代谢标志物在制备诊断先天性心脏病的试剂盒的应用的制作方法

本发明涉及生命科学和代谢组学领域，具体地说涉及代谢标志物在制备诊断先天性心脏病的试剂盒的应用。

背景技术：

先天性心脏病(congenitalheartdisease，chd)是指胎儿时期心脏血管发育异常所致的心血管畸形，是最常见的出生缺陷，发病率约为6‰～11‰，约23％的儿童死亡，且约3/4的死亡发生在手术前。chd包括主动脉瓣膜狭窄、主动脉缩窄、动脉导管未闭、肺动脉瓣狭窄、房间隔缺损、室间隔缺损、法洛四联症和完全性大动脉转位等。chd具体发病机制不明，但是报道显示其发病机制与多种因素有关，包括：宫内感染、环境因素、染色体异常、基因突变及表观遗传等。现在产前检测胎儿chd主要依赖于超声检测，但产前超声检测准确性受到多种因素的影响，如检测者专业知识、设备质量、胎位和母体肥胖等。此外先天性心脏病的类型也是影响检出的又一重要因素，有很大一部分chd直至出生之后才被检出，仅有约40％的chd可以通过产前超声检出。同时，新生儿筛查chd通常采用心脏听诊和经皮脉搏血脉氧饱和度进行检测。心脏听诊联合经皮脉搏血脉氧饱和度筛查重症chd具有较好的效果，敏感性和特异性约为90％和97％，但是对轻型chd筛查效果不尽理想。可见在现有的新生儿筛查方法下，仍有一部分chd会被漏筛。因此，寻找更特异的chd相关标志物是迫切需要的。

代谢组学(metabolomics)是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的又一重要研究领域。根据研究目的不同，代谢组学可分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学，不同的是靶向代谢组学是对少数几种或几类结构、性质相似或生化功能相关的内源性代谢物进行分析，而非靶向代谢组学是对生物体所有内源性代谢物进行全面分析。通过代谢组学的标记物研究，可发现利于疾病诊断、进展和治疗有关的技术方案，生产出相应的诊断试剂盒。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的是提供多组筛查诊断代谢标志物，其在制备特异性诊断胎儿先天性心脏病试剂盒的应用。

技术方案：本发明提供了一组代谢标志物在制备诊断先天性心脏病的试剂盒的应用，所述代谢标记物包括谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、异亮氨酸、尿酸、谷氨酸/焦谷氨酸比值、γ-氨基丁酸/谷氨酸比值的任意一种或多种的组合。

其中谷氨酰胺、尿酸、γ-氨基丁酸/谷氨酸比值在chd中明显升高，而谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、和谷氨酸/焦谷氨酸比值在chd中明显降低。须说明的是，本发明上述标志物上升或下降趋势是基于代谢组学和统计分析模型下获得的定性分析，而非定量分析，该趋势可用于评估其特异性和敏感性，但不涉及获得其具体在chd中呈现的数值，且所有数据在统计分析模型中进行了相应的标准化处理，不涉及单位。

由于采用数学模型分析，为了评估病例样本在模型下的可验证性，本发明通过实验集和验证集两个集合进行对比分析，每个集合都包含病例组和对照组。

本发明利用roc曲线分析曲线下面积计算每个代谢标记物的敏感性和特异性，上述代谢标记物的敏感性普遍在60％以上，特异性普遍在70％以上；其中γ-氨基丁酸/谷氨酸比值的敏感性超过了80％，谷氨酸的特异性超过了90％，苯丙氨酸和谷氨酸/焦谷氨酸比值的特异性超过了80％。

上述代谢标记物亦可组合形成联合诊断试剂盒，有利于提高诊断效果。然而上述代谢物并非同时具备良好的特异性和敏感性，例如谷氨酰胺特异性可达75％以上，但敏感性不到60％。本发明通过aic(akaikeinformationcriterion，赤池信息量准则)评估代谢标记物的组合效果。aic是衡量统计模型拟合优良性的一种标准，aic越小说明拟合效果更优。通过联合检测和aic评估，可以弥补单独指标检测的不足，具有更高的临床应用价值。

