一种检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条的制作方法

本发明属于临床医学检测
技术领域：
，具体涉及一种检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条。
背景技术：
：嗜酸性粒细胞(eosinophil)由骨髓造血干细胞分化，一旦受到激活，嗜酸性粒细胞可以迅速释放大量预先合成的炎性介质，从而在组织引发炎症反应。目前研究确定，嗜酸性粒细胞炎症激活的特异性细胞因子包括嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ecp)、嗜酸性粒细胞碱性蛋白(mbp)、嗜酸性粒细胞源性神经毒素(edn)等。其中，ecp在变应性疾病中的特异性表达具高度敏感性，可作为病情活动情况及预后的重要监测指标。免疫金标记技术(immunogoldlabellingtechique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。抗体单克隆技术是将产生抗体的单个b淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。该技术产生的抗体具高度特异性、多样性和定向性，在多项临床实验室检查中有应用。变应性疾病诊断主要靠病史和症状，临床医院限于条件，检查主要是血查ige和渗出物查嗜酸性粒细胞，但这两种检查操作繁杂，耗时长，导致延误病人的诊断治疗。并且，由于检查手段有限，对变应性疾病分期、严重程度、预后及防治缺乏有效检查手段。以此，急需一种新的简易快捷的检测手段，以期提高临床的检查诊断效率。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条，所述胶体金试纸条由底板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次交错固定于所述底板上；所述胶体金垫包被有胶体金标记鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体；所述硝酸纤维素膜上依次设置有两条检测线和一条控制线，所述两条检测线上均包被有鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体，所述控制线上包被有兔抗鼠抗体。优选的，所述胶体金垫上胶体金标记鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体的浓度为0.1-1.0μg/μl，喷涂量为20-50μl。优选的，所述胶体金垫上胶体金标记鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体的浓度为0.11μg/μl，喷涂量为40μl。优选的，含所述胶体金标记鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体的包被液的制备方法如下：(1)通过枸橼酸三钠还原法制备粒径为30nm的胶体金颗粒；(2)将1ml步骤(1)中制备的胶体金颗粒加入10μl浓度为0.2m的碳酸钾缓冲液中，然后再加入22μg鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体，混匀后反应30min，再加入40μl质量分数为10％的bsa溶液进行封闭，再次反应15min后以16000r/min的转速离心去除上清液获得沉淀，向所述沉淀中加入200μl悬浮液，即可；所述悬浮液按如下方法配制：向水中加入0.6gtris、0.5g酪蛋白钠、0.6g分子量为360000的pvp、10g蔗糖和0.2g分子量为20000的peg后定容至200ml。优选的，所述两条检测线上鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体的浓度为1.5-3.5μg/μl，喷涂量为20-50μl。优选的，所述两条检测线上鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体的浓度为2.25μg/μl，喷涂量为35μl。优选的，含所述鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体的包被液的制备方法如下：将90μg鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体加入10μl质量分数为50％的海藻糖溶液中，再以浓度为0.1m，ph为7.8的pbs缓冲液定容至40μl，即可。优选的，所述控制线上兔抗鼠抗体的浓度为0.5-3.0μg/μl，喷涂量为30-50μl。优选的，所述控制线上兔抗鼠抗体的浓度为1μg/μl，喷涂量为35μl。优选的，含所述兔抗鼠抗体的包被液的制备方法如下：将40μg兔抗鼠抗体加入10μl质量分数为50％的海藻糖溶液中，再以浓度为0.1m，ph为7.8的pbs缓冲液定容至40μl，即可。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条，通过合理限定该试纸条中胶体金垫、两条检测线、控制线上各包被物的浓度和喷涂量，使该试纸条检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白时具有灵敏度高和特异性强的优点，其中，其灵敏度可到15ng/ml(以嗜酸性粒细胞阳离子蛋白计)；其特异性强表现在，用il-2、il-4、edn、mbp作为干扰抗原，以ecp作为对照，各抗原均用小牛血清模拟人血清，将各抗原分别稀释为不同浓度后以该试纸条进行检测，结果各干扰抗原的检测结果均为阴性，只有ecp的检测结果为阳性，说明本试纸条具有很好的特异性。以该试纸条进行检测时，耗时短，仅需5min，检测操作简便，无需特殊仪器设备和专业技术人员，可以有效提高临床的检查诊断效率。