一种肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的检测方法。

背景技术：

程序性死亡受体-1(pd-1)是主要的免疫检查点受体，通过结合其配体程序性死亡配体-1(pd-l1)，使t细胞效应功能的下调，从而有助于维持对肿瘤细胞的耐受性。目前市场上针对pd-1和pd-l1的抑制剂主要有三种，pembrolizumab(商品名：keytruda)、nibolumab(商品名：opdivo)和atezolizumab(商品名：tecentriq)，可用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌等多种癌症的治疗。但是，并不是所有患者都能从pd-1/pd-l1抑制剂治疗过程中受益，pd-1/pd-l1抑制剂目前只在少部分的癌症病人身上可以产生持久控制肿瘤的效果。因此，检测病人是否有pd-l1阳性表达，能够有效帮助病人选择合适的药物用于治疗。目前，pd-1/pd-l1的检测方法主要是基于细胞蛋白水平的检测，在临床中，主要采用免疫组化的方法，利用手术或穿刺后取得的肿瘤组织进行切片染色。免疫组化的结果与病理医师的经验密切相关。因此，我们迫切需要一种新的无创的、评价方法和标准较为稳定的pd-l1检测方法。

其中，循环肿瘤细胞是由原发灶脱落，进入血循环后，在远处器官或原发脏器定居，形成转移灶。循环肿瘤细胞ctc检测作为液体活检的热门领域，在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现已逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，临床应用价值极其显著。因此，若能提供一种检测循环肿瘤细胞等肿瘤细胞表面pd-l1的方法，将具有非常重要的意义。

中国专利cn201810312287.x即公开了一种循环肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的检测方法。其包括以下步骤：(1)将全血用红细胞裂解液处理，分离出有核细胞，并用甲醛进行固定；(2)先通过肿瘤免疫荧光标志物细胞角蛋白抗体anti-ck进行阳性筛选，用pdl1-抗孵育所有细胞，然后用标记有fitc荧光基团的pd-l1二抗孵育，再用细胞核荧光染料dapi标记出所有细胞；(3)采用高通量多色成像分析，选择cy5、fitc和dapi的滤光片，观察通道表面荧光颜色，最终实现对循环肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的检测。这种检测方法采用全血用红细胞裂解液处理，分离出有核细胞，未能直接分离出ctc细胞，背景细胞复杂，难以保证检测的准确性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的检测方法，其提高了检测的准确性。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的检测方法，包括如下步骤：

a、提供捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及孵育形成在所述网状基体上的epcam抗体；

b、使分离自体液的有核细胞流过所述捕获筛，以使有核细胞中的肿瘤细胞结合至所述捕获筛上；

c、用甲醛将捕获的肿瘤细胞固定在所述捕获筛上；

d、依次采用pd-l1一抗溶液、标记有荧光基团alexafluor647的pd-l1二抗溶液、pan-ck-alexafluor488一抗溶液、cd45一抗溶液及标记有荧光基团alexafluor568的cd45二抗溶液对所述捕获筛上固定的细胞进行孵育，然后用细胞核荧光染料标记出所述捕获筛上的所有细胞。

优选地，所述步骤a中，所述网状基体包括不锈钢体以及覆盖于所述不锈钢体表面的保护层，所述保护层由贵金属或其合金制成，所述epcam抗体覆设于所述保护层上。

更优选地，所述epcam抗体通过traut’s试剂或带有生物素-亲和素的硫醇盐分子连接于所述保护层上。

更优选地，所述网状基体的尺寸为2-10mm×2-10mm，所述筛的孔为20µm-100µm。

优选地，所述步骤b中，在有核细胞流过所述捕获筛且肿瘤细胞结合至所述捕获筛上后，使用细胞清洗液冲洗所述捕获筛以去除没有结合至所述捕获筛的杂物或细胞。

优选地，所述步骤b中，所述有核细胞分离自血液、尿液或腹腔液，上述的体液为血压、尿液或腹腔液。在一具体实施例中，所述有核细胞分离自全血，具体实施如下：通过红细胞裂解液或淋巴细胞分离液处理采集的全血，分离出有核细胞。

被捕获筛捕获的肿瘤细胞为循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell,ctc)或尿肿瘤细胞(urinarytumorcell,utc)。其中，循环肿瘤细胞是指由实体瘤原发灶或转移灶脱落到血液循环中的肿瘤细胞；尿肿瘤细胞是指进入到尿液中的肿瘤细胞。

优选地，所述步骤c中，将结合有肿瘤细胞的捕获筛放入4%多聚甲醛溶液中，室温固定10~60min，使用磷酸盐缓冲液清洗。

优选地，所述步骤d中的孵育具体实施如下：

按照1:（50~1000）比例加入pd-l1一抗溶液，室温孵育所述捕获筛上固定的细胞20~80min，然后使用磷酸盐缓冲液清洗；

按照1:（50~1000）比例加入标记有荧光基团alexafluor647的pd-l1二抗溶液，室温孵育20~80min，使用磷酸盐缓冲液清洗；

按照1:（50~1000）比例加入pan-ck-fitc一抗溶液，室温孵育所述捕获筛上固定的细胞20~80min，使用磷酸盐缓冲液清洗；

按照1:（50~1000）比例加入cd45一抗溶液，室温孵育所述捕获筛上固定的细胞20~80min，使用磷酸盐缓冲液清洗；

按照1:（50~1000）比例加入标记有荧光基团alexafluor568的cd45二抗溶液，室温孵育20~80min，使用磷酸盐缓冲液清洗。

更优选地，pd-l1一抗溶液、标记有荧光基团alexafluor647的pd-l1二抗溶液、pan-ck-alexafluor488一抗溶液、cd45一抗溶液、标记有荧光基团alexafluor568的cd45二抗溶液中抗体稀释液和抗体原液的体积比分别为1:（50~1000）。

