补肺胶囊质量标准提升检测方法与流程

本发明涉及药学领域，尤其是补肺胶囊质量标准提升检测方法。

背景技术：

补肺胶囊是贵州中医药大学第二附属医院呼吸内科主任葛正行主任医师经验方，后经开发为医疗机构制剂，临床使用近10年，疗效确切。本方主要由黄芪、土炒白术、盐补骨脂、肉苁蓉、陈皮、炙甘草等12味中药组成。具有补肺益肾，止咳平喘的作用，主要用于肺胀病，肺肾气虚等证。本方主要针对慢性阻塞性肺疾病(copd)的稳定期(肺胀病肺肾气虚)患者。原方原质量标准落后，原标准仅按照医院制剂要求进行研究，在原有质量标准中，全方12味药物，仅有3个定性指标，1个定量指标(补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素为含量测定)，且为非主药，远达不到《药品注册管理办法》(试行)对6类新药的要求，不足以达到质量控制目的。

慢性阻塞性肺疾病(copd)是一种常见、多发、高致残率和高致死率的慢性呼吸系统疾病，据统计，每年感染此类疾病的人有6亿，并有290万人死于此类疾病，致死率居第六位，其发病趋势严峻，严重威胁人类生命和健康。因此，开展copd的防治研究尤为重要。

copd是一个概括的名称，它包含了两种主要的失调——慢性支气管炎和肺气肿，这两种疾病的共同特征都是空气无法顺畅的流通肺部，且两者通常是共存的，因此将其统称为慢阻肺。其临床表现是长期反复的咳嗽、咳痰、喘息和发生急性呼吸道感染，久而久之演变成慢性肺源性心脏病，甚至发生心肺衰竭。西医普遍认为吸烟、理化物质对呼吸道的刺激及感染等因素是copd的主要病因^【1】，机体受到上述各种因素的影响，导致呼吸道局部防御和免疫功能失调，自主神经功能失调，肺、心等组织产生病理改变，从而表现出咳、痰、喘等一系列慢支炎的临床症状，进一步发展为肺气肿、肺心病等心肺功能障碍的表现。中医认为copd的发生与发展常与外邪的反复侵袭，肺、脾、肾三脏功能失调密切相关。病位首先在肺，外邪从口鼻、皮毛入侵，多先犯肺，导致肺失宣降，上逆而为咳，升降失常则为喘。内伤于食，脾虚不能运化水湿，聚湿为痰，湿痰上渍于肺。肾阳亏虚，津液输化失司，肺气化功能失常，水气不能宣化，为痰为饮，阻塞气道；肾阴亏虚，虚火内炽，灼伤肺津，肺失宣降，肺气上逆而咳喘咯痰。

目前对copd的治疗主要着眼于抗炎、镇咳、化痰、平喘的作用，临床上常联合多种疗效的药物来治疗，但由于其价格昂贵，且毒副反应大，许多患者难于接受。而中医中药具有疗效好、价廉易得及毒副反应小等优势，对于改善copd患者免疫功能，减缓或阻止其肺原性心脏病、呼吸衰竭、肺性脑病等发展有益，已成为目前研究copd治疗的新课题。研究报道桂龙咳喘宁具有止咳化痰、降气平喘之功效，临床用于治疗慢支炎，此属于治标之方；人参蛤蚧补肺灵能补益肺脾肾，明显改善肺通气换气功能，对慢性阻塞性肺气肿有明确疗效，此属于治本之方，然而目前市场上仍然缺乏标本兼治的有效品种。

中药复方补肺胶囊为我院协定处方，是我省呼吸内科专家——主任医师葛正行教授的中医处方经验而成，主要作用于慢性阻塞性肺疾病(copd)稳定期的治疗。在我院已有十多年的应用历史，有比较好的临床疗效。补肺胶囊主要针对copd的稳定期患者，其以扶正补虚、补肾健脾益气，肺胃得固，从而增强机体体液及呼吸道免疫功能，减少急性发作周期，阻止copd的进一步发展、恶化成为肺原性心脏病、呼吸衰竭、肺性脑病等危急重症。达到提高copd的临床治疗效果，标本兼治，以改善患者生活质量、减轻病人及社会经济负担为目的。

