一种非洲猪瘟病毒抗原双联检测试剂及其制备方法与流程

本发明涉及病毒检测技术领域，具体为一种非洲猪瘟病毒抗原双联检测试剂及其制备方法。

背景技术：

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的，主要感染家猪、野猪、灌木猪等猪类的烈性传染病，死亡率高，给养猪业造成巨大的经济损失，asfv是目前已知的唯一一种dna虫媒病毒，asfv只感染家猪和野猪，不感染人类，野猪感染asfv后通常呈隐性感染，另外，软蜱也是asfv的宿主和传播媒介。

猪感染asfv的临床特征是高烧、腹泻、出血和皮肤泛红，一些临床症状和尸检结果，如脾肿大、淋巴结和肾脏出血，与猪感染古典猪瘟病毒的症状并无区别，现有技术还没有针对asfv的疫苗和有效治疗方法，控制方式主要依靠执行严格的卫生防疫措施和焚毁病猪的方式，因此，asfv的快速、可靠检测至关重要，目前，检测非洲猪瘟诊断方法有红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验、动物接种试验、elisa等。

目前，检测非洲猪瘟的主要试剂均依赖于进口，但由于elisa操作方法相对复杂，每次均需做阴阳性对照，检测相对繁琐，为此，我们提出一种非洲猪瘟病毒抗原双联检测试剂及其制备方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒抗原双联检测试剂及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种非洲猪瘟病毒抗原双联检测试剂及其制备方法，包括pvc底板，所述pvc底板的顶部从左到右依次设置有样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜检测垫和吸水垫，且硝酸纤维素膜检测垫的内表面从左到右依次设置有p30蛋白检测线、p72蛋白检测线和质控线，所述胶体金标记垫的左侧位于样品垫的内侧，且硝酸纤维素膜检测垫的左侧位于胶体金标记垫的内侧，硝酸纤维素膜检测垫的右侧位于吸水垫的内侧。

优选的，所述胶体金标记垫的材质为聚酯膜，样品垫材质为聚酯膜或玻璃纤维素膜。

一种非洲猪瘟病毒抗原双联检测试剂及其制备方法的制备方法，其制备方法包括以下步骤：

a、制备样品垫：将样品垫置于处理液中浸泡，然后将含有处理液的样品垫置于温度为18-24℃、相对湿度小于40％的环境中烘干16-24h，备用；

b、制备胶体金标记垫：胶体金溶液、抗体标记及胶体金标记垫制备；

c、制备硝酸纤维素膜检测垫：①、按照配方要求配置好质控线和p30蛋白检测线、p72蛋白检测线的抗体溶液，且最终抗体溶液浓度为1.0-1.2mg/ml；②取硝酸纤维素膜(规格宽度25mm)，按照距离间隔一次性划出p30蛋白检测线、p72蛋白检测线和质控线，划膜时，抗体溶液的消耗量设定为1.0-1.2ul/cm，p30蛋白检测线包被有鼠p30蛋白单克隆抗体3，p72蛋白检测线包被有鼠抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体4，质控线包被有羊抗鼠igg多克隆抗体；

d、贴板及切割：将样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜检测垫和吸水垫顺序搭接pvc底板上，并按照规格要求切割成宽度3.3mm(条型)和4mm(卡型)。

优选的，所述步骤a中，处理液为样品垫处理液，且处理液由0.5％吐温-20、1％bsa的ph为8.0的1mol/l磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液组成。

优选的，所述步骤b中，胶体金溶液的制备方法(以制备1000ml为例)包括以下步骤：①、用量筒量取980ml工艺用水到烧瓶中；②、加入制备量1％氯化金溶液，边搅拌边加热至沸腾；③、在搅拌过程中，迅速加入制备量1％柠檬酸三钠溶液；④、颜色变成橙红色后，继续煮沸15min；⑤、关闭搅拌器，让胶体金溶液自然冷却，用工艺用水将胶体金溶液定容至1000ml。

优选的，所述步骤b中，抗体标记及胶体金标记垫的制备方法(以制备40米胶体金标记垫为例)包括以下步骤：①、最佳ph值的确定：取320ml胶体金溶液，取用0.1m的碳酸钾溶液调整胶体金溶液的ph值至合适ph值；②、将溶液放到磁力搅拌器上，调整转速为250rpm；③搅拌状态下，加入所需量鼠抗p30蛋白单克隆抗体1和鼠抗p72蛋白单克隆抗体2，这两种抗体在此溶液中的浓度控制在8-10ug/ml；④、静置15min后加入10％bsa，使bsa终浓度为0.1％，加入0.32ml的1％peg20000，继续搅拌10min；⑤、离心：将标记好的溶液转移到离心管中，天平上调整平衡，并控制温度为2-8℃，转速为10000rpm，离心时间为30min；⑥、小心吸出上清，收集沉淀，用金标结合物稀释液定容到原胶体金溶液体积的10％；⑦、涂布：取聚酯无纺布，设定涂布量为6-8ul/cm，干燥温度为37℃，相对湿度≤40％，转动速度1.5m/min，将涂布好的胶体金标记垫转移到干燥间；⑧、干燥温度为37℃，干燥湿度≤40％，干燥时间为16-24h；⑨、胶体金标记垫干燥后，用铝箔袋封存备用。

