对幽门螺杆菌定居具有抑制活性的糖蛋白的制作方法

专利名称：对幽门螺杆菌定居具有抑制活性的糖蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够从胃根除与消化性溃疡的出现相关的幽门螺杆菌的糖蛋白，还涉及包括该糖蛋白的幽门螺杆菌定居的抑制剂，和包括该抑制剂的药物和食品。
目前据认为从胃根除幽门螺杆菌是完全治愈消化性溃疡所必要的。如下所述，通常将抗生素与胃酸分泌抑制剂结合给药提议为根除幽门螺杆菌的治疗方案。
幽门螺杆菌是在一个末端具有鞭毛的并且在人的胃粘膜定居的螺杆状的革兰氏阴性细菌。澳大利亚的B.J.Marshall和J.R.Warren在1983年报道了在来自于胃炎或胃溃疡的患者的胃的生物活检样本中经常检测到该细菌。当时，将该细菌命名为幽门弯曲菌，因为其形态和生长特性与弯曲菌属相似。之后，发现该细菌的外膜的脂肪酸组成和核糖体16S-RNA的序列与弯曲菌属不同。因此现在将该细菌称作为幽门螺杆菌并且属于新建立的螺杆菌属。
自那以后，基于流行病的研究公开了许多报告，表明该细菌引起胃炎，胃溃疡和十二指肠溃疡并且与疾病例如胃癌相关。一旦幽门螺杆菌定居在胃粘膜上，它存活并且居留于胃，不能被根除，虽然对其感染的免疫应答是强烈的，即抗体效价是高的。因此，除非通过抗生素的治疗从胃完全去除幽门螺杆菌，否则在抗生素停止给药后约一个月感染将回到治疗前的相同水平。另外，由盐酸将胃的pH保持在低水平，盐酸是强酸因此大多数抗生素趋向于被失活。由于该原因，将抗生素和强烈抑制胃酸分泌的质子泵抑制剂结合用于根除幽门螺杆菌。
但是，长期抗生素给药具有增加抗性菌株以及引起副作用的严重问题。
日本专利申请公开号11-263731公开了奶脂小球膜组分有效地抑制幽门螺杆菌感染。但是，公开的内容仅仅讲授了抑制幽门螺杆菌的血凝集作用的能力可作为对幽门螺杆菌感染的抑制作用的证据。另外该公开内容说明奶脂小球膜含有各种各样的成分，并且没有说明哪些成分是有效的。同样，Siiri Hirmo等也指出，胃粘蛋白和奶糖蛋白，尤其是从牛酪乳制备的脂小球膜抑制唾液酸-特异性幽门螺杆菌的血凝集作用(FEMS免疫学与医学微生物20(1998)，第275-281页)。但是已经报道了幽门螺杆菌的血凝集素表达和结合胃粘膜细胞的能力之间没有关系(M.Clyne&B.Drnmm，感染和免疫，1993年10月，第4051-4057页)。因此，上面提到的专利公开和文章没有讲授或提示能够抑制幽门螺杆菌对胃粘膜的吸附的物质。
此外，上面的专利公开和文章没有阐明用于幽门螺杆菌和胃粘膜之间吸附的粘附素和胃粘膜上的受体，它们是抑制幽门螺杆菌感染的重要的靶。
本发明的目的之-是提供幽门螺杆菌定居的有效的和安全的抑制剂，所述定居与消化性溃疡的出现相关，该抑制剂能够有效抑制幽门螺杆菌定居，没有副作用和不增加与抗生素的使用相关的抗药性菌株，并且提供适用于治疗或预防消化性溃疡的药物和食品。
根据下面的描述，本发明的其他目的和优点以及特性是显而易见的。
通常，细菌建立感染的第一步是细菌与宿主细胞的吸附并且通过细菌的生长而定居。对于细菌与宿主细胞的吸附，粘附素不得不与宿主细胞表面的受体结合。由该粘附素和受体决定细菌的感染位点的特异性。如果当细菌与宿主细胞吸附时存在受体分子，那么出现竞争性抑制，没有建立感染。
据认为幽门螺杆菌的粘附素和人胃粘膜上的受体是抑制幽门螺杆菌感染的靶分子。本发明人根据对幽门螺杆菌吸附的机理的研究，澄清了尚没有被阐明的幽门螺杆菌的粘附素是幽门螺杆菌产生的脲酶(日本专利申请公开号10-287585)。
本发明人已经研究了能够抑制脲酶与胃粘膜的吸附的物质并且已经发现糖蛋白例如来自于牛奶的糖蛋白或来自于鸡蛋的蛋清的糖蛋白能够通过特异性结合到脲酶上而去除胃中定居的幽门螺杆菌，该脲酶是一种粘附素，定位于幽门螺杆菌细胞的表面层，并且此外已经发现，使用能够甚至以小量而特异性地结合到脲酶上的糖蛋白能够显著有效去除幽门螺杆菌，其中通过利用与脲酶特异性结合而从这些含有糖蛋白的物质分离和纯化糖蛋白。
根据本发明，通过利用与幽门螺杆菌脲酶的特异性结合的亲和柱技术从含有糖蛋白的物质分离和纯化能够特异性结合到脲酶上的糖蛋白，并且将分离和纯化的糖蛋白用作为幽门螺杆菌定居的抑制剂。
