一种泻白散物质基准的HPLC特征图谱测定方法与流程

本发明属于医药检测技术领域，具体是一种泻白散物质基准的hplc特征图谱测定方法。

背景技术：

泻白散又名泻肺散，首载于宋·钱乙《小儿药证直诀》，《小儿药证直诀》是一部中医儿科专著，是北宋钱乙的弟子闫孝忠收集他的临证经验编成的，成书于宋宣和元年(公元1119年)，全书分为上、中、下三卷，上卷专论小儿脉、因、证、治，收列儿科常见病证治80余条，中卷收载典型病案23则，下卷列载方剂124首。全书论治始终遵循“小儿脏腑柔弱，易虚易实，易寒易热”这一生理、病理特点，遣方用药寒温适度，补泻并用，扶正祛邪兼顾，以柔养脏腑为本。其中不少良方，如六味地黄丸、泻白散等至今仍广泛应用于临床。《小儿药证直诀》一书中记载泻白散的内容为“泻白散，又名泻肺散，治小儿肺盛气急喘嗽地骨皮桑白皮炒各一两甘草炙一钱右剉散，入粳米一撮，水二小盏，煎七分，食前服”。

泻白散为肺火郁结，窒塞不降，上气喘急者之良方。方中桑白皮甘寒性降，专入肺经，清泻肺热，止咳平喘，为君药。地骨皮甘寒，清降肺中伏火，为臣药。粳米，炙甘草养胃和中，为佐使药。

泻白散自宋代钱乙创造开始，在宋代、元代、明代、清代等各朝代医书中被收录，如《严氏济生方》、《明目至宝》、《证治准绳》、《医宗金鉴》等。宋代煮散盛行，清代多以饮片入药，各朝代医书所载泻白散与《小儿药证直诀》中稍有差异，主要体现在药味炮制方式、剂量两方面，但是基本遵循了《小儿药证直诀》的药物组成。

现代实验研究证实，本方具有以下药理作用：(1)解热：本方及单味药地骨皮都具有较强的解热作用；(2)抗炎：甘草具有保泰松或氢化可的松样的抗炎作用；(3)抗病原微生物：桑白皮煎剂对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、福氏志贺菌、甲型副伤寒杆菌有较强抑制作用；甘草醇提物及甘草酸对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌也有抑制作用；(4)祛痰止咳。

经典名方物质基准是指以古代医籍记载的古代经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质的标准，除成型工艺外，其余制备方法应当与古代医籍记载基本一致。成型工艺一般采用冷冻干燥、喷雾干燥等不破坏物质组成的方式。物质基准包含对应实物(如冻干粉)、制备工艺及质量标准，对于质量标准，倡导整体性和全面性，应当包含特征图谱和指纹图谱。

特征图谱是选取图谱中某些重要的特征信息作为控制中药质量的重要鉴别手段，可确保其内在质量均一和稳定。经过十几年的研究和运用，该项技术已日趋成熟，在中药质量标准控制中得到更广泛应用。中国药典2015年版一部新增28个特征图谱，较中国药典2010年版一部有大幅度增加。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种泻白散物质基准的hplc特征图谱测定方法，有效的控制了泻白散物质基准的质量，保证了冻干粉与汤剂的物质一致性和冻干粉的批间一致性。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种泻白散物质基准的hplc特征图谱测定方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取泻白散物质基准0.1～1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％～80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)20～60分钟，放冷，再称定重量，用30％～80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15ml，转移至50ml量瓶中，加30％～80％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)参照物溶液的制备：取桑皮苷a、地骨皮乙素、甘草苷对照品，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含桑皮苷a10～100μg、地骨皮乙素0.1～0.5mg、甘草苷9～30μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

取桑白皮对照药材0.1～1g、地骨皮对照药材0.1～1g、甘草对照药材0.1～1g，置25ml量瓶中，加30％～80％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)20～60分钟，放冷，加30％～80％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.02～0.1％磷酸溶液为流动相b，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为224～320nm；流速为0.8～1.2ml/min；柱温25～35℃。