我国对老年慢性支气管炎的预防和治疗药物研究曾作为全国性重点协作研究课题，发现不少有显著疗效的中草药和复方，并进行了基础和应用方面的研究，但均未见突破性的进展，其主要难点在防治慢性支气管炎的反复急性发作和进一步向肺气肿、肺动脉高压等方面，尤其是慢支炎各项病理组织学指标恢复正常，即所谓“治本”方面有待突破。

中医医疗机构院内制剂是老中医临床经验的结晶，是中医临床疗效的保证，也是中医药特色和优势的体现，是中药新药研发的源泉。补肺胶囊主要由黄芪、党参、北沙参、补骨脂等12味中药组成。根据中医理论，症侯气短懒言,畏风是因肺阴亏虚所致，症侯腰酸肢软,夜尿频多,头晕耳呜，是因肾阳亏损，肾阴不足，肾不纳气所致。本方中君药黄芪具有补肺益气、增强免疫之功效；臣药党参、补骨脂、炒白术、巴戟天、肉苁蓉、北沙参等具有温肾健脾补气、养血补精之功；佐药陈皮、法夏、南五味子、苏子具有化痰止咳、养阴清肺之效；使药甘草等具有温中散寒、调和诸药之效。全方合用，标本兼治，共奏补益肺肾，滋阴补阳、扶正补虚、肺胃得固之功效。主要作用于慢性阻塞性肺疾病的治疗，对肺肾虚弱引起的懒言，畏风，腰酸肢软，夜尿频多，头晕耳鸣，身寒肢冷，口干咽热，五心烦热，潮热盗汗等症有很好的疗效。本方经2002年上千例临床应用至今，已十年有余，并经药效学试验验证，补肺胶囊能提高copd模型大鼠的fev0.3、fev0.3/fvc、动脉血ph、pao2，降低paco2，具有改善肺功能的主要功效，同时具有较显著的抗炎、止咳、平喘及化痰功效，并能提高机体的免疫力，可见其标本兼治。copd稳定期在西医治疗基础上结合补肺胶囊治疗，能更好地缓解患者症状，显著降低急性发作次数，提高生存质量，具有较好的推广及应用价值。

我院按照“贵州省医疗机构制剂技术审评要点(中药、民族药)”的要求，已于2013年7月取得医疗机构制剂批准文号(黔药制字z20130005)，仅本院应用预计年产量可达20-30万元。我们将补肺胶囊进一步以六类新药-中药新药研制为目标，以解决近。按照现代中药复方制剂的研制及新药申报的具体要求，我们已经完成了补肺胶囊部分药学及药理学方面的研究，包括补肺胶囊的工艺、质量标准、主要药效学试验和急性毒性试验。由于本质量标准仅按照医院制剂要求进行研究，在原有质量标准中，全方12味药物，仅有3个定性指标，1个定量指标(补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素为含量测定)，且为非主药，远达不到《药品注册管理办法》(试行)对6类新药的要求，不足以达到质量控制目的。为进一步完善申报资料要求及有效控制其质量，根据本方以补气健脾为主，需保留主药黄芪、党参、白术等的有效成分多糖成分及黄芪甲苷，增加黄芪甲苷及总多糖为定量控制指标。希望通过提升质量标准及长毒试验，获得中药新药有效的质量控制标准及安全性评价的重要内容，为补肺胶囊临床前研究提供可靠依据。完成新药“补肺胶囊”的临床前研究。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种补肺胶囊质量标准提升检测方法，它能提供一套全新的补肺胶囊质量标准检测技术，通过该方法能有效提高医院制剂补肺胶囊质量标准。