在一个方面，本发明提供了特异性结合到幽门螺杆菌的脲酶上的糖蛋白，通过利用与幽门螺杆菌脲酶的特异性吸附的方法进行分离和纯化获得了糖蛋白。
在另一个方面，本发明提供了幽门螺杆菌定居的抑制剂，它包含上面提到的作为活性成分的糖蛋白。本发明也提供了适用于预防或治疗哺乳动物(包括人)的由幽门螺杆菌引起的或与幽门螺杆菌相关的疾病(例如消化性溃疡)的药物组合物，包括上面提到的糖蛋白和药物学可接受的载体或稀释剂。此外，本发明提供了当以有效量摄取时能够预防或治疗哺乳动物(包括人)的由幽门螺杆菌引起的或与幽门螺杆菌相关的疾病(例如消化性溃疡)的食品，它包含上面提到的糖蛋白。
优选地，用于本发明的利用特异性吸附到幽门螺杆菌脲酶上的方法是利用固定了幽门螺杆菌脲酶的柱的亲和层析方法。该柱上固定的脲酶可以是重组脲酶。
附

图1是显示脲酶与纯化的猪胃粘蛋白粘附方式的图。
附图2是显示脲酶粘附的抑制速率的图。
附图3是显示幽门螺杆菌定居的小鼠中幽门螺杆菌的去除速率的图。
根据本发明，通过利用特异性结合到幽门螺杆菌脲酶上的方法从含有糖蛋白的物质分离和纯化能够特异性结合到脲酶上的糖蛋白。
用于本发明的含有糖蛋白的物质可以是含有糖蛋白的物质例如哺乳动物的奶或禽类的蛋的蛋清，卵带，卵黄膜或蛋黄。优选的是，使用牛奶的乳清和鸡蛋的蛋清，特别是高分子量的乳清蛋白浓缩物和高分子量蛋清蛋白质浓缩物。
糖蛋白是缀合的蛋白质，其中由约2-6种类型的单糖组成的糖链共价结合到的蛋白质。糖蛋白在生物体中广泛分布。包含于糖蛋白的单糖是N-乙酰-D-葡糖胺，N-乙酰-D-半乳糖胺，D-甘露糖，D-半乳糖，L-岩藻糖，唾液酸等等。有分子量和构型不同的各种各样的糖蛋白存在。根据在糖链和蛋白质之间键的形式，通常有两种类型的糖蛋白，即N-连接的糖蛋白和O-连接的糖蛋白(粘蛋白型)。糖蛋白的糖链的类型，分子量和构型以及功能或生理活性依赖于所存在的糖蛋白的位置而变化。
包含于牛奶的糖蛋白包括乳铁蛋白，分泌性IgA，IgG，IgM，游离的分泌性成分(FSC)，奶粘蛋白等等。包含于鸡蛋的蛋清的糖蛋白包括卵类粘蛋白，卵清蛋白，卵运铁蛋白，卵黄高磷蛋白，卵粘蛋白等等。
在制备含有糖蛋白的物质时，可以使用任何已知的方法。通过用常规方式从奶去除乳脂和酪蛋白以获得乳清，随后用合适的方式例如超滤膜处理进行乳清的分级浓缩以获得高分子量的乳清蛋白质浓缩物(含有糖蛋白的物质)，从牛奶制备含有糖蛋白的物质。也可以这样制备含糖蛋白的物质，即，从乳清除去脂蛋白，任选接着浓缩和透析，随后采用合适的方式例如利用Sepharose柱的凝胶过滤方法等等和用膜处理对获得的物质进行纯化。任选地，可进行进一步的处理例如蛋白酶处理，碱性水解等等以便获得低分子量的糖蛋白。用于本发明的牛奶可以是初乳或初乳后面产生的牛奶。
例如采用下面的程序可以从鸡蛋的蛋清制备含有糖蛋白的物质。将浓稠的蛋清与收集的蛋清分离。通过超离心回收胶状的部分并且采用例如超声波处理或匀浆化处理技术将它溶解。通过凝胶过滤，膜处理或任何其他技术处理得到的溶解的物质以获得含有糖蛋白的物质。如果必要将由此获得的含有糖蛋白的物质进一步利用程序例如凝胶过滤进行纯化。
通常通过匀浆化或超声波处理将糖蛋白溶解并且然后通过凝胶过滤或乙醇沉淀分离高分子量组分，从消化道粘膜或其凝胶层回收含有糖蛋白的物质。通过用盐酸胍、脲，盐溶液，或表面活性剂提取，或用还原试剂或蛋白酶处理，进行含有糖蛋白的物质的溶解。通过与四价铵盐形成不溶的复合物或通过在酸性条件下沉淀，回收一些种类的含有糖蛋白的物质。
有利的是，将牛奶或鸡蛋的蛋清用作含糖蛋白的物质的原料，因为这些物质可以廉价、大量地获得，而且可以轻易地用简单的程序从其制备含糖蛋白的物质。同样，在由奶制备含糖蛋白的物质时，可使用奶乳清。过去，由于没有利用奶乳清的有效方式而将其丢弃，尽管在制造乳酪等的过程中奶乳清作为副产品而大量产生。因此，可以在工业上大量地从乳清制备含糖蛋白的物质，而且就成本和可行性而言使用得自奶的含糖蛋白的物质是非常有利的。
有利的是，牛奶或鸡蛋的蛋清中的糖蛋白是高稳定性的并且不会因为加热或在低pH时而失去其生理学活性，因此易于从起始材料回收和纯化，就配制为食品或药物，加工和储存而言都是有利的。
利用与脲酶特异性吸附的方法可用于从含有糖蛋白的物质分离和纯化特异性结合到幽门螺杆菌脲酶上的糖蛋白。优选的是，使用固定了幽门螺杆菌脲酶的柱的亲和层析方法。作为固定于柱上的脲酶，优选的是使用重细脲酶，因为可以获得大量的匀质的脲酶。
