一种泰地罗新中间体有关物质的检测方法与流程

本发明涉及药物分析
技术领域：
，具体涉及一种泰地罗新中间体有关物质的检测方法。
背景技术：
：泰地罗新是一种新型的动物专用大环内酯类广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抗菌活性，对胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌等细菌的敏感性较强。该产品肌内、皮下注射吸收迅速，达峰时间短，消除半衰期长，生物利用度高。另外，泰地罗新在呼吸道感染部位浓度较高，在肺和支气管液中的浓度远超过其在血浆中的浓度。因此泰地罗新可以有效防治胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌等细菌引起的猪呼吸系统疾病，在兽医临床上具有广泛的应用前景。20-哌啶基-23-羟基-5-o-碳霉胺糖基-泰乐内酯作为泰地罗新中间体，其分子式为c36h62o9n2，分子量为666.89，化学名为20-脱氧-23-羟基-5-o-[3,6-二脱氧-3-(二甲氨基)-β-d-吡喃葡萄糖基]-20-1-哌啶基-泰乐内酯，其结构式为：该中间体的分析检测对反应控制和收率提高有着重要的作用，同时也直接影响着终产品的质量，所以建立一种操作简单、稳定有效的分析检测方法对泰地罗新中间体进行分析检测是非常必要的。技术实现要素：本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种泰地罗新中间体有关物质的检测方法。该方法采用hplc方法对泰地罗新中间体有关物质进行检测，并进行了方法学验证。经实验证明，采用该方法泰地罗新中间体与异构体及相邻杂质的分离度高，该方法的专属性强，重现性、精密度线性和准确度良好，可用于泰地罗新中间体有关物质的检测。本发明的技术方案是：一种泰地罗新中间体有关物质检测方法，其特征是，以watersatlantist3为色谱柱，采用hplc方法进行检测。其色谱条件为：色谱柱：watersatlantist3色谱柱(5μm，4.6×250mm)；检测波长为280nm；柱温35℃；流速1.0ml/min；进样量10μl；流动相：流动相a：体积比为0.2％的三氟乙酸和磷酸缓冲液，然后用三乙胺调ph至2.5；流动相b：乙腈；梯度洗脱条件如表1所示。表1梯度洗脱条件时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)08020205050218020308020进一步的，上述检测方法采用峰面积归一法计算泰地罗新中间体有关物质。进一步，其检测方法具体为：1)供试品溶液：取泰地罗新中间体供试品，用稀释液溶解并定量稀释成0.4mg/ml的溶液；2)测定法：精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，按峰面积归一法计算泰地罗新中间体有关物质的含量。上述稀释液优选ph为2.5的磷酸溶液。本发明利用高效液相色谱法对泰地罗新中间体有关物质进行分析检测，按峰面积归一法计算，优点如下：1.流动相使用三氟乙酸和三乙胺，三氟乙酸和三乙胺均为拖尾抑制剂，可以有效的改善峰形，使主峰对称性良好，达到有效分离。2.选择watersatlantist3(5μm，4.6×250mm)色谱柱，该色谱柱对样品成分保留能力强，分离度好，耐低ph及高比例水相流动相，稳定性好。3.该色谱条件下能够准确检测出异构体，且主峰与异构体峰能够达到有效分离。4.通过方法学验证，检测方法准确可行：所述方法简便，专属性、重现性、精密度、线性良好。附图说明图1：实验例1-2中泰地罗新中间体供试品溶液色谱图(色谱柱：watersatlantist3)，按出峰时间先后顺序依次为：杂质1～3、主峰(泰地罗新中间体)、异构体、杂质4～7；图2：实验例1中泰地罗新中间体供试品溶液色谱图(色谱柱：agilentzorbaxsb-c18)，按出峰时间先后顺序依次为：杂质1～3、主峰(泰地罗新中间体)、异构体、杂质4～7；图3：实验例3中泰地罗新中间体线性关系图；图4：实验例5中泰地罗新中间体供试品溶液色谱图；按出峰时间先后顺序依次为：杂质1～3、主峰(泰地罗新中间体)、异构体、杂质4～7。具体实施方式下述实验例用于进一步说明，但不限于本发明。实验例1：色谱柱的选择试验色谱系统：waters2695高效液相色谱仪，2489紫外检测器，检测波长为280nm；色谱柱1：watersatlantist3(5μm，4.6×250mm)；色谱柱2：agilentzorbaxsb-c18(5μm，4.6×250mm)。流动相为：流动相a：0.2％的三氟乙酸和磷酸缓冲液(取2ml98％分析纯磷酸和2ml三氟乙酸加水至1000ml，下同)，用三乙胺调ph至2.5；流动相b：乙腈；梯度洗脱条件如表1；柱温35℃；流速为1.0ml/min，进样量10μl。供试品溶液配制：取泰地罗新中间体供试品适量，精密称定，置容量瓶，加ph2.5的磷酸溶液(取水900ml加98％分析纯磷酸5.71g，用10mol/l氢氧化钠调ph2.5，加水定容至1000ml，下同)溶解制备成0.4mg/ml的泰地罗新中间体供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表1，图谱见附图1和附图2。