表1梯度洗脱表

(4)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液5～20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

所述供试品特征图谱中应呈现与参照物色谱图谱相对应的5个主要色谱峰，其保留时间应与参照物色谱图谱中5个主要色谱峰保留时间相对应；峰1、峰2来自地骨皮，峰3来自桑白皮，峰4、峰5来自甘草；其中2、3、4号色谱峰应与地骨皮乙素、桑皮苷a、甘草苷对照品色谱峰保留时间相对应。

进一步地，所述泻白散的物质基准的制备方法如下：按照处方比例称取桑白皮1.97～5.90g、地骨皮1.97～5.90g、甘草0.19～0.59g，破碎至粒径约4mm～8mm的颗粒，置砂锅中，加入粳米一撮，加水120ml，先武火加热至沸，后文火保持微沸煎至重量减少36g，趁热用200目滤布滤过，滤液减压浓缩至适量，冷冻干燥，粉碎，混匀，即得。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

(1)本发明在建立泻白散物质基准的hplc特征图谱测定方法过程中，以相对保留时间和相对峰面积为指标进行精密度、稳定性和重复性试验考察研究，确认了5个共有特征峰，保证了方法的稳定性和适应性。

(2)泻白散物质基准中化学成分复杂，本发明在建立起特征图谱的过程中，采用了梯度洗脱的方法，解决了特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题。

(3)建立泻白散物质基准的特征图谱，克服了单一成分含量测定难以反映整体质量的缺陷，可以从整体上更全面的控制泻白散物质基准的内在质量。

(4)以泻白散物质基准中各有效成分特征图谱作为一个整体看待，注重各个特征峰的前后顺序和相互关系，既避免了因只测少量成分而判定泻白散物质基准整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。

(5)本发明方法精密度好，稳定性好，重现性好。

附图说明

图1为泻白散物质基准的hplc标准特征图谱

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明。

实施例1：

1、仪器与试药

1.1仪器

lc-2030高效液相色谱仪，包括lab-solution工作站、四元梯度泵、自动进样器(日本岛津公司)；

kq-500dv型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；

xs105du型电子分析天平(梅特勒公司)；

fd-1a-50型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2试药

地骨皮乙素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号p19m9f56316，含量99.2％)；

桑皮苷a对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号p12m9l61177，含量99.4％)；

甘草苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号11610-201607，含量93.1％)；

桑白皮对照药材(中国食品药品检定研究院，批号121124-201608)；

地骨皮对照药材(中国食品药品检定研究院，批号121087-201707)；

甘草对照药材(中国食品药品检定研究院，批号120904-201519)；

乙腈(色谱纯，oceanpak公司)；

磷酸(色谱纯，阿拉丁试剂有限公司)；

甲醇(分析纯，天津富宇精细化工有限公司)。

2、方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性

色谱柱：inertsilods-sp(5μm，4.6×250mm)；

流动相：以乙腈为流动相a，以0.05％磷酸溶液为流动相b，按表1中的规定进行梯度洗脱；

检测波长：278nm；

流速：1ml/min；

柱温：30℃；

理论塔板数按地骨皮乙素峰计算应不低于5000。

3、特征图谱特征峰的测定

3.1特征图谱特征峰的建立

(1)供试品溶液的制备：取泻白散物质基准约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15ml，转移至50ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)参照物溶液的制备：取桑皮苷a、地骨皮乙素、甘草苷对照品，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含桑皮苷a50μg、地骨皮乙素0.2mg、甘草苷17μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

取桑白皮对照药材0.5g、地骨皮对照药材0.5g、甘草对照药材0.1g，置25ml量瓶中，加70％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

(3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。以地骨皮乙素色谱峰的保留时间和峰面积为1，计算相对保留时间和相对峰面积。

