高效液相色谱法定量检测氟尿嘧啶注射液中尿素的含量的制作方法

本发明属于分析技术领域，涉及一种注射液中有关物质的测定，特别涉及氟尿嘧啶注射液中尿素的定量测定。

背景技术：

药品是一类特殊商品，是用来诊断、预防及治疗疾病的一类特殊物质，与人们的健康和生命安危有极其密切的关系，其质量控制极为重要。药物安全性评价的一个重要内容是药物中有关物质的质量分数控制。

在药物分析中所称的“有关物质”是指药物中的有机杂质，主要来源于药物活性成分的制备过程，如起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等物质，也可能是制剂在生产、贮藏和运输过程中产生的降解产物、聚合物或晶型转变过程等特征杂质。通过对这些有关物质的测定，可以设法改变其合成路线、实验条件、储藏运输条件等因素，避免产生有关物质或使其降到最低限度。

药品在临床使用过程中产生的不良反应除了与主成分的药理活性有关，与杂质的影响也密不可分。为保证临床安全用药，必须严格控制药品中的杂质。

氟尿嘧啶注射液，对多种肿瘤具有较好的抗肿瘤效果，主要用于治疗消化道肿瘤，或较大剂量氟尿嘧啶治疗绒毛膜上皮癌。亦常用于治疗乳腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌及皮肤癌等。目前氟尿嘧啶注射液中的主要有关物质为：嘧啶-2,4,6(1h,3h,5h)三酮(杂质a)、二氢嘧啶-2,4,5(3h)-三酮(杂质b)、尿嘧啶(杂质c)、5-甲氧基尿嘧啶(杂质d)、5-氯尿嘧啶(杂质e)、2-乙氧基-5氟尿嘧啶(杂质f)、尿素(杂质g)。经检索，目前尚无对氟尿嘧啶注射液中的尿素检测采用高效液相色谱的方法，其原因在于尿素属于降解杂质，不易被发现，经详尽的文献检索发现，目前检测氟尿嘧啶注射液中尿素的方法只有药典bp2019方法如下表1所示。

表1薄层色谱方检测氟尿嘧啶中的尿素

上述方法只是用薄层法进行限度控制，检测能力有限，只能粗略的检测产品中的尿素，而不能对产品中的尿素进行定量检测，对产品的质量控制有待进一步提高。因此急需寻找一种能够定量检测氟尿嘧啶注射液中尿素含量的方法。

技术实现要素：

本发明提供一种氟尿嘧啶注射液中尿素的定量分析检测方法，包括如下步骤：采用反相高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，流动相为含有己烷磺酸钠的水溶液与甲醇的混合液等度洗脱。

进一步地，色谱柱规格为4.6*250mm，填料粒径5μm，优选品牌和型号为ymcods-aq柱；

进一步地，检测波长为190nm～210nm，优选为195nm；

进一步地，流速为0.6～0.9ml/min，优选为0.8ml/min；

进一步地，进样量为15～25μl，优选为20μl；

进一步地，己烷磺酸钠的水溶液的质量分数为0.10～0.15％，优选的，流动己烷磺酸钠水溶液的质量分数为0.12％，更优选的，流动相为质量分数为0.12％己烷磺酸钠的水溶液与甲醇的混合液的体积比为95:5。