作为本发明的一个优选方案，谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、异亮氨酸、尿酸、谷氨酸/焦谷氨酸比值、γ-氨基丁酸/谷氨酸比值联合诊断chd的平均auc为0.92(0.88-0.96)，敏感性分别为89.4％，特异性为88.0％，aic＝193.66。

本发明还提供两个优选的组合如下：

谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、异亮氨酸、尿酸、谷氨酸/焦谷氨酸比值、γ-氨基丁酸/谷氨酸比值和β-丙氨酸/天冬氨酸比值。其中，β-丙氨酸/天冬氨酸比值在chd中呈明显升高的趋势。联合诊断chd的平均auc为0.92(0.88-0.96)，敏感性分别为89.4％，特异性为87.0％，aic＝194.97。

谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、异亮氨酸、尿酸、谷氨酸/焦谷氨酸比值、γ-氨基丁酸/谷氨酸比值、β-丙氨酸/天冬氨酸比值和别异亮氨酸。其中，别异亮氨酸在chd中呈明显降低的趋势。联合诊断chd的平均auc为0.92(0.88-0.96)，敏感性分别为90.1％，特异性为87.0％，aic＝196.90。

对于上述诊断标志物制备而成的试剂盒，检验对象包括但不限于血浆、血清、母体羊水、母体尿液等。由于羊水中含有羊膜上皮细胞，胎儿组织和胎盘组织产生的大量代谢物，可以反映胎儿发育过程中的病理状况，且羊水组成成分相对简单，受饮食等影响较小，因此优选的检验对象为母体羊水。

附图说明

图1为实施例1中实验集chd病例组与对照组opls-da模型；

图2为对应图1的置换检验图；

图3为实施例1中验证集chd病例组与对照组opls-da模型；

图4为对应图3的置换检验图；

图5为实施例2z-score标准化后实验集和验证集中10种代谢标记物的变化趋势，灰色代表对照组，黑色代表病例组；

图6为实施例2中谷氨酸用于检测chd的roc曲线分析；

图7为实施例2中谷氨酰胺用于检测chd的roc曲线分析；

图8为实施例2中苯丙氨酸用于检测chd的roc曲线分析；

图9为实施例2中异亮氨酸用于检测chd的roc曲线分析；

图10为实施例2中尿酸用于检测chd的roc曲线分析；

图11为实施例2中谷氨酸/焦谷氨酸比值用于检测chd的roc曲线分析；

图12为实施例2中γ-氨基丁酸/谷氨酸比值用于检测chd的roc曲线分析；

图13为实施例2中β-丙氨酸/天冬氨酸比值用于检测chd的roc曲线分析；

图14为实施例2中别异亮氨酸用于检测chd的roc曲线分析；

图15为实施例2中缬氨酸用于检测chd的roc曲线分析

图16为实施例3代谢标志物组合1检测chd的roc曲线分析；

图17为实施例3代谢标志物组合2检测chd的roc曲线分析；

图18为实施例3代谢标志物组合3检测chd的roc曲线分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1opls-da模型分析

1.样本收集

从南京市妇幼保健院收集了共250例因胎儿产前超声检测诊断为chd(病例组)和因其它原因而进行羊膜腔穿刺术(对照组)进行临床遗传学检测后剩余羊水，所有样本收集后-80℃保存。其中实验集包含77例chd母体羊水样本(病例组)和116例对照组羊水样本(对照组)；验证集包含22例chd胎儿母体羊水样本(病例组)和35例对照组羊水样本(对照组)。实验集和验证集所有对照组样本均排除胎儿畸形和胎儿核型异常。样本采集时间在16-26周之间，且孕妇年龄在20-43岁之间。

2.试验方法

2.1试剂

甲氧基胺盐酸盐美国sigma公司

脂肪酸甲酯(c7-c30，fames)标准品美国sigma公司

吡啶美国sigma公司

无水硫酸钠美国sigma公司

n-甲基-n-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(mstfa)+三甲基氯硅烷(tmcs)(体积比99∶1)thermofisherscientific公司

