相混悬液缓慢注入柱芯，采用pbs作为装柱液，用hplc泵以2ml/min的流速加压加速填充至柱前压力上升缓慢为止，后打开柱套和上筛板，再次将固定相悬液缓慢注入芯中，反复多次，至柱压力稳定，接收装柱时的流出液测定总蛋白和胆固醇含量，以判断是否装填完全；空白硅胶柱装填方法同上，区别在于注入柱芯的为未结合质膜的纯硅胶；对装柱前后质膜中蛋白和胆固醇含量的测定，判断装柱完全，效果良好。表1是p-糖蛋白生物亲和色谱柱装柱前后总蛋白和总胆固醇含量；由表1可见，p-糖蛋白生物亲和色谱柱完成装填。表1.装柱前后总蛋白和总胆固醇含量质膜用量(ml)硅胶用量(g)总蛋白mg（装柱前/流出液）总胆固醇mmol/gprot（装柱前/流出液）0.60.60.8068/-0.3845/-注：“-”表示未检测出。实施例2：在收集到的caco-2细胞中加入1ml裂解液（1%triton-100，10mmol/ltris，150mmol/lnacl，2.5mmol/ledta）、10μl100mmol/lpmsf和75μl抑肽酶，轻轻打匀细胞后在4℃下进行研磨，研磨后静置15min，将细胞破碎液转移至专用离心管，后沿壁以细流水状依次缓慢加入体积比为2:2:1的80%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液、5%蔗糖溶液，蔗糖层出现分界面于4℃静置20min，在4℃，200000g离心条件下离心16h后收集提取质膜层，质膜层取第3-6层絮状层；将收集到的质膜层于3000da透析袋中在ph7.4的pbs中透析36小时得到富含p-糖蛋白的质膜溶液，放入-80℃冰箱保存待用；取0.6ml富含p-糖蛋白的质膜溶液与1.2g氨基键合硅胶在4℃下振摇48小时，静置离心，沉淀物加入100mmtris-hcl溶液混匀后，得到富含p-糖蛋白质膜固定相混悬液，将p-糖蛋白质膜固定相混悬液注入空白柱芯，验证装柱完全后得到p-糖蛋白生物亲和色谱柱。实施例3：测定流动相浓度分别为5mmol/l、10mmol/l和15mmol/l的乙酸铵时p-糖蛋白生物亲和色谱柱对p-糖蛋白阳性药维拉帕米的保留时间，考察不同浓度下流动相对吸附性能的影响。色谱条件：p-糖蛋白生物亲和色谱柱30mmx4.6mm；流速为0.3ml/min；柱温37℃；进样量20μl；进样浓度200μg/ml；紫外检测器；检测波长为228nm。图5是流动相乙酸铵浓度分别在5mmol/l，10mmol/l和15mmol/l时p-糖蛋白生物亲和色谱柱对维拉帕米的吸附性能对比图；由图5可见，乙酸铵浓度分别在5mmol/l，10mmol/l和15mmol/l时出峰时间分别为100min，65min和50min。可知，随着流动相乙酸铵浓度的提高，保留组分的出峰时间越早。实施例4：分别测定流速分别为0.2ml/min、0.3ml/min和0.4ml/min时的p-糖蛋白生物亲和色谱柱对p-糖蛋白阳性药维拉帕米的保留时间，考察不同流速对色谱柱吸附性能的影响。色谱条件：p-糖蛋白生物亲和色谱柱30mmx4.6mm；流动相10mmol/l乙酸铵（ph7.2-7.4）；柱温37℃；进样量20μl；进样浓度200μg/ml；紫外检测器；检测波长228nm。图6是流速分别为0.2ml/min、0.3ml/min和0.4ml/min时p-糖蛋白生物亲和色谱柱对维拉帕米的吸附性能对比图；由图6可见，流速为0.2ml/min出峰时间175min，流速为0.3ml/min时出峰时间61.5min，流速为0.4ml/min出峰时间为46min，在0.2ml/min~0.4ml/min的流速范围内，保留效果较好。