本发明是这样实现的：补肺胶囊质量标准提升检测方法，包括如下步骤：

1)补肺胶囊标准品的制备：

a)将黄芪229g、党参172g、土炒白术138g、盐巴戟天138g、盐补骨脂138g、肉苁蓉138g、陈皮103g、法半夏103g、炒紫苏子103g、北沙参138g、醋南五味子103g及炙甘草57g混合均匀；

b)将混合药材用水完全浸没，并浸泡1小时后将混合药材加8倍质量的水进行煎煮，每次煎煮2小时，共煎煮3次，煎煮后的药液过滤，最后将3次煎煮的滤液合并；

c)将滤液60℃条件下减压浓缩至60℃下的相对密度为1.2～1.35的稠膏，然后向稠膏中加入二氧化硅混匀；

d)将上述混合物在80℃干燥，粉碎过60目筛，加入二氧化硅(约68g)混匀，装入胶囊制成1500粒，获得补肺胶囊标准品；

2)补肺胶囊标准品的定性检测：

a)随机从制备获得的补肺胶囊标准品中取样，取胶囊的内容物4g，加甲醇30ml，超声处理30min；再进行滤过，将滤液蒸干，残渣加水30ml使其完全溶解，用乙酸乙酯30ml振摇提取，将乙酸乙酯层蒸干，再用甲醇2ml溶解，作为供试品溶液a；另取黄芪对照药材1g，加甲醇30ml，超声处理30min；再进行滤过，将滤液蒸干，残渣加水30ml使其完全溶解，用乙酸乙酯30ml振摇提取，乙酸乙酯层蒸干，用甲醇1ml溶解，作为对照药材溶液a；按照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法进行试验；分别取供试品溶液a及对照药材溶液a各5μl，然后分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇为展开剂，三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇的体积比为12:1:1；将其展开、取出、晾干，然后置于氨气中熏10min，在波长为254nm紫外光下检视供试品溶液a的色谱与对照药材溶液a的色谱相应的位置上，是否显有相同颜色的荧光斑点；

b)随机从制备获得的补肺胶囊标准品中取样，取胶囊的内容物4g，加甲醇30ml，超声处理30min；再进行滤过，将滤液蒸干，残渣加水30ml使其完全溶解，用乙酸乙酯30ml振摇提取，乙酸乙酯层蒸干，用甲醇2ml溶解，作为供试品溶液b；另取紫苏子对照药材粉末1g，加甲醇30ml，超声处理30min，再进行滤过，将滤液蒸干，用甲醇2ml溶解，作为对照药材溶液b；按照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法进行试验；取供试品溶液b3μl，取对照药材溶液b1μl，将供试品溶液b与对照药材溶液b分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂，石油醚的沸点为60～90℃，石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸的体积比为22:2:0.2；展开、取出、晾干，喷以10％质量浓度的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在波长为365nm紫外光下检视，供试品色谱中，在供试品溶液b的色谱与对照药材溶液b的色谱相应的位置上，是否显有相同颜色的荧光斑点；

c)随机从制备获得的补肺胶囊标准品中取样，取胶囊的内容物4g，加甲醇30ml，超声处理30分钟；再进行滤过，将滤液蒸干，残渣加水20ml使其完全溶解，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，弃去醚液，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次30ml，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使其完全溶解，作为供试品溶液c；另取甘草对照药材1g，按照供试品溶液c相同的方法制成对照药材溶液c；按照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法进行试验；取供试品溶液c5μl、取对照药材溶液c2μl，将供试品溶液c与取对照药材溶液c分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-甲醇为展开剂，三氯甲烷与甲醇的体积比为9:3；展开、取出、晾干，喷以10％质量浓度的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在波长为365nm紫外光下检视，供试品色谱中，在供试品溶液c的色谱与对照药材溶液c的色谱相应的位置上，是否显有相同颜色的荧光斑点；