甲醇thermofisherscientific公司

乙腈thermofisherscientific公司

己烷thermofisherscientific公司

二氯甲烷thermofisherscientific公司

氯仿thermofisherscientific公司

丙酮thermofisherscientific公司

超纯水由配备有lc-mspak过滤器的mill-qreference系统产生(millipore，billerica，ma)

2.2仪器

气相色谱/飞行时间质谱(gc/tof-ms)联仪pegasusht，lecocorp.，st.joseph，mo，usa

真空离心浓缩仪labconco，kansacity，mo，usa

低温冷冻干燥机labconco，kansacity，mo，usa

氮气干燥装置parkerbalston，lancaster，ny，usa

高速低温离心机、振动涡旋机、冷藏冰箱

2.3耗材

rxi-5色谱柱(30m×250×0.25μm，restekcorporation，bellefonte，pa，usa)；进样瓶(agilenttechnologies，fostercity，ca，usa)；氮气；移液器；枪头；口罩；乳胶手套。

3.样本制备和gc/tof-ms检测

待测羊水样本在冰浴的保护下缓慢解冻后，3000rpm，4℃，离心3min；移液器吸取100μl血清置于预冷的ep管中，加入10μl内标液，轻微混匀，再加入200μl预冷的甲醇∶氯仿(3∶1，v/v)混合溶液进行提取；13500rpm，4℃，离心20分钟后取200μl上清至1.5ml自动进样瓶；放到真空离心浓缩仪中旋干5min，去除氯仿溶剂，再转移到低温冷冻干燥机完全冻干。完全干燥的样本恢复室温后，充入高纯氮气保护，置于自动衍生平台xploremet进行硅烷化衍生(gerstelgmbh&co.，mlheim，germany)。

简要步骤如下：加入50μl的甲氧胺吡啶溶液(20mg/ml)，在30℃孵育2小时后，加入50μl的mstfa(含保留指数fames)，37.5℃孵育1小时。在此衍生的过程中，衍生好的样本由进样臂自动进样。

gc/tof-ms具体分析条件如下：进样量为1μl，载气为氦气(99.9999％)，流速恒定为1.0ml/min；gc温度编程设定为在80℃下等温加热2分钟，然后以12℃/min，温度由80℃上升至300℃，300℃(4.5min)，以及40℃/min从300℃上升至320℃，320℃维护1min；前进样口温度为270℃；传输线温度为270℃。ms具体设置：电子轰击电离(-70ev)；检测质量范围为50-500m/z；离子源温度为220℃；采集速率为25spectra/s；探测器电压为-1450v。

为了更好地采集数据，确保仪器的最佳状态，在正式样品上机前需要用质量控制(qualitycontrol，qc)样本做稳定性测试，一般将同一个qc样本重复进样10针左右，待仪器稳定方可进样。每10针样本中间插入一个qc，确保仪器进样过程中的稳定性。实验集和验证集采用同样的方法进行处理和检测。

4.opls-da多重变量分析和chd可能的代谢标志物

gc/tof-ms生成的原始文件转换为cdf文件，原始数据由adap-gc3.0处理，包括自动基线去除、平滑、峰识别和去卷积、质量控制、矫正，然后与标准品数据库进行比对进行物质鉴定。使用多变量统计软件simca14.0(umetrics，umea，sweden)进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonalpartialleastsquarediscriminationanalysis，opls-da)。opls-da模型分析属于有监督的判别模型，用于区分两分组间的代谢谱差异。

从图1至图4可以看出，无论是在实验集，还是在验证集，chd病例组与对照组的代谢轮廓均具有良好的分离趋势，说明chd病例组与对照组代谢存在差异。图1中实验集opls-da模型的r2y和q2分别是82.3％和61.6％，图3中验证集opls-da模型的r2y和q2分别是70.8％和41.2％，模型的q2y≥0.4被认为是模型可信的标准。然而有监督的模型可能会产生过拟合的现象，因此需要进一步对此模型进行1000次随机打乱样本测试(permutationtest，置换检验)以评估模型的可靠性。回归曲线在y轴的截距q2y小于零的结果表明模型可信，图2中实验集置换检验的y轴的截距q2y为-0.436，图4中验证集的y轴截距为-0.392，表明上述分析建模型是可信的。