3.2特征峰确定

通过15批泻白散冻干粉特征图谱的测定，比较其图谱，确定特征峰为5个，以参照物地骨皮乙素的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，计算15批样品共有峰相对保留时间以及相对峰面积。结果见表2和表3。

表215批样品相对保留时间统计结果表

注：相对保留时间的rsd值应小于1％。

表315批样品相对峰面积统计结果表

3.3特征峰的描述

(1)特征峰共有5个。1号峰来自地骨皮，2号峰为地骨皮乙素，3号峰为桑皮苷a，4号峰为甘草苷，5号峰来自甘草。

(2)1、3、4、5号峰的相对保留时间的平均值分别为0.6980、1.6586、2.6299、2.6734，相对保留时间的rsd分别为0.26％、0.22％、0.25％、0.32％。

(3)1、3、4、5号峰的相对峰面积的平均值分别为0.2101、2.9851、0.1919、0.1918。

3.4特征图谱精密度试验

按照特征图谱精密度规定方法操作，取01批的样品制备供试品溶液，连续进样6次，分别记录特征峰的保留时间和峰面积，并计算相对保留时间和相对峰面积及其rsd，结果1、3、4、5号峰的相对保留时间的rsd分别为0.052％、0.062％、0.24％、0.25％(＜1％)，相对峰面积的rsd分别为0.19％、0.17％、0.74％、0.34％(＜3％)，表明仪器精密度良好。

3.5特征图谱稳定性试验

按照特征图谱稳定性测定方法操作，取01批的样品制备供试品溶液，于制备完成后的第0、4.5、10.5、15、20、24h分别进样测定，记录特征峰的保留时间和峰面积，并计算相对保留时间和相对峰面积及其rsd，结果1、3、4、5号峰的相对保留时间的rsd分别为0.057％、0.057％、0.29％、0.30％(＜1％)，相对峰面积的rsd分别为0.84％、0.81％、0.85％、0.80％(＜3％)，说明供试品溶液在制备完成后的24h内稳定性良好。

3.6特征图谱重复性试验

按照特征图谱重复性测定方法操作，取01批的样品制备供试品溶液，共6份，分别进样测定，记录特征峰的保留时间和峰面积，并计算相对保留时间和相对峰面积及其rsd，结果1、3、4、5号峰的相对保留时间的rsd分别为0.14％、0.051％、0.15％、0.16％(＜1％)，相对峰面积的rsd分别为0.45％、1.5％、1.7％、1.8％(＜3％)，说明本特征图谱测定方法重复性良好。

实施例2：

1、仪器与试药

1.1仪器

lc-20a高效液相色谱仪，包括lab-solution工作站、四元梯度泵、自动进样器(日本岛津公司)；

kq-500dv型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；

xs105du型电子分析天平(梅特勒公司)；

fd-1a-50型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2试药

地骨皮乙素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号p19m9f56316，含量99.2％)；

桑皮苷a对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号p12m9l61177，含量99.4％)；

甘草苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号11610-201607，含量93.1％)；

桑白皮对照药材(中国食品药品检定研究院，批号121124-201608)；

地骨皮对照药材(中国食品药品检定研究院，批号121087-201707)；

甘草对照药材(中国食品药品检定研究院，批号120904-201519)；

乙腈(色谱纯，oceanpak公司)；

磷酸(色谱纯，阿拉丁试剂有限公司)；

甲醇(分析纯，天津富宇精细化工有限公司)。

2、方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性

色谱柱：cosmosil-5c18-ms-ii(5μm，4.6×250mm)；

流动相：以乙腈为流动相a，以0.02％磷酸溶液为流动相b，按表1中的规定进行梯度洗脱；

检测波长：224nm；

流速：0.8ml/min；

柱温：35℃；

理论塔板数按地骨皮乙素峰计算应不低于5000。

3、特征图谱特征峰的测定

3.1特征图谱特征峰的建立

(1)供试品溶液的制备：取泻白散物质基准约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)20分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15ml，转移至50ml量瓶中，加30％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)参照物溶液的制备：取桑皮苷a、地骨皮乙素、甘草苷对照品，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含桑皮苷10μg、地骨皮乙素0.1mg、甘草苷9μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