可以常规方式制备重组脲酶。例如可以提取幽门螺杆菌的基因组DNA，通过PCR方法将编码脲酶分子的基因扩增以获得扩增的DNA，随后采用已知的方法将其整合到大肠杆菌表达载体(例如pKK233-2)。将获得的载体掺入到合适的宿主大肠杆菌(例如大肠杆菌XL1-Blue)而产生重组体。可以将重组体在合适的培养基上培养，从而表达脲酶。可以通过回收表达的脲酶而获得重组脲酶。在制备重组脲酶时，可以使用采用酵母，哺乳动物细胞和昆虫细胞的表达系统。例如在分子克隆，实验室手册(第二版)(冷泉港实验室出版社)，和在DNA克隆2(第二版)(IRL出版社)中描述了制备重组脲酶的程序。
利用固定配体的载体将脲酶固定到一个柱，该载体能够结合包含于脲酶的一个氨基(-NH3)，羧基(-COOH)，巯基(-SH)，或羟基(-OH)(例如NHS-活化的Sepharose 4 Fast Flow)。通过将包含含有糖蛋白的物质的样品通过该柱，随后洗去非特异性吸附的蛋白质，然后从柱上用合适的洗脱溶液洗脱特异性吸附到脲酶上的糖蛋白，可以进行利用脲酶固定的柱的糖蛋白的分离和纯化。
根据上面提到的方法，可以仅仅有效地从各种类型的含有糖蛋白的物质分离和纯化特异性结合到脲酶上的糖蛋白。由此获得的糖蛋白可抑制由幽门螺杆菌产生的脲酶与胃粘膜的粘蛋白的粘附，如下面的实施例证明的。由于脲酶定位于幽门螺杆菌细胞的表面，由上面提到的方法产生的特异性结合到脲酶上的糖蛋白(下文中称为本发明的糖蛋白)掩蔽了粘附素(即脲酶)，方法是在胃中与脲酶优势结合从而抑制幽门螺杆菌与胃粘膜上受体的粘附。在动物试验中证实了这一点，观察到本发明的糖蛋白对从胃去除幽门螺杆菌的作用。还有，本发明的糖蛋白是天然存在的并且是非常安全的。因此，本发明的糖蛋白可用作为胃中幽门螺杆菌定居的抑制剂并且可用于预防或治疗由幽门螺杆菌引起或与之相关的疾病例如消化性溃疡。
因此，本发明的糖蛋白可用作为幽门螺杆菌定居的抑制剂以配制为药物或食品。尤其是，过去已经吃了来自于奶或鸡蛋的蛋清的糖蛋白，所以可将其配制为食品例如具有抗幽门螺杆菌活性的特定的保健食品，特定食用的食品(包括老年人的食品或病人的食品)，或食用补充剂或具有抗幽门螺杆菌活性的健康食品。
当将本发明的糖蛋白加入到作为特定的保健食品，或特定食用的食品时，可以将糖蛋白加入到食品，通常量为食品重量的大约0.005-0.5％，和优选的是0.01-0.1％。加入本发明的糖蛋白的特定保健食品包括奶，乳制品，肉制品，蛋黄酱，调味品，饮料，冰淇淋，豆腐(黄豆凝乳)，每日菜，一种鱼、贝、藻混合煎煮品(tsukudani)(在酱油中煮沸的保存的食品)，豆酱，面糊，速食面，喷洒于米饭上的粉末状食品，腌制的蔬菜，粉末状的汤，水合的汤，糖果，罐装食品，蒸馏过的囊状食品，冷冻食品等等。其中被持续消耗的食品是优选的，但是不是必要的。当加入到病人用的食品例如低钠食品，低能量食品或低蛋白质食品时，可以将本发明的糖蛋白加入到汤，饮料，液体食物等等以制备各种形式的食品。
例如通过将赋形剂例如葡聚糖，粘附剂例如酪蛋白酸钠并且如果必要营养物(例如维生素，矿物质)，乳化剂，稳定剂，调味剂等等加入到本发明的糖蛋白中以制备液体食物，从而可以制备食用增补食品。
当将本发明的糖蛋白用作为保健食品时，包含该糖蛋白作为活性成分，其量为食品重量的大约0.1-3％。可以将该糖蛋白与赋形剂例如乳糖，玉米淀粉，晶体纤维素或PVP，或与粘合剂，任选地与营养物例如维生素和矿物质一起配制以形成各种形式的食品例如精细颗粒，片剂，颗粒剂。
本发明的糖蛋白可单独或与常规添加剂一起用作为药物组合物以预防或治疗消化性溃疡等等。采用常规的方法将糖蛋白单独或与添加剂一起形成口服给药的制剂例如片剂，颗粒剂，粉剂，胶囊或液体制剂。可以使用的添加剂包括赋形剂，粘合剂，崩解剂，润滑剂，抗氧化剂，着色材料，矫味剂等等。
可用于药物组合物的赋形剂包括羧甲基纤维素钠，琼脂，轻的无水的硅酸，明胶，晶体纤维素，山梨醇，滑石粉，糊精，淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇，硅酸铝镁，磷酸氢钙等等。