d)随机从制备获得的补肺胶囊标准品中取样，取胶囊的内容物8g，加乙酸乙酯50ml，50℃超声提取1小时；再进行滤过，将滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液d；取补骨脂对照药材0.4g，加乙酸乙酯20ml，超声处理1小时；再进行滤过，将滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使其完全溶解，作为对照药材溶液d；按照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法进行试验；取供试品溶液d10～15μl、对照药材溶液d2μl，将供试品溶液与对照药材溶液d分别点于同一硅胶g薄层板上，以正已烷-乙酸乙酯为展开剂，正已烷与乙酸的体积比为4:1；展开、取出、晾干，喷以10％质量浓度的氢氧化钾甲醇溶液，在波长为365nm紫外光下检视，供试品色谱中，在供试品溶液d的色谱与对照药材溶液d的色谱相应的位置上，是否显有相同颜色的荧光斑点；

e)随机从制备获得的补肺胶囊标准品中取样，取胶囊的内容物2g，加硅藻土2g，研细，加甲醇25ml，超声处理30分钟；再进行滤过，将滤液水浴蒸干后，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液e；另取陈皮对照药材0.5g及硅藻土0.5g，按照供试品溶液e的制备方法制成对照药材溶液e；按照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法进行试验；分别取供试品溶液e和对照药材溶液e各3～5μl，将供试品溶液e和对照药材溶液e分别点于同一硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水的上层溶液为展开剂，乙酸乙酯-甲醇-水的体积比为6:1:3；展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在波长为365nm紫外光下检视，供试品色谱中，在供试品溶液e的色谱与对照药材溶液e的色谱相应的位置上，是否显有相同颜色的荧光斑点；

f)随机从制备获得的补肺胶囊标准品中取样，取胶囊的内容物2g，加70％乙醇20ml，浸渍1小时，不时振摇，离心，取上清液，水浴蒸干，残渣加水10ml溶解，置于分液漏斗内，用乙酸乙酯提取2次，每次10ml，弃去，再用正丁醇提取2次，每次10ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液f；另取肉苁蓉对照药材1g，加30ml水加热回流30分钟后，离心滤过，取上清液，置分液漏斗内，正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为对照药材溶液f；按照中国药典2015年版四部通则0502的薄层色谱法进行试验；吸取供试品溶液f及对照药材溶液f各2μl，将供试品溶液f及对照药材溶液f分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-醋酸-水为展开剂，甲醇-醋酸-水的体积比为2:1:7；展开、取出、晾干，在波长为365nm紫外光下检视，供试品色谱中，在供试品溶液f的色谱与对照药材溶液f的色谱相应的位置上，是否显有相同颜色的荧光斑点。

【检查】应符合胶囊剂项下有关的各项规定(中国药典2015年版四部附录通则0103)。

3)含量测定

a)黄芪甲苷检测

对照品溶液的制备取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备：随机取将囊内容物8g，精密称定，置100ml离心管中，加水30ml，摇匀使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次20ml，再用20ml蒸馏水洗涤1次，弃去水洗液，合并两次氨洗液，置水浴锅上挥至无氨味，用水饱和正丁醇萃取2次，每次20ml，弃去洗液，合并正丁醇液，正丁醇液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算；按照高效液相色谱法通则0512测定；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水为流动相，乙腈-水的体积比为32∶68；蒸发光散射检测器检测，理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；最终每粒胶囊含黄芪以黄芪甲苷(c41h68o14)计，不得少于56μg；

b)多糖检测

对照品溶液的制备取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.14mg的溶液，即得对照品溶液；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分别置15ml具塞试管中，各加水补至1.0ml，精密加入4％苯酚溶液1ml(临用配置)，摇匀，精密加硫酸5ml，摇匀，置沸水浴中加热20分钟，取出，置冰浴中冷却5分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法通则0401，在485nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：随机取将囊内容物1g，精密称定，加水溶解，转移至250ml量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml离心管中，精密加入无水乙醇20ml，摇匀，冷藏静置过夜，取出，离心(转速为每分钟4000转)10分钟，弃去上清液，沉淀加80％乙醇10ml洗涤一次，同法离心，弃去上清液，沉淀加水溶解，转移至50ml量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液；

