一种对太赫兹波辐射敏感的神经元突触后信息传递分子nNOS的制作方法

一种对太赫兹波辐射敏感的神经元突触后信息传递分子nnos
技术领域
[0001]
本发明涉及生物科学技术领域，尤其涉及一种对太赫兹波辐射敏感的神经元突触后信息传递分子nnos及其用途。


背景技术：

[0002]
太赫兹(terahertz，thz)波是一种频率在100ghz～10thz之间的电磁波。随着科技的进步，thz波技术不断成熟，其应用前景巨大。目前，thz波技术在安检、无损检测、成像和通讯等方面应用的不断推广，thz波的检查已经涉及到有机体的各个结构层次，包括人体、动物、组织、细胞和生物大分子等，因此对thz辐射的生物安全性—生物学效应的研究也日益增多。thz辐射的生物学效应的研究主要从两方面入手：thz波的物理参数如频率、能量、时间等及生物样本的性质。研究表明，thz波可引起生物大分子共振和旋转能级跃迁，可能对生物组织产生独特的效应。作为一种新兴的生物检测手段，thz辐射效应对生物组织影响的研究尚处于初步阶段，目前thz对生物有机体的影响尚无定论，还需要进一步系统详尽的研究，并随之建立规范有效的安全防护系统，大量研究数据表明，高能量thz辐射所产生的热效应可能是造成生物损伤最为重要的原因，但目前的研究表明较低强度的太赫兹辐射不会对生物产生不利影响。然而迄今，thz波对神经信息传递的研究较少，尤其是突触后信息传递改变未见报道，尚缺乏检测thz波引起神经信息传递异常的特异性检测方法。