进一步地，流动相的配制方法为：先配制己烷磺酸钠的水溶液，而后再与甲醇混合成体积比为95:5的混合溶液。

优选地，0.12％的己烷磺酸钠的水溶液的配制方法为：称取己烷磺酸钠1.2g加水1000ml，溶解，摇匀，过滤。

优选地，0.12％己烷磺酸钠水溶液与甲醇的比例为95:5的混合液的配制方法为：取0.12％的己烷磺酸钠的水溶液950ml加50ml甲醇，摇匀，即得。

采用这种新型的检测方法具有下述优点：

(1)氟尿嘧啶注射液中的氟尿嘧啶与尿素之间均能达到良好分离。

(2)本方法专属性、准确性良好，存在的微量工艺杂质不会影响尿素的定量测定。

(3)本方法灵敏度高，能检出尿素限度，还对尿素进行了定量。

附图说明

图1为本发明对照品尿素的出峰时间色谱图；

图2为本发明供试品的色谱图；

图3为本发明工艺杂质混合溶液的色谱图；

图4为本发明对照例尿素的色谱图；

图5为本发明对照例工艺杂质e、f混合液的色谱图。

具体实施方式

下面结合说明书附图对本发明实施例作进一步详细描述，应理解，实施例是用来更清楚的阐述本发明的技术方案，而不是对技术方案的限制。

术语解释：

本发明中所述的“己烷磺酸钠的水溶液”指的是己烷磺酸钠溶于水形成的溶液。

实施例1：

配制溶液：

精密量取市售的氟尿嘧啶注射液1ml(氟尿嘧啶注射液的浓度为50mg/ml)，置50ml量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(1mg/ml)；

取尿素对照品10mg，精密称定，置250ml量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(40μg/ml)；

取已经的工艺杂质abcdef各1mg，置250ml量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质混合液；

流动相的配制：称取己烷磺酸钠1.2g加水1000ml，溶解，摇匀，过滤；取0.12％的己烷磺酸钠的水溶液950ml加50ml甲醇，摇匀，即得。

色谱条件：

用十八烷基键合硅胶为填充剂，柱ymcods-aq柱，规格为：250×4.6mm，填料粒径5μm；

0.12％己烷磺酸钠的水溶液与甲醇体积比为95:5的混合液为流动相，等度洗脱。

流速0.8ml/min；

检测波长195nm；

精密取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1；

同样的色谱条件下，取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2所示。

同样的色谱条件下，取杂质混合液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图3所示。

当选用质量分数为0.12％己烷磺酸钠水溶液和甲醇比例为85:15---90:10的时候，尿素的峰都和倒峰在一起，影响结果测定。

实施例2：检测限、定量限试验

实验的条件，液相色谱方法和溶液的配制如实施例1，溶液的配制也可按照本领域技术人员公知的技术进行配制，

采用信噪比法测定氟尿嘧啶中尿素的检测限和定量限。

配制尿素的贮备液，稀释至一定浓度并进样，计算峰高与噪声的比值(信噪比)，其信噪比(s/n)约为10的样品检测量即为定量限，信噪比(s/n)约为3的样品检测量即为检测限，检测结果如下表所示：

实施例3：线性试验

实验的条件，液相色谱方法和溶液的配制如实施例1，溶液的配制也可按照本领域技术人员公知的技术进行配制；

尿素对照品溶液储备液：取尿素对照品20.32mg于250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

分别取尿素对照品溶液储备液2.0、4.0、5.0、6.0ml于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

在10％指标浓度～200％指标浓度范围(4.064μg/ml～81.28μg/ml)范围内取6个浓度点进行研究。线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，至少报告相关系数r²来证实良好的线性关系，要求r²的数值应在0.990～1.000之间。

线性测定结果如下表所示：

进样量为20μl，并记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到尿素的线性回归方程为a＝8594.94×x+1441,35，相关系数r²为1.00，结果显示，尿素在4.064μg/ml～81.28μg/ml范围内与其峰面积呈现良好的线性关系。

对照例1：采用氟尿嘧啶原料药检测有关物质的hplc方法，待测液的配制按照本领域技术人员熟知的技术进行配制。

色谱条件：用十八烷基键合硅胶为填充剂，glsciencesinertsilods2柱，规格为：250×4.6mm，填料粒径5μm；

流动相：6.805g/l磷酸二氢钾溶液，用5m的氢氧化钾调节ph值至5.7±0.1。

流速：1.0ml/min；

检测波长：紫外-可见分光检测器,(266nm或者195nm)

进样量：20μl；

运行时间：25mins；

进样室温度：室温；

波长为195nm，检测氟尿嘧啶注射液，发现4min左右出现杂质峰，但不能确定是工艺杂质还是尿素；

波长195nm下，分别测定尿素溶液、工艺杂质e、f的混合溶液，测试结果如图4、图5所示。尿素、工艺杂质e、f的出峰位置都在4min左右。

检测波长为266nm时，尿素纯品溶液不出峰。

可见上述检测氟尿嘧啶原料药中杂质的hplc方法不能检测出降解杂质尿素的含量。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些改动和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。