使用多元统计分析和单元统计分析方法评估chd与对照组代谢物差异。在多元统计分析中，变量重要性投影(variableimportanceintheproiection，vip)值＞1.0认为具有显著性差异。通过opls-da模型分析对代谢物进行vip打分筛选，vip分数越高的代谢物，对分组的贡献越大。使用spss22.0软件(ibm，usa)进行曼-惠特尼u检验(mann-whitneyutest)单元统计分析，p＜0.05被认为具有统计学差异。同时满足多元统计vip＞1和单元统计分析p＜0.05的代谢物被认为是最为可信的差异代谢物，有成为生物标志物的潜力。通过数据分析，实验集共获得50种同时满足多元统计分析和单元统计分析的差异代谢物；验证集共获得32种同时满足多元统计分析和单元统计分析的差异代谢物。通过对实验集和验证集的比较，共筛选出10种在实验集和验证中均存在、变化趋势一致，且具有统计学差异的代谢物。这10种差异代谢物同时满足vip＞1且p＜0.05，详见表1。

表1差异代谢物在chd中的变化趋势

fc：foldchange(变化倍数)；hmdb：thehumanmetabolomedatabase(人类代谢组数据库)

图5直接展示了实验集和验证集这10种代谢物在chd中的变化趋势，其中谷氨酰胺(glutamine，图5a)、尿酸(uricacid，图5g)、β-丙氨酸/天冬氨酸比值(ratioofβ-alanine/asparticacid，图5i)和γ-氨基丁酸/谷氨酸比值(ratioofγ-aminobutyricacid/glutamicacid，图5j)在chd中明显升高，而谷氨酸(glutamicacid，图5b)、苯丙氨酸(phenylalanine，图5c)、缬氨酸(valine，图5d)、异亮氨酸(isoleucine图，5e)、别异亮氨酸(alloisoleucine，图5f)和谷氨酸/焦谷氨酸比值(ratioofglutamicacid/pyroglutamicacid，图5h)在chd中明显降低，这10种代谢物在实验集和验证集的变化趋势一致。

实施例2单个代谢标记物用于诊断chd的工作特征曲线分析

为了观察这10种差异代谢物作为试剂盒用于诊断chd的能力，我们对每种标志物应用于诊断chd进行了roc曲线分析。

图6至图15展示了10种代谢物用于诊断chd的roc曲线。谷氨酸(glutamicacid)在实验集和验证集中诊断chd的auc(areaunderthecurve，曲线下面积)分别为0.845和0.894，敏感性分别为68.1％和82.9％，特异性分别为92.2％和95.7％(图6)；谷氨酰胺(glutamine)在实验集和验证集中诊断chd的auc分别为0.687和0.675，敏感性分别为77.6％和77.1％，特异性分别为58.4％和60.9％(图7)；苯丙氨酸(phenylalanine)在实验集和验证集中诊断chd的auc分别为0.765和0.836，敏感性分别为61.2％和74.3％，特异性分别为88.3％和87.0％(图8)；异亮氨酸(isoleucine)在实验集和验证集中诊断chd的auc分别为0.711和0.788，敏感性分别为62.1％和88.6％，特异性分别为76.6％和69.6％(图9)；尿酸(uricacid)在实验集和验证集中诊断chd的auc分别为0.680和0.837，敏感性分别为63.8％和80.0％，特异性分别为68.8％和82.6％(图10)；谷氨酸/焦谷氨酸比值(ratioofglutamicacid/pyroglutamicacid)在实验集和验证集中诊断chd的auc分别为0.874和0.902，敏感性分别为75.9％和91.4％，特异性分别为88.3％和91.3％(图11)；γ-氨基丁酸/谷氨酸比值(ratioofγ-aminobutyricacid/glutamicacid)在实验集和验证集中诊断chd的auc分别为0.762和0.875，敏感性分别为87.1％和85.7％，特异性分别为63.6％和82.6％(图12)；β-丙氨酸/天冬氨酸比值(ratioofβ-alanine/asparticacid)在实验集和验证集中诊断chd的auc分别为0.596和0.827，敏感性分别为88.8％和88.6％，特异性分别为32.5％和82.6％(图13)；别异亮氨酸(alloisoleucine)在实验集和验证集中诊断chd的auc分别为0.741和0.708，敏感性分别为58.6％和45.7％，特异性分别为81.8％和95.7％(图14)；缬氨酸(valine)在实验集和验证集中诊断chd的auc分别为0.643和0.773，敏感性分别为65.5％和80.0％，特异性分别为59.7％和69.6％(图15)。