技术实现要素：

[0003]
基于背景技术存在的技术问题，本发明的目的是建立一种检测太赫兹波辐射致神经元信息传递异常的特异性方法，即通过检测辐射后神经细胞中特定蛋白的表达水平，该蛋白具有高特异性和高敏感性的特点。本发明最终发现太赫兹波辐射后nnos(神经型一氧化氮合成酶)表达降低，是太赫兹波辐射敏感的突触后信号分子，并可用于检测太赫兹波辐射致神经元信息传递异常的方法。
[0004]
本发明的技术方案如下：
[0005]
突触后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95,psd95)、钙调素依赖性蛋白激酶ii(calmoadulin-dependent protein kinase ii,camk ii)、nnos和环磷腺苷效应元件结合蛋白(camp-response element binding protein,creb)等突触后蛋白参与神经元突触信号传递、记忆形成等多种生物学过程。
[0006]
研究发现，psd95是突触后膜上的一种重要脚手架蛋白，在谷氨酸受体的信号整合中发挥重要作用。camk ii是钙离子下游的一种重要激酶，可调节机体多种重要生理功能，参与突触信号传递、记忆形成、能量代谢等多种生物学过程。
[0007]
creb是一种能刺激基因转录的核蛋白，是重要的转录因子，受到多种信号通路的调控，creb的存在与记忆的维持有关具有调节神经突触囊泡中递质释放的功能，可参与调节胞吐作用释放的突触小泡的数量。因此，如能发现对太赫兹波辐射敏感的神经元突触后信息传递蛋白，即可用于太赫兹波辐射致神经元信息传递异常的检测方法。
[0008]
nnos(神经型一氧化氮合成酶)在神经系统中特异性分布的一种蛋白酶，其催化产生的一氧化氮(nitric oxide，no)是一种重要的气体性神经递质，可快速通过细胞膜发挥广泛的调节作用，并参与长时程增强(long term potentiation,ltp)的诱导和维持，可以促进突触前膜递质的释放。由于no寿命较短，难以检测，可以通过检测nnos来间接反应no的功能状态。
[0009]
发明人通过对大鼠原代海马神经元进行太赫兹波辐射后的氨基酸类神经递质、以及上述几种突触后蛋白表达的变化进行研究时发现，太赫兹波辐射可致原代海马神经元氨基酸类神经递质的抑制性改变；并且太赫兹波辐射可致海马神经型一氧化氮合酶nnos表达显著降低，而对其他突触后分子psd95、camk ii和creb表达未见明显影响；即在上述几种突触后蛋白中，只有nnos对太赫兹波辐射具有敏感性。由此可见，nnos表达于太赫兹波辐射后，可作为太赫兹波辐射致神经信息传递障碍的敏感标志物。通过检测在太赫兹波辐射作用下神经元中nnos的表达量变化，可以有效地判断太赫兹波辐射作用下是否会造成神经元状态出现异常。根据发明人的研究成果，本发明提供了一种检测太赫兹波辐射致神经元信息传递异常的方法，通过检测辐射后神经细胞中特定蛋白的表达水平以判断太赫兹波辐射致神经元信息传递是否异常。
[0010]
本发明的目的，是通过以下方式实现的：
[0011]
神经型一氧化氮合成酶在检测太赫兹波辐射作用下神经元状态中的用途。
[0012]
上述的用途，所述神经型一氧化氮合成酶表达下调时，神经元状态异常。
[0013]
上述的用途，所述神经型一氧化氮合成酶是太赫兹波辐射致神经信息传递障碍的敏感标志物。
[0014]
上述的用途，太赫兹波辐射的强度为30～60毫瓦，辐射的频率为0.1～0.3thz，辐射的时间为50～70分钟。
[0015]
一种在检测太赫兹波辐射作用下神经元状态时作为敏感标志物的蛋白，所述蛋白是神经型一氧化氮合成酶。
[0016]
检测神经型一氧化氮合成酶的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测在太赫兹波辐射作用下的神经元状态。
[0017]
一种检测在太赫兹波辐射作用下神经元状态的方法，包括：对神经元施加太赫兹波辐射，测定辐射前后神经元中神经型一氧化氮合成酶的表达量；
[0018]
其中，神经型一氧化氮合成酶的表达量下调，是神经元状态异常的指示。
[0019]
上述的方法，太赫兹波辐射的强度为30～60毫瓦，辐射的频率为0.1～0.3thz，太赫兹波辐射的时间为50～70分钟。
[0020]
上述的方法，包括以下步骤：
[0021]
步骤一：培养大鼠原代海马神经元；
[0022]
步骤二：对大鼠原代海马神经元进行太赫兹波辐射；
[0023]
步骤三：检测原代海马神经元突触后相关蛋白nnos。
[0024]
进一步地，上述方法中，由以下方法步骤组成：
[0025]
步骤一：培养大鼠原代海马神经元；
[0026]
步骤二：对大鼠原代海马神经元进行太赫兹波辐射；
[0027]
步骤三：原代海马神经元氨基酸递质释放检测；
[0028]
步骤四：原代海马神经元突触后相关蛋白psd95、camk ii、nnos和creb检测。
[0029]
一种调控神经元中神经型一氧化氮合成酶表达量的方法，包括：使太赫兹波辐射所述神经元。
[0030]
上述的方法，所述神经型一氧化氮合成酶表达下调。
[0031]
根据本发明的实施例，在太赫兹波辐射作用下，神经元中的nnos表达下调，从而导致神经元状态出现异常，神经信息传递受阻。
[0032]
根据本发明的实施例，所述太赫兹波辐射的强度为30～60毫瓦，频率为0.1～0.3thz。在此辐射条件下，会造成nnos表达下调，从而导致神经元状态出现异常，神经信息传递受阻。
[0033]
根据本发明的实施例，所述太赫兹波辐射的时间为50～70分钟。在此辐射条件下，会造成nnos表达下调，从而导致神经元状态出现异常，神经信息传递受阻。
[0034]
在本发明的另一方面，本发明提出了检测nnos的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于检测在太赫兹波辐射作用下的神经元状态。在太赫兹波辐射作用下会导致nnos表达下调，从而导致神经元信息传递出现异常。因此，利用特异性检测nnos的试剂对nnos的表达进行检测，可以有效地判断太赫兹波辐射作用下是否会造成神经元状态出现异常。
[0035]