取桑白皮对照药材0.1g、地骨皮对照药材0.1g、甘草对照药材0.1g，置25ml量瓶中，加30％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)20分钟，放冷，加30％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

(3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。以地骨皮乙素色谱峰的保留时间和峰面积为1，计算相对保留时间和相对峰面积。

3.2特征峰确定

通过15批泻白散冻干粉特征图谱的测定，比较其图谱，确定特征峰为5个，以参照物地骨皮乙素的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，计算15批样品共有峰相对保留时间以及相对峰面积。结果见表4和表5。

表415批样品相对保留时间统计结果表

注：相对保留时间的rsd值应小于1％。

表515批样品相对峰面积统计结果表

3.3特征峰的描述

(1)特征峰共有5个。1号峰来自地骨皮，2号峰为地骨皮乙素，3号峰为桑皮苷a，4号峰为甘草苷，5号峰来自甘草。

(2)1、3、4、5号峰的相对保留时间的平均值分别为0.6972、1.6590、2.6312、2.6736，相对保留时间的rsd分别为0.32％、0.23％、0.23％、0.32％。

(3)1、3、4、5号峰的相对峰面积的平均值分别为0.2100、2.9851、0.1920、0.1919。

3.4特征图谱精密度试验

按照特征图谱精密度规定方法操作，取01批的样品制备供试品溶液，连续进样6次，分别记录特征峰的保留时间和峰面积，并计算相对保留时间和相对峰面积及其rsd，结果1、3、4、5号峰的相对保留时间的rsd分别为0.041％、0.059％、0.28％、0.30％(＜1％)，相对峰面积的rsd分别为0.25％、0.21％、0.58％、0.45％(＜3％)，表明仪器精密度良好。

3.5特征图谱稳定性试验

按照特征图谱稳定性测定方法操作，取01批的样品制备供试品溶液，于制备完成后的第0、4.5、10.5、15、20、24h分别进样测定，记录特征峰的保留时间和峰面积，并计算相对保留时间和相对峰面积及其rsd，结果1、3、4、5号峰的相对保留时间的rsd分别为0.049％、0.062％、0.33％、0.38％(＜1％)，相对峰面积的rsd分别为0.51％、1.1％、0.68％、0.71％(＜3％)，说明供试品溶液在制备完成后的24h内稳定性良好。

3.6特征图谱重复性试验

按照特征图谱重复性测定方法操作，取01批的样品制备供试品溶液，共6份，分别进样测定，记录特征峰的保留时间和峰面积，并计算相对保留时间和相对峰面积及其rsd，结果1、3、4、5号峰的相对保留时间的rsd分别为0.10％、0.063％、0.17％、0.16％(＜1％)，相对峰面积的rsd分别为1.2％、0.93％、1.2％、1.1％(＜3％)，说明本特征图谱测定方法重复性良好。