优选的，所述步骤b中的胶体金标记垫制备完成后，在其表面上标记有鼠抗p30蛋白单克隆抗体1和鼠抗p72蛋白单克隆抗体2。

优选的，所述步骤c中还包括③、距离间隔设定：p30蛋白检测线离硝酸纤维素膜检测垫的底端距离为7mm，p72蛋白检测线离硝酸纤维素膜检测垫的底端距离为12mm，质控线离硝酸纤维素膜检测垫的底端距离为17mm；④、设定干燥温度为37℃，相对湿度≤40％的环境下干燥，干燥时间为16-24h；⑤、包被好的硝酸纤维素膜检测垫经干燥塔干燥后，卷好备用。

优选的，所述步骤d中还包括①、检查内包间温湿度，确保温度为18-24℃，湿度≤40％才能开始工作；②、在台面上展开pvc底板，两端粘在操作台上，撕掉中间部分宽度为25mm的离层纸；③、将硝酸纤维素膜检测垫对准直线贴在撕开离层纸的地方；④、再撕开pvc底板下边的保护纸，将胶体金标记垫黏贴在pvc底板上，让胶体金标记垫的上边缘与硝酸纤维素膜检测垫的下边缘重叠1-2mm，将样品垫粘贴在胶体金标记垫的下方，让样品垫的上边缘与胶体金标记垫的下边缘重叠1-2mm；⑤、撕开pvc底板上边的离层纸，将吸水垫直线黏贴到pvc底板上，让吸水垫与硝酸纤维素膜检测垫的上边缘重叠2mm左右；⑥、贴透明胶带，让透明胶带完全覆盖胶体金标记垫；⑦、操作自动斩切机，按要求的宽度切割。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明通过对afsv主要的且相当保守的具有抗原性的两种蛋白(p30和p72)的检测，一次加样，可以同时获得两个结果，且两者任何一个出现阳性，即可提示出现了afsv感染，提高检出率，并能快速检测出早期猪发热是否是非洲猪瘟病毒感染所致，及早发现疫情并采取有效防控措施，且灵敏度高、特异性强、速度快(5-10min)、操作简便、重复性好、结构稳定、使用性能好，适用于养殖户开展自查或专业机构开展疫情调查。

附图说明

图1为本发明结构示意图。

图中：1pvc底板、2样品垫、3胶体金标记垫、4硝酸纤维素膜检测垫、5质控线、6吸水垫、7p72蛋白检测线、8p30蛋白检测线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。

本申请的pvc底板1、样品垫2、胶体金标记垫3、硝酸纤维素膜检测垫4、质控线5、吸水垫6、p72蛋白检测线7和p30蛋白检测线8部件均为通用标准件或本领域技术人员知晓的部件，其结构和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知。

请参阅图1，一种非洲猪瘟病毒抗原双联检测试剂及其制备方法，包括pvc底板1，pvc底板1的顶部从左到右依次设置有样品垫2、胶体金标记垫3、硝酸纤维素膜检测垫4和吸水垫6，胶体金标记垫3的材质为聚酯膜，样品垫2材质为聚酯膜或玻璃纤维素膜，且硝酸纤维素膜检测垫4的内表面从左到右依次设置有p30蛋白检测线8、p72蛋白检测线7和质控线5，胶体金标记垫3的左侧位于样品垫2的内侧，且硝酸纤维素膜检测垫4的左侧位于胶体金标记垫3的内侧，硝酸纤维素膜检测垫4的右侧位于吸水垫6的内侧，通过对afsv主要的且相当保守的具有抗原性的两种蛋白(p30和p72)的检测，一次加样，可以同时获得两个结果，且两者任何一个出现阳性，即可提示出现了afsv感染，提高检出率，并能快速检测出早期猪发热是否是非洲猪瘟病毒感染所致，及早发现疫情并采取有效防控措施，且灵敏度高、特异性强、速度快(5-10min)、操作简便、重复性好、结构稳定、使用性能好，适用于养殖户开展自查或专业机构开展疫情调查。