本发明的有益之处在于：本发明发现了对太赫兹波辐射特异性敏感的神经元突触后信息传递分子，即神经型一氧化氮合成酶nnos(neuronal nitric oxide synthase,nnos)。太赫兹波辐射可致海马神经型一氧化氮合酶nnos表达下调，从而导致神经元状态出现异常，神经信息传递受阻。因此，通过检测神经细胞中敏感蛋白nnos的表达变化，可以有效地判断太赫兹波辐射致神经元信息传递是否异常，该检测方法具有特异性强，灵敏度、准确性高的优点。
[0036]
本发明的附加方面和优点将通过说明书附图以及具体实施方式进一步的展示，并且通过实施例的具体示范。
附图说明
[0037]
图1和图2记录了太赫兹波辐射后大鼠海马神经元突触后相关蛋白的变化，其中c为假辐射组，r组为太赫兹波(0.16thz/50mw)辐射组，*示p<0.05。
[0038]
图1为psd95、camk ii、nnos和creb蛋白免疫印迹条带图。
[0039]
图2为psd95、camk ii、nnos和creb蛋白表达量统计图。
具体实施方式
[0040]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释，下述实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0041]
实施例1
[0042]
1.材料和方法
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1.1大鼠原代海马神经元培养方法
[0044]
取新生12h内的wistar乳鼠，置于75％酒精中浸泡消毒。在无菌条件下断头，取脑。在解剖显微镜下，用眼科镊剥离海马，经消化和分散，用种植液将细胞悬液稀释为5
×
105/ml的密度，接种于多聚赖氨酸包被的35mm培养皿中，放入二氧化碳培养箱中培养。待细胞贴壁后更换培养基，将种植液全部吸掉，加入2ml饲养液。并于培养的第3d向培养液中加入终浓度为3～5μg/ml阿糖胞苷，作用24h后半量换液，之后每周半量换液2次。
[0045]
1.2大鼠原代海马神经元太赫兹波辐射方法
[0046]
将大鼠原代海马神经元随机分为假辐射组(c组)和太赫兹波辐射组(r组)2组，c组置于培养箱中不予辐射，r组使用qs2-180thz波发射源，功率范围为1～65mw。辐射时输出功率为50mw，对应频率为0.16thz，辐射时间为60min。
[0047]
1.3原代海马神经元氨基酸递质释放检测
[0048]
在thz波辐射后即刻，原代海马神经元的c组和r组细胞培养皿中吸取液体培养基300μl，使用5804r低温高速离心机，4℃，15000rpm离心20min，收取上清，置于-20℃冰箱内保存。agilent1100高效液相色谱仪开机运行后，按照先甲醇，后水的顺序冲洗系统，之后保持压力稳定，分别检测0.01mg/ml的谷氨酸(glutamic acid，glu)、甘氨酸(glycine，gly)和丙氨酸(alanine，ala)的标准品和混合标准品。之后检测每5个样品，检测1个混合标准品。待所有样品检测完毕，按照先水，后甲醇的顺序冲洗系统，退出化学工作站，关闭系统。
[0049]
1.4原代海马神经元突触后相关蛋白psd95、camk ii、nnos和creb检测
[0050]
收集上述c和r组原代海马神经元，于太赫兹波辐射后6h，使用加入了1％蛋白酶抑制剂的ripa裂解液处理原代海马神经元，冰上裂解10min，之后将细胞裂解液到ep管中，加入loading buffer煮沸10min；采用western blot检测突触后相关蛋白psd95、camk ii、nnos和creb表达，使用相应一抗孵育：兔抗psd95单克隆抗体(1:1000)、兔抗camk ii多克隆抗体(1:1000)、兔抗nnos单克隆抗体(1:1000)、兔抗creb多克隆抗体(1:1000)和兔抗gapdh多克隆抗体(1:10000)，4℃过夜；加入相应二抗(hrp标记的羊抗兔的二抗)常温孵育1h；tbs-t缓冲液洗涤3次，每次15min；在条带上滴加ecl+发光液；采用fluorchem fc2化学发光成像系统采集图像。
[0051]
2.结果
[0052]
2.1原代海马神经元氨基酸类神经递质的抑制性改变
[0053]
原代海马神经元氨基酸类神经递质变化见表1。在原代海马神经元中，与c组相比，r组的glu含量显著降低(p<0.01)，gly含量明显升高(p<0.05)，提示太赫兹波辐射可致神经元递质呈抑制性改变。
[0054]
表1. 50mw thz波辐射后原代海马神经元氨基酸类神经递质变化
[0055][0056][0057]
注：与c组相比，*示p<0.05，**示p<0.01。
[0058]
2.2太赫兹波辐射可致海马神经型一氧化氮合酶nnos表达下调，而对其他突触后
分子psd95、camk ii和creb表达未见明显影响。
[0059]
太赫兹波辐射原代海马神经元后6h，免疫印迹结果表明，与c组相比，r组nnos表达下调(p＜0.05)，而psd95、camk ii和creb表达未见明显改变(p＞0.05)，见图1和图2。
[0060]
3.结论
[0061]
太赫兹波辐射可致海马神经元递质抑制性改变，且nnos表达于辐射后显著降低，可作为太赫兹波辐射致神经信息传递障碍的敏感标志物。
[0062]
由于thz生物成像技术作为一种高灵敏度、无损伤、无标记的新兴成像方法在医学上的应用得到了越来越多的关注，目前太赫兹生物成像技术可以通过对比不同组织对太赫兹波吸收特性的不同来区别癌变组织和正常组织，因此也可以将该技术用于脑部病变组织和正常组织的检查。并且随着太赫兹安检仪在实际生活中的应用，研究太赫兹波对神经细胞的影响，有助于为检测活体生物时选择危害小的合适频率和功率的波长的太赫兹波，有利于生产更安全的太赫兹检测仪。并且由于nnos对太赫兹波具有显著的敏感度，可以采用特定的太赫兹波对实验动物或神经细胞进行辐射，制造出nnos表达异常的模型，用于药物试验和病理实验。
[0063]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。