可使用的粘合剂包括阿拉伯胶，海藻酸钠，乙醇，乙基纤维素，酪蛋白酸钠，羧甲基纤维素钠，琼脂，纯水，明胶，淀粉，黄著胶，乳糖，羟基纤维素，羟甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等。
可使用的崩解剂包括羧甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，羧甲基纤维素钙，晶体纤维素，淀粉，羟丙基淀粉等等。
可使用的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钙，硬脂酸镁，滑石，氢化油，蔗糖脂肪酸酯，蜡等等。
可使用的抗氧化剂包括生育酚，棓酸酯，二丁基羟基甲苯(BHT)，丁基羟基苯甲醚(BHA)，抗坏血酸等等。
如果需要可以加入其他添加剂或试剂，例如抗酸剂(例如碳酸氢钠，碳酸镁，沉淀的碳酸钙，合成的水滑石)，用于保护胃粘膜的试剂(例如合成的硅酸铝，硫糖铝，和铜叶绿酸钠)和消化酶(例如生物淀粉酶制剂或脂酶)。用于预防或治疗消化性溃疡等等的药物组合物可以通过口服途径给药。对于成年人本发明的糖蛋白的剂量通常是每天2-30毫克和优选的是5-20毫克(干重)。
另外，用于预防或治疗消化性溃疡等等的上述药物组合物可以进一步包括胃酸分泌抑制剂。将糖蛋白和胃酸分泌抑制剂结合可更有效从胃去除幽门螺杆菌。可以使用的胃酸分泌抑制剂的例子包括H2阻滞剂例如法莫替丁，尼唑替丁，罗沙替丁，雷尼替丁或西咪替丁和质子泵抑制剂例如奥美拉唑，兰索拉唑或雷贝拉唑钠。对于成人胃酸分泌抑制剂的剂量优选的是每天20-30毫克。
给出下面的实施例进一步描述本发明。应该明白本发明不仅限于实施例中列举的特定详述。
实施例1(1)幽门螺杆菌重组脲酶的制备提取幽门螺杆菌菌株TU130的基因组DNA，通过PCR方法扩增编码脲酶分子的DNA。将扩增的DNA整合到表达载体pKK233-2(Amersham Pharmacia Biotec)以获得可用于表达脲酶的载体。将载体掺入到大肠杆菌XL 1-Blue获得能够表达脲酶的大肠杆菌。在37℃将重组细菌在1升含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基中以100rpm振荡培养。当细菌细胞达到对数生长期，加入0.5mM的浓度的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以便诱导表达，并且将细胞进一步在上述相同条件下振荡培养过夜。通过在4000×g离心20分钟(+4℃)收集大肠杆菌细胞。
将获得的细胞在Tris缓冲液中悬浮以裂解(50mM Tri-HCl(pH 8.0)，100mMNaCl，1mM EDTA)。在加入0.1毫克/毫升溶菌酶之后，将悬浮液在冰上放置30分钟。然后，将悬浮液在-80℃冰冻1小时以上，并且在室温下解冻。通过超声波处理悬浮液，加入1％浓度的Triton X-100。在30000×g离心30分钟(+4℃)收集重组脲酶的包含体。
将这些包含体悬浮于缓冲液中以便洗涤包含体(50mM Tri-HCl(pH8.0)，150mM NaCl，含有0.1％SDS的1mM EDTA，1.0％Triton X-100，0.1％脱氧胆酸钠)并且以30000×g离心10分钟(+4℃)。将沉淀的包含体以相同的方式再洗涤两次， 通过在8M脲溶液(8M脲，50mM Tri-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，1mM DTT)中悬浮这些包含体，然后将悬浮液在室温下保持1小时而将其溶解在将获得的悬浮液在30000×g离心30分钟之后(+4℃)，将上清液在100倍体积的添加了1mM EDTA(pH6.5)的20mM磷酸盐缓冲液中透析，从而变性脲酶的构型以获得含有重细脲酶的物质以便纯化。