一种非洲猪瘟病毒抗原双联检测试剂及其制备方法的制备方法，其制备方法包括以下步骤：

a、制备样品垫2：将样品垫2置于处理液中浸泡，然后将含有处理液的样品垫2置于温度为18-24℃、相对湿度小于40％的环境中烘干16-24h，备用；

b、制备胶体金标记垫3：胶体金溶液、抗体标记及胶体金标记垫3制备；

c、制备硝酸纤维素膜检测垫4：①、按照配方要求配置好质控线5和p30蛋白检测线8、p72蛋白检测线7的抗体溶液，且最终抗体溶液浓度为1.0-1.2mg/ml；②取硝酸纤维素膜(规格宽度25mm)，按照距离间隔一次性划出p30蛋白检测线8、p72蛋白检测线7和质控线5，划膜时，抗体溶液的消耗量设定为1.0-1.2ul/cm，p30蛋白检测线8包被有鼠p30蛋白单克隆抗体3，p72蛋白检测线7包被有鼠抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体4，质控线5包被有羊抗鼠igg多克隆抗体；

d、贴板及切割：将样品垫2、胶体金标记垫3、硝酸纤维素膜检测垫4和吸水垫6顺序搭接pvc底板1上，并按照规格要求切割成宽度3.3mm(条型)和4mm(卡型)。

步骤a中，处理液为样品垫处理液，且处理液由0.5％吐温-20、1％bsa的ph为8.0的1mol/l磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液组成。

步骤b中，胶体金溶液的制备方法(以制备1000ml为例)包括以下步骤：①、用量筒量取980ml工艺用水到烧瓶中；②、加入制备量1％氯化金溶液，边搅拌边加热至沸腾；③、在搅拌过程中，迅速加入制备量1％柠檬酸三钠溶液；④、颜色变成橙红色后，继续煮沸15min；⑤、关闭搅拌器，让胶体金溶液自然冷却，用工艺用水将胶体金溶液定容至1000ml。

步骤b中，抗体标记及胶体金标记垫3的制备方法(以制备40米胶体金标记垫3为例)包括以下步骤：①、最佳ph值的确定：取320ml胶体金溶液，取用0.1m的碳酸钾溶液调整胶体金溶液的ph值至合适ph值；②、将溶液放到磁力搅拌器上，调整转速为250rpm；③搅拌状态下，加入所需量鼠抗p30蛋白单克隆抗体1和鼠抗p72蛋白单克隆抗体2，这两种抗体在此溶液中的浓度控制在8-10ug/ml；④、静置15min后加入10％bsa，使bsa终浓度为0.1％，加入0.32ml的1％peg20000，继续搅拌10min；⑤、离心：将标记好的溶液转移到离心管中，天平上调整平衡，并控制温度为2-8℃，转速为10000rpm，离心时间为30min；⑥、小心吸出上清，收集沉淀，用金标结合物稀释液定容到原胶体金溶液体积的10％；⑦、涂布：取聚酯无纺布，设定涂布量为6-8ul/cm，干燥温度为37℃，相对湿度≤40％，转动速度1.5m/min，将涂布好的胶体金标记垫3转移到干燥间；⑧、干燥温度为37℃，干燥湿度≤40％，干燥时间为16-24h；⑨、胶体金标记垫3干燥后，用铝箔袋封存备用。

步骤b中的胶体金标记垫3制备完成后，在其表面上标记有鼠抗p30蛋白单克隆抗体1和鼠抗p72蛋白单克隆抗体2。

步骤c中还包括③、距离间隔设定：p30蛋白检测线8离硝酸纤维素膜检测垫4的底端距离为7mm，p72蛋白检测线7离硝酸纤维素膜检测垫4的底端距离为12mm，质控线5离硝酸纤维素膜检测垫4的底端距离为17mm；④、设定干燥温度为37℃，相对湿度≤40％的环境下干燥，干燥时间为16-24h；⑤、包被好的硝酸纤维素膜检测垫4经干燥塔干燥后，卷好备用。

步骤d中还包括①、检查内包间温湿度，确保温度为18-24℃，湿度≤40％才能开始工作；②、在台面上展开pvc底板1，两端粘在操作台上，撕掉中间部分宽度为25mm的离层纸；③、将硝酸纤维素膜检测垫4对准直线贴在撕开离层纸的地方；④、再撕开pvc底板1下边的保护纸，将胶体金标记垫3黏贴在pvc底板1上，让胶体金标记垫3的上边缘与硝酸纤维素膜检测垫4的下边缘重叠1-2mm，将样品垫2粘贴在胶体金标记垫3的下方，让样品垫2的上边缘与胶体金标记垫3的下边缘重叠1-2mm；⑤、撕开pvc底板1上边的离层纸，将吸水垫6直线黏贴到pvc底板1上，让吸水垫6与硝酸纤维素膜检测垫4的上边缘重叠2mm左右；⑥、贴透明胶带，让透明胶带完全覆盖胶体金标记垫3；⑦、操作自动斩切机，按要求的宽度切割。

使用时，通过对afsv主要的且相当保守的具有抗原性的两种蛋白(p30和p72)的检测，一次加样，可以同时获得两个结果，且两者任何一个出现阳性，即可提示出现了afsv感染，提高检出率，并能快速检测出早期猪发热是否是非洲猪瘟病毒感染所致，及早发现疫情并采取有效防控措施，且灵敏度高、特异性强、速度快(5-10min)、操作简便、重复性好、结构稳定、使用性能好，适用于养殖户开展自查或专业机构开展疫情调查。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。