测定法：精密量取供试品溶液1ml，置15ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入4％苯酚溶液1ml”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得；每粒胶囊含多糖以无水葡萄糖(c6h12o6)计，不得少于55mg。

以上所有检测后，全部检测全部通过，则检测合格。

步骤1)的步骤c)中，向稠膏中加入二氧化硅为65-70g。

由于采用了上述技术方案，本发明构建了一套全新的质量标准检测方法，该方法更为科学，需保留主药黄芪、党参、白术等的有效成分多糖成分及黄芪甲苷，增加黄芪甲苷及总多糖为定量控制指标，有利于对其质量进行科学分析和评估，为提高产品质量和保障疗效提供数据支持和方法验证，并为该制剂建立更加科学全面的质量标准。并可获得中药新药有效的质量控制标准及安全性评价的重要内容，为补肺胶囊临床前研究提供可靠依据，完成新药“补肺胶囊”的临床前研究。

附图说明

图1为本发明的黄芪检测对照图；

其中，1-阴性样品，2-黄芪对照药材，3～5-补肺胶囊供试液；

图2为本发明的紫苏子检测对照图；

其中，1-阴性样品，2-紫苏子对照药材，3～5-补肺胶囊供试液；

图3为本发明的甘草检测对照图；

1-阴性样品，2-甘草对照药材，3～5-补肺胶囊供试液；

图4为本发明的补骨脂检测对照图；

1-阴性样品，2-补骨脂对照药材，3～5-补肺胶囊供试液；

图5为本发明的陈皮检测对照图；

1-阴性样品，2-陈皮对照药材，3～5-补肺胶囊供试液；

图6为本发明的肉苁蓉检测对照图；

1-阴性样品，2-肉苁蓉对照药材，3～5-补肺胶囊供试液；

图7为本发明的甲醇色谱图；

图8为本发明的黄芪甲苷对照品色谱图；

图9为本发明的阴性对照色谱图；

图10为本发明的补肺胶囊样品色谱图；

图11为本发明的黄芪甲苷标准曲线；

图12为本发明的葡萄糖标准曲线。

本发明简单易行，使用效果好。

具体实施方式

本发明的实施例：补肺胶囊质量标准提升检测方法，包括如下步骤：

1)补肺胶囊标准品的制备：

a)将黄芪229g、党参172g、土炒白术138g、盐巴戟天138g、盐补骨脂138g、肉苁蓉138g、陈皮103g、法半夏103g、炒紫苏子103g、北沙参138g、醋南五味子103g及炙甘草57g混合均匀；

b)将混合药材用水完全浸没，并浸泡1小时后，将混合药材加8倍质量的水进行煎煮，每次煎煮2小时，共煎煮3次，煎煮后的药液过滤，最后将3次煎煮的滤液合并；

c)将滤液60℃条件下减压浓缩至60℃下的相对密度为1.2～1.35的稠膏，然后向稠膏中加入二氧化硅混匀(约68g)；

d)将上述混合物在80℃干燥，粉碎过60目筛，加入二氧化硅(约68g)混匀，装入胶囊制成1500粒，获得补肺胶囊标准品；

【性状】根据样品的试验结果拟定，三批中试样品均与正文描述一致。本品为硬胶囊剂，内容物为棕黄色至棕褐色粉末，气微，味微甘，略苦。

【鉴别】本品由十二味中药材组成，经提取、精制而成，成分较复杂。我们对各味中药材的成分进行了鉴别方法的试验研究，建立了黄芪、紫苏子、甘草、补骨脂、陈皮、肉苁蓉的薄层鉴别方法。

2)补肺胶囊标准品的检测：

(1)补肺胶囊中黄芪的鉴别

供试品溶液的制备：取本品内容物4g，加甲醇30ml，超声提取30min，过滤，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙酸乙酯30ml振摇提取，乙酸乙酯层蒸干，用甲醇2ml溶解，即得。

阴性对照溶液的制备：取黄芪阴性对照样品4g，同法制成阴性对照溶液。

对照药材溶液的制备：取黄芪对照药材1g，加甲醇30ml，超声提取30min，过滤，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙酸乙酯30ml振摇提取，乙酸乙酯层蒸干，用甲醇1ml溶解，即得。