可见，谷氨酰胺、谷氨酸/焦谷氨酸比值、β-丙氨酸/天冬氨酸比值和γ-氨基丁酸/谷氨酸比值用于诊断chd具有较高的敏感性，而谷氨酸、苯丙氨酸、别异亮氨酸和谷氨酸/焦谷氨酸比值则具有较高的特异性。也有一些指标敏感性或者特异性比较低，如别异亮氨酸敏感性较低(实验集为58.6％，验证集为45.7％)，而缬氨酸用于诊断chd的特异性较低为(实验集为59.7％，验证集为69.6％)。

实施例3多个代谢标记物用于诊断chd的工作特征曲线分析

本实施例提供基于实施例2所述10中特异性代谢标志物的优化组合。基于该优化组合方式获得的联合诊断试剂盒经检验具有更高的特异性和敏感性。

组合1包含的代谢标志物为谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、异亮氨酸、尿酸、谷氨酸/焦谷氨酸比值和γ-氨基丁酸/谷氨酸比值；

组合2包含的代谢标志物为谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、异亮氨酸、尿酸、谷氨酸/焦谷氨酸比值、γ-氨基丁酸/谷氨酸比值和β-丙氨酸/天冬氨酸比值；

组合3包含的代谢标志物为谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、异亮氨酸、尿酸、谷氨酸/焦谷氨酸比值、γ-氨基丁酸/谷氨酸比值、β-丙氨酸/天冬氨酸比值和别异亮氨酸；

基于实施例2的分析结果可以看出，单独使用某一个指标诊断chd很难同时达到较高的敏感性和特异性，本实施例提供了上述3组优化组合，请参考图16至图18所示，其中，组合1用于诊断chd在实验集和验证集中的auc分别为0.924和0.863，敏感性分别为86.2％和80％，特异性分别为89.6％和91.3％。组合2用于诊断chd在实验集和验证集中的auc分别为0.927和0.865，敏感性分别为87.9％和85.7％，特异性分别为88.3％和87.0％；组合3用于诊断chd在实验集和验证集中的auc分别为0.926和0.865，敏感性分别为86.2％和85.7％，特异性分别为89.6％和87.0％。

aic(akaikeinformationcriterion，赤池信息量准则)是衡量统计模型拟合优良性的一种标准，aic越小越好。最优组合的aic＝147.80，次优组合aic＝148.26，第三优组合aic＝149.94。

为了获得每一种标志物的检测截断值，我们将实验集和验证集中所有数据先进行中位数标准化，即将实验集中chd组和对照组原始数据均除以实验集对照组中位数，验证集中chd组和对照组原始数据均除以验证集中对照组中位数；将标准化后的实验集和验证集中chd组合并为一组，对照组合并为一组进行各个指标的截断值分析。

经分析获得的平均auc、敏感性、特异性如图2所示，其中可以看出单个代谢标记物敏感性和特异性之间的差异，三个chd的早期辅助联合诊断组具备更高的敏感型和特异性，其中以组1的效果最优。

表210个代谢标记物及其组合的综合敏感性、特异性

其中，组合1(7个指标)的aic＝193.66；组合2(8个指标)的aic＝194.97；组合3(9个指标)的aic＝196.90。