以上试验结果表明，应用此方法具有稳定性好、重复性好的优点，能全面反映泻白散物质基准的整体和内在质量。

实施例3：

1、仪器与试药

1.1仪器

lc-2030c3d高效液相色谱仪，包括lab-solution工作站、四元梯度泵、自动进样器(日本岛津公司)；

kq-500dv型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；

xs105du型电子分析天平(梅特勒公司)；

fd-1a-50型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2试药

地骨皮乙素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号p19m9f56316，含量99.2％)；

桑皮苷a对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号p12m9l61177，含量99.4％)；

甘草苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号11610-201607，含量93.1％)；

桑白皮对照药材(中国食品药品检定研究院，批号121124-201608)；

地骨皮对照药材(中国食品药品检定研究院，批号121087-201707)；

甘草对照药材(中国食品药品检定研究院，批号120904-201519)；

乙腈(色谱纯，oceanpak公司)；

磷酸(色谱纯，阿拉丁试剂有限公司)；

甲醇(分析纯，天津富宇精细化工有限公司)。

2、方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性

色谱柱：kromasilods-c18(5μm，4.6×250mm)；

流动相：以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b，按表1中的规定进行梯度洗脱；

检测波长：320nm；

流速：1.2ml/min；

柱温：25℃；

理论塔板数按地骨皮乙素峰计算应不低于5000。

3、特征图谱特征峰的测定

3.1特征图谱特征峰的建立

(1)供试品溶液的制备：取泻白散物质基准约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)60分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15ml，转移至50ml量瓶中，加80％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)参照物溶液的制备：取桑皮苷a、地骨皮乙素、甘草苷对照品，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含桑皮苷a100μg、地骨皮乙素0.5mg、甘草苷30μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

取桑白皮对照药材1g、地骨皮对照药材1g、甘草对照药材1g，置25ml量瓶中，加80％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)60分钟，放冷，加80％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

(3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。以地骨皮乙素色谱峰的保留时间和峰面积为1，计算相对保留时间和相对峰面积。

3.2特征峰确定

通过15批泻白散冻干粉特征图谱的测定，比较其图谱，确定特征峰为5个，以参照物地骨皮乙素的色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为1，计算15批样品共有峰相对保留时间以及相对峰面积。结果见表6和表7。

表615批样品相对保留时间统计结果表

注：相对保留时间的rsd值应小于1％。

表715批样品相对峰面积统计结果表

3.3特征峰的描述

(1)特征峰共有5个。1号峰来自地骨皮，2号峰为地骨皮乙素，3号峰为桑皮苷a，4号峰为甘草苷，5号峰来自甘草。

(2)1、3、4、5号峰的相对保留时间的平均值分别为0.6978、1.6585、2.6301、2.6731，相对保留时间的rsd分别为0.24％、0.22％、0.25％、0.32％。

(3)1、3、4、5号峰的相对峰面积的平均值分别为0.2100、2.9848、0.1918、0.1916。

3.4特征图谱精密度试验

按照特征图谱精密度规定方法操作，取01批的样品制备供试品溶液，连续进样6次，分别记录特征峰的保留时间和峰面积，并计算相对保留时间和相对峰面积及其rsd，结果1、3、4、5号峰的相对保留时间的rsd分别为0.055％、0.063％、0.19％、0.16％(＜1％)，相对峰面积的rsd分别为0.75％、0.53％、0.36％、0.46％(＜3％)，表明仪器精密度良好。

3.5特征图谱稳定性试验

按照特征图谱稳定性测定方法操作，取01批的样品制备供试品溶液，于制备完成后的第0、4.5、10.5、15、20、24h分别进样测定，记录特征峰的保留时间和峰面积，并计算相对保留时间和相对峰面积及其rsd，结果1、3、4、5号峰的相对保留时间的rsd分别为0.086％、0.091％、0.25％、0.25％(＜1％)，相对峰面积的rsd分别为0.73％、0.91％、0.88％、0.63％(＜3％)，说明供试品溶液在制备完成后的24h内稳定性良好。

3.6特征图谱重复性试验

按照特征图谱重复性测定方法操作，取01批的样品制备供试品溶液，共6份，分别进样测定，记录特征峰的保留时间和峰面积，并计算相对保留时间和相对峰面积及其rsd，结果1、3、4、5号峰的相对保留时间的rsd分别为0.11％、0.065％、0.12％、0.14％(＜1％)，相对峰面积的rsd分别为1.0％、1.0％、1.3％、1.5％(＜3％)，说明本特征图谱测定方法重复性良好。

以上试验结果表明，应用此方法具有稳定性好、重复性好的优点，能全面反映泻白散物质基准的整体和内在质量。