照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(12:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏10min，置紫外光(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。如图1所示。

(2)补肺胶囊中紫苏子的鉴别

供试品溶液的制备：取本品内容物4g，加甲醇30ml，超声提取30min，过滤，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙酸乙酯30ml振摇提取，乙酸乙酯层蒸干，用甲醇2ml溶解，即得。

阴性对照溶液的制备：取紫苏子阴性对照样品4g，同法制成阴性对照溶液。

对照药材溶液的制备：取紫苏子对照药材粉末1g，加甲醇30ml，超声提取30min，过滤，滤液蒸干，用甲醇2ml溶解，即得。

照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液及阴性对照溶液各3μl、紫苏子对照药材溶液1μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(22:2:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。如图2所示。

(3)补肺胶囊中甘草的鉴别

取本品4g，加甲醇30ml，超声30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，弃去醚液。用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次30ml，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：取甘草阴性对照样品4g，同法制成阴性对照溶液。

对照药材溶液的制备：取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。

照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取本品供试液及阴性对照溶液各5μl、对照药材溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(9:3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。如图3所示。

(4)补肺胶囊中补骨脂的鉴别

供试品溶液的制备：取本品内容物8g，加乙酸乙酯50ml，50℃超声提取1小时，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：取补骨脂阴性对照样品8g，同法制成阴性对照溶液。

对照药材溶液的制备：取补骨脂对照药材0.4g，加乙酸乙酯20ml，超声处理1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为对照药材溶液。

照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液及阴性对照溶液各10～15μl、对照药材溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以正已烷-乙酸乙酯(4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％氢氧化钾甲醇溶液，置紫外光灯(365nm)下观察。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。如图4所示。

(5)补肺胶囊中陈皮的鉴别

供试品溶液的制备：取本品内容物2g，加硅藻土2g，研细，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液水浴蒸干后，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：取陈皮阴性对照样品2g，同法制成阴性对照溶液。

对照药材溶液的制备：另取陈皮对照药材0.5g，加硅藻土0.5g，同法制成对照药材溶液。

照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(6:1:3)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下观察。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点。如图5所示。

(6)补肺胶囊中肉苁蓉的鉴别

供试品溶液的制备：取本品内容物2g，加70％乙醇20ml，浸渍1小时，不时振摇，离心，取上清液，水浴蒸干，残渣加水10ml溶解，置于分液漏斗内，用乙酸乙酯提取2次，每次10ml，弃去，再用正丁醇提取2次，每次10ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：取肉苁蓉阴性对照样品2g，同法制成阴性对照溶液。

对照药材溶液的制备：取肉苁蓉对照药材1g，加30ml水加热回流30分钟后，离心滤过，取上清液，置分液漏斗内，正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为对照药材溶液。

照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-醋酸-水(2:1:7)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。如图6所示。

【检查】按《中国药典》2015年版四部通则0103胶囊剂项下的规定检查。分别检查水分、装量差异、崩解时限、微生物限度。

【水分】按《中国药典》2015年版四部通则0832水分测定法(第二法)测定。

【装量差异】按《中国药典》2015年版四部通则0103胶囊剂项下的规定检查。

【崩解时限】按《中国药典》2015年版四部通则0921崩解时限检查法规定检查。

表1补肺胶囊检查结果

3)含量测定

黄芪甲苷照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。

1实验材料

dionexμltimate3000型高效液相色谱仪(检测器为sederelt-elsd80蒸发光检测器)；十万分之一天平(梅特勒-托利多ag285型)；电热鼓风干燥箱(101-2ab型，天津市泰斯特仪器有限公司)；明澈^tm-d24uv型纯水系统(德国merckmillipore公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯)，上海默克化工技术有限公司；正丁醇、氨水(分析纯)，天津市致远化学试剂有限公司；水为超纯水。