为了纯化含有上述重组脲酶的物质，用10凝胶床体积的添加了1mMEDTA(pH6.5)的20mM磷酸盐缓冲液平衡硫酸噻氯酚-m(Cellulofine sulfate-m)(Chisso公司)。将重新调节到pH6.5的50毫升该物质应用到上述用添加了1mMEDTA(pH6.5)的20mM磷酸盐缓冲液平衡的硫酸噻氯酚-m，并且然后将添加了1mMEDTA的20mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)通过该凝胶。将具有含有脲酶的峰值的合并的级份调节到pH5.5并且应用到用10凝胶床体积的添加了1mM EDTA(pH5.5)的20mM磷酸盐缓冲液预平衡硫酸噻氯酚-m。之后，用20mM磷酸盐缓冲液(pH5.5)洗涤该凝胶。然后，将含有0.15M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4通过该凝胶提取脲酶。将含有脲酶的合并的级份在100倍体积的蒸馏水中透析，冻干以形成粉末状的重组脲酶。通过SDS-PAGE和Western印迹分析证实获得的重组脲酶与幽门螺杆菌的天然脲酶相同。(2)含有固定化重组幽门螺杆菌脲酶的柱的制备将2克的NHS-活化的Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotec公司)悬浮于约50毫升的1mM HCl中，并且在室温下吸胀15分钟。将吸胀的凝胶在玻璃滤纸上吸滤并且用10倍体积的1mM HCl洗涤两次。然后将凝胶悬浮于50毫升的偶合缓冲液(0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.8)，在玻璃滤纸上吸滤。将在上述(1)中制备的10毫克的粉末状纯化的重组脲酶溶解于10毫升的偶合缓冲液。将获得的溶液立即与该凝胶混合，并且将其在4℃在一个振荡器中缓慢振荡反应过夜。
在通过吸滤去除反应混合物之后，将获得的凝胶悬浮于封闭缓冲液(0.2M甘氨酸，pH8.3)并且置于4℃缓慢振荡过夜以封闭剩余的反应基团。在将凝胶在玻璃滤纸上吸滤之后，用50毫升的偶合缓冲液，50毫升的洗冻缓冲液(0.1M乙酸，0.5M NaCl，pH4.0)，和100毫升的添加了0.5M NaCl(pH4.0)的20mM磷酸盐缓冲液依次洗涤。将获得的凝胶悬浮于约5倍体积的含有0.5M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液pH5.5，将其直接倾倒至一个柱上填充。将该柱转移到低温室内并且用3床体积的含有0.1M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液pH5.5平衡，将该柱用作为含有固定化幽门螺杆菌重组脲酶的柱以用于分离本发明的糖蛋白。(3)从牛奶乳清制备高分子量的乳清蛋白质浓缩物在4℃以2000×g将20升的牛奶离心15分钟以便去除奶脂，回收上清液。然后将1M乙酸滴加到该上清液直到pH为4.6以去除酪蛋白。在将上清液在室温下保持1小时之后，通过离心去除酪蛋白获得牛乳清。然后，通过超滤将调节到pH6的乳清分级分离以将1000000Da浓缩到1/12体积，获得了高分子量的乳清蛋白质浓缩物。
(4)从鸡蛋的蛋清制备高分子量的蛋清蛋白质浓缩物从白来航母鸡下蛋后一个星期内的50个未受精的鸡蛋，仅仅收集蛋清并且筛选以将浓蛋清分离，悬浮于Mensel缓冲液(pH9.5，离子强度＝0.01)并且在10W和9kHz(+2℃)用超声波处理10分钟而溶解。用超过滤膜将溶解的产物分级分离以将300000Da的级分的分子量浓缩到1/12的体积，获得了高分子量的蛋清蛋白质浓缩物。
(5)利用脲酶固定的柱分离脲酶特异性结合的糖蛋白将上述程序(3)和(4)制备的高分子量蛋白浓缩物各1升调节到pH5.5。在低温室内进行下面的程序。用10倍床体积的含有NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(PH5.5)预平衡上述程序(2)中制备的脲酶固定的柱。将上面提到的各个样品通过该柱。然后用10倍床体积的含有0.5M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH5.5)洗涤该柱以去除非特异性吸附的蛋白质。用含有0.5M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)从柱上洗脱特异性结合到柱上的脲酶的糖蛋白。在100倍蒸馏水透析和随后的冷冻之后，每次约获得1克的本发明的糖蛋白，即特异性结合幽门螺杆菌脲酶的糖蛋白。