本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：图1为本发明中检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条的组装示意图。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。实施例1(1)制备含胶体金标记鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体的包被液1)枸橼酸三钠还原法制备粒径为30nm的胶体金颗粒：取100ml质量分数为0.01％的haucl水溶液加热至沸，之后搅动下加入1ml质量分数为1％的枸橼酸三钠水溶液，继续煮沸5min，制得粒径为30nm的胶体金颗粒；2)配制悬浮液：向蒸馏水中加入0.6gtris、0.5g酪蛋白钠、0.6g分子量为360000的pvp、10g蔗糖和0.2g分子量为20000的peg后定容至200ml，即可；3)将1ml步骤1)中制备的胶体金颗粒加入10μl浓度为0.2m的碳酸钾缓冲液中，然后再加入22μg鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体，混匀后反应30min，再加入40μl质量分数为10％的bsa溶液进行封闭，再次反应15min后以16000r/min的转速离心去除上清液获得沉淀，向沉淀中加入200μl步骤2)中配制的悬浮液，即得浓度为0.11μg/μl的含胶体金标记鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体的包被液；(2)制备含鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体的包被液将90μg鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体加入10μl质量分数为50％的海藻糖溶液中，再以浓度为0.1m，ph为7.8的pbs缓冲液定容至40μl，即得浓度为2.25μg/μl的含鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体的包被液；(3)制备含兔抗鼠抗体的包被液将40μg兔抗鼠抗体加入10μl质量分数为50％的海藻糖溶液中，再以浓度为0.1m，ph为7.8的pbs缓冲液定容至40μl，即得浓度为1μg/μl的含兔抗鼠抗体的包被液；一种检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条，组装示意图如图1所示，该胶体金试纸条由底板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜(nc膜)和吸水垫组成，其中，胶体金垫上喷涂有40μl步骤(1)中制备的含胶体金标记鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体的包被液，nc膜中两条检测线(t)上喷涂35μl步骤(2)中制备的含鼠抗人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白特异性抗体的包被液，质控线(c)上喷涂35μl步骤(3)中制备的含兔抗鼠抗体的包被液。实施例2测试本发明中检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条的灵敏性以小牛血清模拟人血清，嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ecp)为抗原，分别制作ecp浓度为0ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml和70ng/ml的待测液，各待测液均取50μl分别滴加于9个实施例1中检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条上的样品垫上，5min后肉眼判读结果，结果见表1。ecp浓度(ng/ml)01015203040506070结果－－±++++++++注：试纸条中，仅c线显色，以“－”表示，结果为阴性；仅一条t线和c线显色，且t线颜色较浅，以“±”表示，结果为弱阳性；仅一条t线和c线显色，以“+”表示，结果为阳性；两条t线和c线显色，以“++”表示，结果为强阳性。由表1可知，本发明中检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条灵敏度可到15ng/ml。实施例3测试本发明中检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条的特异性以小牛血清模拟人血清，ecp为抗原，il-2、il-4、edn、mbp作为干扰抗原，分别制作ecp、il-2、il-4、edn、mbp浓度分别为10ng/ml、15ng/ml、22ng/ml、25ng/ml、40ng/ml、50ng/ml和60ng/ml的待测液，各待测液均取50μl分别滴加于35个实施例1中检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条上的样品垫上，5min后肉眼判读结果，结果见表2。浓度(ng/ml)10152225405060ecp－±++++++il-2－－－－－－－il-4－－－－－－－edn－－－－－－－mbp－－－－－－－注：试纸条中，仅c线显色，以“－”表示，结果为阴性；仅一条t线和c线显色，且t线颜色较浅，以“±”表示，结果为弱阳性；仅一条t线和c线显色，以“+”表示，结果为阳性；两条t线和c线显色，以“++”表示，结果为强阳性。由表2可知，本发明中检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的胶体金试纸条特异性强。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12