表2为泰地罗新中间体有关物质检测不同色谱柱分离度对比试验结果结论：以上试验表明，在低ph流动相下使用watersatlantist3和agilentzorbaxsb-c18色谱柱检测泰地罗新中间体有关物质均能得到较好的分离度，方法适用性强。考虑在水相比例高的流动相使用地稳定性，优选耐水性较好地watersatlantist3(5μm，4.6×250mm)色谱柱。实验例2：泰地罗新中间体有关物质检测的专属性试验色谱系统：waters2695高效液相色谱仪，2998光电二极管阵列检测器，watersatlantist3(5μm，4.6×250mm)色谱柱，以体积比为0.2％的三氟乙酸和磷酸缓冲液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，所述的缓冲液用三乙胺调ph至2.5，梯度洗脱条件如表1；检测波长为280nm；柱温35℃；流速为1.0ml/min，进样量10μl。供试品溶液配制：取泰地罗新中间体供试品，制备成0.4mg/ml的泰地罗新中间体供试品溶液，在200～400nm波长范围内进行3d扫描，按峰面积归一法计算有关物质。结果见表3。图谱见附图2。表3为泰地罗新中间体有关物质检测专属性试验结果结论：以上专属性试验表明，泰地罗新中间体及杂质峰纯度角均小于纯度阈值，证明峰是纯的，泰地罗新中间体的测定未受干扰，说明本方法专属性强。实验例3：泰地罗新中间体有关物质检测的仪器精密度和方法精密度试验色谱系统：waters2695高效液相色谱仪，2489紫外检测器，watersatlantist3(5μm，4.6×250mm)色谱柱，以体积比为0.2％的三氟乙酸和磷酸缓冲液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，所述的缓冲液用三乙胺调ph至2.5，梯度洗脱条件如表1；检测波长为280nm；柱温35℃；检测波长280nm，流速为1.0ml/min，进样量10μl。样品配制1：取泰地罗新中间体对照品溶液，重复进样6次，以保留时间、峰面积计算相对标准偏差(rsd)。结果见表4。表4为泰地罗新中间体有关物质检测系统精密度试验结果结论：以上精密度试验结果表明，对照品溶液主峰保留时间的rsd小于1.0％，峰面积的rsd小于1.0％，说明该方法仪器精密度良好。样品配制2：取泰地罗新中间体供试品溶液6份，以泰地罗新中间体有关物质测定结果计算相对标准偏差(rsd)。结果见表5。表5为泰地罗新中间体有关物质检测方法精密度试验结果样品编号123456平均(％)rsd(％)纯度(％)98.9098.8498.8998.8898.8998.9098.880.02结论：以上精密度试验结果表明，供试品有关物质测定的方法精密度rsd小于1.0％，说明该方法的精密度良好。实验例4：泰地罗新中间体的线性试验色谱系统：waters2695高效液相色谱仪，2489紫外检测器，watersatlantist3(5μm4.6×250mm)色谱柱，流动相为以体积比为0.2％的三氟乙酸和磷酸缓冲液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，所述的缓冲液用三乙胺调ph至2.5，梯度洗脱条件如表1；检测波长为280nm；柱温35℃；检测波长280nm，流速为1.0ml/min，进样量10μl。样品配制：取泰地罗新中间体对照品适量，分别制成含泰地罗新中间体不同浓度(0.4mg/l的0.1％、0.5％、2％、5％、10％、50％、80％、90％、100％、110％和120％)的溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品浓度为横坐标，泰地罗新中间体的峰面积为纵坐标，绘制曲线。结果见表6，图谱见附图3。表6为泰地罗新中间体线性试验结果结论：以上结果表明，泰地罗新中间体在0.0001485mg/ml～0.478mg/ml浓度范围内，线性方程为y＝15430497.69x+20645.55，相关系数r＝1.00，线性关系良好。实施例5：实际样品检测液相色谱仪色谱系统：waters2695高效液相色谱仪，2489紫外检测器，watersatlantist3(5μm，4.6×250mm)色谱柱，以体积比为0.2％的三氟乙酸和磷酸缓冲液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，所述的缓冲液用三乙胺调ph至2.5，梯度洗脱条件如表1；检测波长为280nm；柱温35℃；流速为1.0ml/min，进样量10μl。样品配制：取泰地罗新中间体供试品，用ph为2.5的磷酸溶液溶解并定量稀释成0.4mg/ml的溶液。精密量取供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，按峰面积归一法计算泰地罗新中间体有关物质。结果见表7，图谱见附图4。表7为泰地罗新中间体样品检测结果结论：实际样品检测结果表明，主峰与异构体及杂质峰分离度符合要求，可检测出异构体及其他7个杂质，该方法可实现泰地罗新中间体样品有关物质检测。当前第1页1 2 3