实施例5：分别测定色谱柱温度为27℃、37℃和47℃时的p-糖蛋白生物亲和色谱柱对p-糖蛋白阳性药维拉帕米的保留时间，考察不同柱温对色谱柱吸附性能的影响。色谱条件：p-糖蛋白生物亲和色谱柱30mmx4.6mm；流动相10mmol/l乙酸铵（ph7.2-7.4）；流速0.3ml/min；进样量20μl；进样浓度200μg/ml；紫外检测器；检测波长228nm。图7是柱温分别为27℃、37℃和47℃时p-糖蛋白生物亲和色谱柱对维拉帕米的吸附性能对比图；由图7可见，随着温度升高，出峰时间提前。27℃出峰时间较长，而柱温47℃时出峰时间最早，考虑到p-糖蛋白的外排作用是在人体生理环境条件下发生的，为尽可能保证生物色谱的亲和筛选的微环境更接近于真实情况，综合考虑选择37℃为柱温进行分析。实施例6：由于吡嗪酰胺与p-糖蛋白的功能和表达无明显影响。由此选择吡嗪酰胺作为p-糖蛋白阴性药。以保留时间为指标，分别考察p-糖蛋白阴性药吡嗪酰胺和p-糖蛋白阳性药维拉帕米在空白柱和p-糖蛋白生物亲和色谱柱的保留情况。色谱条件：p-糖蛋白生物亲和色谱柱30mmx4.6mm；流动相10mmol/l乙酸铵；流速为0.3ml/min；柱温37℃；进样量20μl；进样浓度200μg/ml；紫外检测器；吡嗪酰胺检测波长为268nm；维拉帕米检测波长228nm。图8是p-糖蛋白生物亲和色谱柱专属性评价图；图中，a是吡嗪酰胺-空白柱色谱图，b是维拉帕米-空白柱色谱图，c是吡嗪酰胺-p-糖蛋白生物亲和色谱柱色谱图，d是维拉帕米-p-糖蛋白生物亲和色谱柱色谱图。由图7可见，空白柱对p-糖蛋白阳性药维拉帕米和p-糖蛋白阴性药吡嗪酰胺均无保留，而p-糖蛋白生物亲和色谱柱对p-糖蛋白阴性药吡嗪酰胺无保留，对p-糖蛋白阳性药维拉帕米保留时间为61.5min，保留范围为50~120min，有强保留，由此可见，本发明构建的p-糖蛋白生物亲和色谱柱专属性较好，重现性好，作用于p-糖蛋白靶点的药物维拉帕米与caco-2质膜上的受体有较强的结合能力，该生物亲和色谱模型可以应用于p-糖蛋白底物和抑制剂的体外筛选。实施例7：分别测定放置于4℃冰箱保存的第0天，第30天和第90天时的p-糖蛋白生物亲和色谱柱对p-糖蛋白阳性药维拉帕米的保留时间。色谱条件：p-糖蛋白生物亲和色谱柱30mmx4.6mm；流动相10mmol/l乙酸铵；流速为0.3ml/min；柱温37℃；进样量20μl；进样浓度200μg/ml；紫外检测器；检测波长228nm。图9是p-糖蛋白生物亲和色谱柱在第0天、第30天和第90天时的保留时间对比图；如图9所示，在第0天、30天和90天时维拉帕米的保留时间分别为66.6min，69.2min和61.5min，rsd=5.96%(n=3)，色谱保留行为无明显差异，说明p-糖蛋白生物亲和色谱柱在制备之后保存于4℃冰箱90天时，其色谱保留活性仍然较好，可见本发明的生物亲和色谱柱具有较好的稳定性。实施例8：分别测定使用时间为0小时、48小时、96小时、120小时和200小时后的p-糖蛋白生物亲和色谱柱对p-糖蛋白阳性药维拉帕米的保留时间，考察使用时间对色谱柱吸附性能的影响。色谱条件：p-糖蛋白生物亲和色谱柱30mmx4.6mm；流动相10mmol/l乙酸铵；流速为0.3ml/min；柱温37℃；进样量20μl；进样浓度200μg/ml；紫外检测器；检测波长为228nm。图10是p-糖蛋白生物亲和色谱柱在连续使用时间为0小时、48小时、96小时、120小时和200小时的保留时间对比图；由图10可见，色谱柱在连续使用200h后对阳性药维拉帕米的保留时间仍无显著变化，说明在连续使用200h后对阳性药维拉帕米的保留无显著变化。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页12