试验1体外试验利用上面描述的程序(3)制备的高分子量乳清蛋白质浓缩物，程序(4)制备的高分子量的蛋清蛋白质，和实施例1程序(5)制备的本发明的糖蛋白在体外试验系统中检测对幽门螺杆菌产生的脲酶与胃粘膜粘附的抑制作用。(材料和方法)本发明人已经发现幽门螺杆菌的粘附素是幽门螺杆菌产生的脲酶。由于该脲酶很好地结合到胃粘膜的粘蛋白，如下所述制备的猪胃粘蛋白用于脲酶粘附测试。
猪胃粘蛋白的制备杀死约2个月大的健康猪，回收他们的胃，用含有0.15M NaCl，5mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和1mM EDTA的0.1mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)洗涤胃内部。将胃切开，将胃粘膜刮下，并且悬浮于上面提到的缓冲液。将该粘膜悬浮液置于冰上用Polytron匀浆机打匀，并且以15000×g离心回收上清液。再以25000×g离心该上清液以回收上清液，在蒸馏水中透析并且冻干以获得粗胃粘蛋白。然后，将该冻干的粗胃粘蛋白溶解于含有0.15M NaCl，6M盐酸胍和蛋白酶抑制剂(5mM NEM，1mM PMSF，1mM EDTA)的0.mM磷酸盐缓冲液(pH 6.8)，并且平铺在氯化铯密度梯度(1.5克/毫升)并且在34000×g离心48小时。采用硝基纤维素膜印迹分析并且用高碘酸Schiff’s试剂染色检测含有唾液酸的级分。将被染色的级分收集并且平铺在氯化铯密度梯度上，离心。收集染色阳性的级分并且冻干。然后，将冻干的产物通过用0.1M磷酸盐缓冲液(0.1M NaCl，pH6.8)预平衡的Sepharose CL-4B柱进行凝胶过滤以进行分级分离。将PAS染色阳性并且具有高浓度蛋白质的级份合并并且在PBS(pH6.8)中透析以获得纯化的猪胃粘蛋白，储存于-80℃直到使用。由SDS-PAGE证实获得的胃粘蛋白是66kDa的糖蛋白。
脲酶与猪胃粘蛋白的粘附测试如下所述制备用于脲酶粘附测试的微滴板。
向96孔微滴板的每个孔中加入50微升份的纯化的猪胃粘蛋白(1.27毫克/毫升)，并且通过在4℃保持过夜将其固定。当将微滴板用于脲酶粘附测试时通过向每个孔加入3％BSA在37℃反应60分钟进行封闭，然后用含有0.15M NaCl和0.05％吐温20的20mM磷酸盐缓冲液洗涤该平板三次。
利用上面制备的微滴板进行脲酶粘附测试以便观察脲酶与固定到微滴板上的猪胃粘蛋白的粘附，如下所述。
将从幽门螺杆菌菌株TU130制备的天然脲酶和由实施例1的程序(1)制备的重组脲酶生物素化并且用由含有0.15M NaCl和0.05％吐温20的具有不同pH范围(将pH预调节到2.0，3.0，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0或6.5)的20mM磷酸盐缓冲液组成的粘附介质稀释生物素化的脲酶至终浓度为7.0微克/亳升。将由此获得的各个脲酶样品加入到粘蛋白固定的上面提到的微滴板的2个孔以在37℃敏化60分钟。然后，为了测定粘附到孔上的脲酶的量，将链霉抗生物素蛋白(streptoavidin)HRP加入到各个孔在37℃反应60分钟。然后，加入作为底物的邻苯二胺2HCl和H2O2进行反应。将3N硫酸用于终止该反应。将连续稀释2倍的已知量的生物素化脲酶置于运行的平板上，将其校正曲线用于测定样品中脲酶的量。
对脲酶粘附的抑制试验利用本发明的糖蛋白(实施例1的程序(5))，高分子量的乳清蛋白质浓缩物(实施例1的程序(3))，高分子量的蛋清蛋白质浓缩物(实施例1的程序(4))进行脲酶粘附的抑制测试。首先，将各个具有不同浓度的样品与生物素化的猪胃粘蛋白混合，将各个混合物转移到用脲酶固定的96孔平板的一个孔，并且在37℃敏化60分钟。然后，用粘附介质(pH4.0)将微滴板上的各个孔洗涤5次，并且在65℃加热10分钟进行固定。用粘附介质(pH7.0)将固定的孔洗涤1次，将链霉抗生物素蛋白HRP加入到各个孔，由如上所述的ELISA检测粘附到脲酶的生物素化的猪胃粘蛋白。(结果)脲酶粘附到纯化的猪胃粘蛋白的方式如图1所示，天然的脲酶和重组脲酶特异性地粘附到猪胃粘蛋白上，该粘附方式取决于pH。由于认为在约pH3.0时脲酶粘附反应反映了在胃粘膜中幽门螺杆菌的定居特性，在该pH范围内能够抑制脲酶粘附的物质可以抑制胃中幽门螺杆菌的定居。由于重组脲酶显示相同于天然脲酶的粘附特性，当利用固定了重组脲酶的柱纯化时本发明的糖蛋白被认为通过屏蔽幽门螺杆菌的脲酶而抑制胃中幽门螺杆菌定居。