黄芪甲苷(110781-200613)购于中国食品药品检定研究院，含量以100％计。

2含量测定方法

2.1对照品溶液的制备

精密称取黄芪甲苷对照品4.22mg，置10ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。精密吸取对照品储备液2.5ml，加甲醇定容至5ml，即得黄芪甲苷对照液。

2.2供试品溶液的制备

取本品8g，精密称定，置100ml离心管中，加水30ml，摇匀使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次20ml，再用20ml蒸馏水洗涤1次，弃去水洗液，合并两次氨洗液，置水浴锅上挥至无氨味，用水饱和正丁醇萃取2次，弃去洗液，合并正丁醇液，正丁醇液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3阴性样品溶液的制备

取本品黄芪阴性对照样品约8g，精密称定，照2.2供试品溶液的制备项下的方法，自“置100ml离心管中”起，同法操作，即得。

2.4色谱条件

agilenthypersilods5umc18(250×4.6mm)；流动相：乙腈-水(32∶68)；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；氮气压力：3.4pa；漂移管温度：40℃；从理论上说，塔板数不少于4000。

3方法学考察

3.1专属性试验

分别精密吸取黄芪甲苷对照溶液、阴性对照溶液、空白溶液及供试品溶液各20μl注入色谱仪，按2.4项下的色谱条件测定。见图7-10。

从图谱可知，在此色谱条件下，黄芪甲苷色谱峰与其他组分峰完全分离，在与黄芪甲苷色谱峰相同的保留时间处，阴性对照无干扰。

3.2标准曲线的绘制

取2.1项下黄芪甲苷对照品溶液，分别进样5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl，按2.4项下色谱条件进行测定。记录相应的峰面积，以峰面积对数值y为纵坐标，以进样量对数值x为横坐标，绘制标准曲线并进行回归计算。黄芪甲苷的回归方程为：y＝1.5838x+0.6927，r²＝0.9996。线性关系见表1-1，标准曲线见图11。

表1-1标准曲线绘制结果(n＝6)

结果表明，黄芪甲苷的质量范围为1.055～6.330μg时，质量对数值与峰面积对数值具有较好的线性关系。

3.3精密度试验

取2.1项下黄芪甲苷对照品溶液，连续进样6次，结果见表1-2。结果表明，rsd为1.82％(n＝6)，仪器精密度良好。

表1-2精密度试验结果(n＝6)

3.4重复性试验

取本品(批号20170302)约8g，精密称定，共6份，制备供试品溶液，进样测定，结果见表1-3。结果表明，补肺胶囊中黄芪甲苷的平均含量为0.1434mg/g，rsd为2.93％(n＝6)，结果表明该方法重复性良好。

表1-3重复性试验结果(n＝6)

3.5稳定性试验

取“重复性试验”项下序号3的供试品溶液，密闭，室温放置，分别在0h、6h、8h、10h、12h、24h时间间隔下检测，结果见表1-4。结果表明，供试品溶液室温放置24h内稳定。

表1-4稳定性试验结果(n＝6)

3.6加样回收率试验

取批号为20170302的补肺胶囊内容物约4g，精密称定，共6份，按已知含量的100％加入黄芪甲苷对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率。结果见表1-5。结果表明，黄芪甲苷的加样回收率为103.73％，rsd值为2.57％(n＝6)，说明该方法准确度良好。

表1-5加样回收率试验结果

4样品测定

取补肺胶囊内容物约8g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算样品中黄芪甲苷含量，结果见表1-6。

表1-6补肺胶囊中黄芪甲苷含量测定结果

上述3批样品测得黄芪甲苷平均含量为70μ00粒。从大生产考虑，本品每克黄芪甲苷的含量，其限度以80％计算，黄芪甲苷的含量为56μg/粒，故本品的限度定为：每粒含黄芪以黄芪甲苷(c41h68o14)计，不得少于56μg/粒。