优选地，所述步骤d中，用细胞核荧光染料dapi标记出所述捕获筛上的所有细胞。

优选地，所述检测方法还包括如下步骤：

e、采用cy5、fitc、pe和dapi的滤光片通过高通量多色成像分析，观察通道表面荧光颜色，对肿瘤细胞表面标志分子pd-l1进行检测。

本文中，术语“室温”是指20~25℃。

本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：

利用捕获筛将体液（如血液、尿液或腹腔液）中的肿瘤细胞捕获后再通过pd-l1、pd-l2抗体孵育检测，有效避免了体液中的其他多种细胞、细胞因子及蛋白对pd-l1、pd-l2抗体孵育检测的影响，提高了检测的准确性和可靠性，具有较好的特异性；且捕获分离后的肿瘤细胞直接以捕获筛为载体，进行孵育和检测，简便了操作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a、图1b分别为fitc滤光片检测肿瘤细胞ck阳性、阴性表达的示意图；

图2a、图2b分别为pd-l1（一抗）-alexafluor647（二抗）滤光片检测肿瘤细胞pd-l1阳性、阴性表达的示意图；

图3a、图3b分别为pe滤光片检测肿瘤细胞cd45阴性表达的示意图；

图4a、图4b分别为dapi滤光片检测肿瘤细胞是有核细胞的示意图；

图5a、图5b分别为四种滤光片合并检测肿瘤细胞pd-l1阳性、阴性表达的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以互相结合。

本实施例对肿瘤细胞表面标志分子pd-l1进行了检测，具体实施如下。

1、提供捕获筛

捕获筛包括不锈钢体和覆盖于不锈钢体表面上的保护层。保护层的材料为金或金合金（如，aupd），并且其上覆设有epcam抗体。保护层为采用磁控溅射或电化学方法沉积在不锈钢体上的aupd层。epcam抗体通过traut’s试剂连接在保护层上，带有生物素-亲和素的硫醇盐分子可替换traut’s试剂。

上述捕获筛的具体制备过程如下：

筛的选择；

不锈钢和金筛：选择51µm孔并且采用磁控溅射包覆aupd，筛的尺寸为2×2mm²。

预功能化；

在功能化之前采用了多种清洗方法来制备筛，包括高压蒸汽灭菌法、氧等离子清洗以及在多种溶液中超声清洗，包括食人鱼溶液（piranhasolutions）、氨水-双氧水混合液。例如，在洗涤剂中超声处理15分钟，冲洗，在70%~99%乙醇溶液中超声处理15分钟，冲洗，高纯水5分钟。采用更其它溶剂（如，食人鱼溶液）可缩短处理时间。

epcam抗体；

取2~10µlepcam抗体并冷冻，其后用其制备反应混合物（即，epcam抗体+具有edta的pbs）。

traut’s试剂；

购买后迅速冷冻。traut’s试剂和epcam抗体的体积比为10~20:1。其它方法如带有生物素-亲和素的硫醇盐分子可替代traut’s试剂来连接至筛以形成所述捕获筛。

具有抗体的traut’s试剂的孵育时间；

最佳反应时间为1小时。

筛在上述溶液中孵育；

在10分钟至12小时内并4℃、室温或37℃下采用上述孵育后的含抗体的traut’s试剂对筛进行孵育，使epcam抗体连接到筛上。

2、采集病人外周血，使用红细胞裂解液或淋巴细胞分离液，分离出有核细胞；

使有核细胞一次或反复多次流过捕获筛，在该过程中，肿瘤细胞被结合至捕获筛上的epcam抗体上，从而被捕获；

使用细胞清洗液冲洗所述捕获筛，将没有和捕获筛上的epcam抗体特异性结合的其他杂物或细胞等洗脱去除，只有特异性结合至epcam抗体的肿瘤细胞被留在捕获筛上。

3、将结合有肿瘤细胞的捕获筛放入500µl4%多聚甲醛溶液，室温固定20min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次；

4、加入pd-l1一抗溶液200µl（其中抗体原液和pbs的体积比为1:200），25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200µl磷酸盐缓冲液清洗2次；

5、加入标记有荧光基团alexafluor647的pd-l1二抗溶液200µl（其中抗体原液和pbs的体积比为1:100），25℃孵育60min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次；

6、加入pan-ck-alexafluor488一抗溶液200ul（其中抗体原液和pbs的体积比为1:100），25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200ul磷酸盐缓冲液清洗2次；

7、加入cd45一抗溶液200µl（其中抗体原液和pbs的体积比为1:200），25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200ul磷酸盐缓冲液清洗2次；

8、加入标记有荧光基团alexafluor568的cd45二抗溶液200µl（其中抗体原液和pbs的体积比为1:100），25℃孵育60min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次；

9、然后用200µl细胞核荧光染料dapi标记出所述捕获筛上的所有细胞。

10、采用cy5、fitc、pe和dapi的滤光片通过高通量多色成像分析，观察通道表面荧光颜色，对肿瘤细胞表面标志分子pd-l1进行检测：

pan-ck滤光片（绿色）、pd-l1（一抗）-alexafluor647（二抗）滤光片（红色）、cd45（一抗）-alexafluor568（二抗）滤光片（红色）、dapi滤光片（蓝色）及四者合并检测肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的阳性、阴性表达结果分别如图1a至图5a、图1b至图5b所示。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。