本发明的糖蛋白抑制脲酶的粘附如图2所示，用高分子量的乳清蛋白质浓缩物，高分子量的蛋清蛋白质浓缩物，和从各个蛋白质浓缩物纯化的本发明的糖蛋白，依赖于剂量地抑制脲酶粘附到猪胃粘蛋白。本发明的糖蛋白甚至在低浓度时显示约100％的抑制活性，它是显著高效率的。脲酶定位于幽门螺杆菌细胞的表面，因此本发明的脲酶结合的糖蛋白可以抑制幽门螺杆菌的感染，即可以通过与胃中幽门螺杆菌细胞的脲酶的结合和屏蔽该脲酶(粘附素)从胃中去除幽门螺杆菌。
实施例2体内试验该试验在动物模型上进行以进一步证实试验1的结果
(方法)试验动物是对幽门螺杆菌感染具有高敏感性的无毛的小鼠(NSHr/ICR，人类和动物繁殖研究院，编号IRA-NHI-9701)(ATCC#72024)(临床诊断试验免疫学5578-582，1998)。给各个小鼠口服1×109CFU的NSP335菌株进行攻击。在育种一个星期之后，以将不同浓度的本发明的糖蛋白加入到饲料中给小鼠给药4个星期。将本发明的糖蛋白与H2封闭剂(法莫替丁)或质子泵抑制剂(奥美拉唑)一起给另一组给药。每个组各10个小鼠。在样品给药完成之后，将各个组的小鼠杀死。回收小鼠的胃，在去除内含物之后，用匀浆机将完整的粘膜打匀以便形成乳液，将其用于检测幽门螺杆菌。幽门螺杆菌的检测是如下完成通过将乳液置于培养基(Poremedia幽门螺杆菌分离培养基，Eiken Kagaku)以检测幽门螺杆菌，采用气体容器(gas pack)方法在37℃保温5天，并且对菌落计数。
(结果)本发明的糖蛋白对幽门螺杆菌定居的小鼠中去除幽门螺杆菌的作用如图3所示，本发明的糖蛋白可以以浓度依赖性的方式从胃中去除幽门螺杆菌。在最大剂量时(20微克/毫升)去除率是100％，在最小剂量(1微克/毫升)时去除率是70-75％，这是显著高的去除率，与体外试验结果相对应。对照组的100％小鼠(10/10)被幽门螺杆菌感染。根据该结果，根据优先与幽门螺杆菌产生的脲酶结合并且屏蔽脲酶(一种粘附素)，可以认为本发明的糖蛋白能够抑制幽门螺杆菌感染。另外，将糖蛋白与胃酸分泌抑制剂结合显示加强的效率。
下文，给出各种制剂的例子。用于该实施例的糖蛋白是由实施例1的程序(5)制备的糖蛋白。制剂1(食物)(咀嚼胶姆糖)胶基 25.0碳酸钙2.0山梨醇54.0甘露醇16.0调味剂1.0糖蛋白1.0水补充到100.0(％重量)
(冰淇淋)奶油(40％脂肪含量) 33.97奶(3.7％脂肪含量) 33.16脱脂蒸发的奶16.08糖 11.75玉米糖浆4.67稳定剂 0.3糖蛋白 0.02总量100％(重量％)制剂2(特殊食用的食品)(粉末状汤)用于煮的豆粉67.5小麦粉 3.9小麦胚芽2.5干酵母粉2.5洋葱粉 4.8肉提取物粉 15.5盐 0.2香料(白胡椒等等)1.8调味品(氨基酸等等) 0.2糖蛋白 0.1总量100％(重量％)(干汤)10.0克/200毫升鸡蛋4.0肉提取物1.3洋葱提取物 1.73胡萝卜膏2.16翅藻属(kombu)提取物 0.1乳化剂 0.1盐 0.2
香料(红胡椒) 0.2调味品(氨基酸等等) 0.2糖蛋白 0.01总量 10.0克制剂3(保健食品)配方1100克的精细颗粒中糖蛋白1克乳糖(200M)59克玉米淀粉 35克PVP(K-30) 5克通过常规的湿成粒方法将这些成分配制为精细颗粒。配方2100克颗粒中糖蛋白2克乳糖(200M)60克玉米淀粉 33克PVP(K-300)5克通过常规的挤出成粒方法将这些成分配制为颗粒制剂4食用添加剂食品液体食品(200毫升/包)糖蛋白0.01麦芽糖糊精39.0酪蛋白钠 13.0植物油12.0维生素1.0矿物质1.5乳化剂0.2奶蛋白质 10.3磷酸钠1.8磷酸钾1.2调味剂0.5
稳定剂(角叉菜胶) 1.5水 加至100.0(重量％)补药(汤型)糖蛋白0.02胡萝卜(胡萝卜膏) 10.0高脂稀奶油12.0乳糖 1.8洋葱(洋葱提取物) 1.5奶蛋白粉 0.5奶寡聚糖 1.5清炖汤粉 0.5小麦胚0.5蛋壳钙0.2乳清钙0.1盐0.2乳化剂0.2水 加至100.0(重量％)制剂5(Medicen)配方11.5千克的精细颗粒中糖蛋白15克乳糖 1100克玉米淀粉 340克PVP(K-30) 45克采用湿式造粒方法将这些成分形成颗粒，随后通过常规方法干燥和形成精细颗粒。