多糖照紫外分光光度法(《中国药典》2015年版通则0401)测定。

1实验材料

hp8453型紫外可见分光光度计；十万分之一天平(梅特勒-托利多ag285型)；sb-2000型水浴锅(上海爱朗仪器有限公司)；明澈^tm-d24uv型纯水系统(德国merckmillipore公司)，hc-2066高速离心机(安微中科中佳科学仪器有限公司)。

苯酚、硫酸、乙醇(分析纯)，重庆江川化工有限公司；水为超纯水。

d-无水葡萄糖(0833-9501)购于中国药品生物制品鉴定所，含量以100％计。

2含量测定方法

2.1对照品溶液的制备

称取葡萄糖14.24mg，加蒸馏水定容至100ml，即得对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备

取补肺胶囊内容物约1g，精密称定，加水溶解，转移至250ml量瓶中，用少量水多次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml离心管中，精密加入无水乙醇20ml，摇匀，冷藏静置过夜，取出，离心(转速为每分钟4000转)10分钟，弃去上清液，沉淀加80％乙醇10ml洗涤一次，同法离心，弃去上清液，沉淀加水溶解，转移至50ml量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。

2.3测定方法

精密吸取供试品溶液1ml，置15ml具塞试管中，精密加入4％苯酚溶液1ml(临用配置)，摇匀，再精密加硫酸5ml，摇匀，置沸水浴中加热20分钟，取出，置冰浴中冷却5分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在485nm的波长处测定吸光度。

3方法学考察

3.1标准曲线的制备

精密吸取2.1项下对照品溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分别置15ml具塞试管中，各加水补至1.0ml，自“精密加入4％苯酚溶液1ml”起，按2.3项下方法显色，测定，以吸光度(a)为纵坐标、以葡萄糖浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归计算。葡萄糖的回归方程为：a＝0.0632x-0.0310，r²＝0.9997，线性关系表见表2-1，标准曲线见图12。

表2-1标准曲线绘制结果(n＝5)

结果表明，葡萄糖的浓度为4.069～12.206μg/ml，葡萄糖浓度与吸光度具有较好的线性关系。

3.2精密度试验

精密吸取对照品溶液0.4ml，加水补至1.0ml，自“精密加入4％苯酚溶液1ml”起，按2.3项下方法显色，测定，计算rsd值，结果见表2-2。结果表明，多糖的吸光度平均值为0.454，rsd为0.11％(n＝6)，结果表明，实验仪器精密度良好。

表2-2精密度试验结果(n＝6)

3.3重复性试验

取批号为20170302的补肺胶囊内容物约1g，精密称定，共6份，制备供试品溶液，依法测定，计算rsd值，结果见表2-3。结果表明，补肺复方中多糖的平均含量为142.8mg/g，rsd为1.67％(n＝6)，结果表明该方法重复性良好。

表2-3重复性试验结果(n＝6)

3.4加样回收率试验

取批号为20170302的补肺胶囊内容物约1g，精密称定，共取6份，按100％的量加入d-无水葡萄糖对照品溶液，依法测定，计算rsd值，结果见表2-4。结果显示，多糖的加样平均回收率为99.65％，rsd值为2.14％(n＝6)，说明该方法准确度良好。

表2-4加样回收率试验结果(n＝6)

3.5稳定性试验

取批号为20170302的补肺胶囊内容物约1g，精密称定，依法制备供试品，按2.3项下方法显色，室温放置，分别在0h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h时间间隔下测定，计算rsd值，结果见表2-5。结果表明，供试品溶液室温放置4h内稳定。

表2-5稳定性试验结果(n＝9)

4样品测定

取本品内容物约1g，精密称定，依法对3批补肺胶囊中的多糖进行含量测定，结果见表2-6。结果表明，上述3批样品测得多糖平均含量为139.61mg/g。从大生产考虑，本品每克多糖的含量，其限度以80％计算，多糖的含量为69.8mg/粒，故本品的限度定为：每粒含多糖(c6h10o5)n计，不得少于55mg。

表2-6补肺胶囊中多糖含量测定结果

【规格】每粒0.5g。

以上所有检测后，全部检测全部通过，则检测合格。