配方2片剂1.糖蛋白 15克2.乳糖 400克
3.玉米淀粉 150克4.晶体纤维素210克5.PVP(K-300)25克6.硬脂酸镁 10克采用湿式造粒法将上述成分1-5形成颗粒，然后加入硬脂酸镁形成粉末以制备片剂，然后将这些粉末挤压形成片剂(200毫克/片剂)。
配方31.5千克的颗粒中糖蛋白 20克乳糖(200M) 950克玉米淀粉480克PVP(K-30) 50克将这些成分完全混合并且采用挤压造粒法制备颗粒，随后通过常规方法干燥和形成颗粒。
配方41.5千克的精细颗粒中糖蛋白 15克法莫替丁 20克乳糖 1100克玉米淀粉 320克PVP(K-30)45克采用湿式造粒法制备颗粒，随后通过常规方法干燥和形成精细颗粒。
配方5片剂1.糖蛋白 20克2.法莫替丁20克3.乳糖400克4.玉米淀粉135克5.晶体纤维素 200克6.PVP(K-300) 25克7.硬脂酸镁10克采用湿式造粒法将上述成分1-6形成颗粒，然后加入硬脂酸镁形成粉末以制备片剂，然后将这些粉末挤压形成片剂(200毫克/片剂)。
配方61.5千克颗粒中糖蛋白 20克法莫替丁 30克乳糖(200M) 950克玉米淀粉 450克PVP(K-30) 50克采用挤压造粒法将这些成分制成颗粒，随后通过常规方法干燥和形成颗粒。
从以上所述可以看出，根据本发明，提供了幽门螺杆菌定居的安全和有效的抑制剂以及含有该抑制剂的食品和药物。由于从含有糖蛋白的物质分离和纯化了特异性结合到脲酶上的作为粘附素的糖蛋白并且用于本发明，即使当使用少量的糖蛋白时也可以有效地阻止幽门螺杆菌粘附到胃粘膜上。因此，可以有效地抑制由幽门螺杆菌引起的疾病例如消化性溃疡，而没有副作用出现。与已经用于治疗消化性溃疡的抗生素不同，本发明的糖蛋白可以从胃特异性地去除幽门螺杆菌而没有产生抗药性的细菌。作为本发明的糖蛋白的起始材料，可以将廉价并且可大量获得的牛奶和鸡蛋用于以简单方式制备显示优越效果的糖蛋白。
权利要求
1.特异性地结合到幽门螺杆菌的脲酶上的糖蛋白，该糖蛋白是通过利用使用与幽门螺杆菌脲酶特异性吸附的方法从含有糖蛋白的物质分离和纯化而获得的。
2.根据权利要求1所述的糖蛋白，其中使用与幽门螺杆菌脲酶特异性吸附的方法是利用固定了脲酶的柱的亲和层析。
3.根据权利要求2所述的糖蛋白，其中固定在柱上的幽门螺杆菌脲酶是重细脲酶
4.根据权利要求1-3任一项所述的糖蛋白，其中含有糖蛋白的物质是来源于牛奶乳清的物质。
5.根据权利要求4所述的糖蛋白，其中含有糖蛋白的物质是来源于牛奶乳清的高分子量乳清蛋白质浓缩物。
6.根据权利要求1-3任一项所述的糖蛋白，其中含有糖蛋白的物质是来源于鸡蛋蛋清的高分子量蛋清蛋白质浓缩物。
7.幽门螺杆菌定居的抑制剂，包括作为活性成分的权利要求1-6任一项的糖蛋白。
8.用于预防和/或治疗包括人在内的哺乳动物由幽门螺杆菌引起的或与其相关的疾病的药物组合物，包括权利要求1-6任一项所述的糖蛋白。
9.当消费有效量时能预防和/或治疗包括人在内的哺乳动物由幽门螺杆菌引起的或与其相关的疾病的食品，包括权利要求1-6任一项所述的糖蛋白。
10.幽门螺杆菌定居的抑制剂组合物，包括权利要求1-6任一项所述的糖蛋白和胃酸分泌抑制剂。
11.用于预防或治疗包括人在内的哺乳动物由幽门螺杆菌引起的或与其相关的疾病的药物组合物，包括权利要求1-6任一项所述的糖蛋白和胃酸分泌抑制剂。
全文摘要
胃中幽门螺杆菌定居的抑制剂包括作为活性成分的特异性结合到幽门螺杆菌脲酶上的糖蛋白。利用其上固定了幽门螺杆菌脲酶的柱进行亲和层析从含有糖蛋白的物质,特别是来源于牛奶乳清或鸡蛋的蛋清,分离和纯化该糖蛋白。该糖蛋白能够有效地抑制幽门螺杆菌定居,因此可用于预防或治疗由幽门螺杆菌感染引起的疾病例如消化性溃疡。也提供了包括该抑制剂的食品和药物。
文档编号A61P43/00GK1331250SQ01123320
公开日2002年1月16日 申请日期2001年4月13日 优先权日2000年4月14日
发明者儿玉义胜, 木村修武 申请人:株式会社源, 日清制粉株式会社