一种调制乳粉中维生素K1和维生素K2含量的测定方法与流程

本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种调制乳粉中维生素k1和维生素k2含量的测定方法。

背景技术：

维生素k是一类具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物，参与止血、骨代谢和细胞生长、维持心血管健康等诸多功能，是人体必需的脂溶性维生素。天然存在的维生素根据其侧链形式不同可以分为维生素k1(叶绿醌，vk1)和维生素k2(甲萘醌类，vk2)两种，广泛存在于自然界中，与人体代谢密切相关，也是研究及应用最多的两类化合物。维生素k1和维生素k2都是脂溶性维生素，对光和碱敏感，有耐热性，在生物体内具有不同强度的生物活性。维生素k1为单一化合物，其侧链上只包含有一个异戊烯结构单元，主要来源于绿叶蔬菜(如菠菜、甘蓝、莴苣等)与大豆及其制品。维生素k2由肠道细菌合成，另外纳豆、蛋黄、动物肝脏、发酵品中少量含有，维生素k2是由一条c3上异戊二烯侧链和一个甲基萘醌母环组成的系列化合物，共有14种同系物。维生素k作为一种营养补充剂应用到调制乳粉中，对于维生素k缺乏症有很好的预防作用。

国内对食品中维生素k1的检测研究较多，而对食品中同时检测定生素k1和维生素k2的检测方法相对较少，主要有分光光度法、液相色谱-紫外检测器法、液相色谱-荧光检测法、液相色谱-质谱法等。其中分光光度法分析步骤繁琐、且精密度不高；高效液相色谱-紫外检测法选择性和灵敏度不高，无法满足食品中微痕量组分的检测需求；高效液相色谱-质谱法虽然具有较高的灵敏度，但其仪器复杂、成本较高，而且食品基质复杂，易影响定量准确性。

技术实现要素：

本发明提供了一种调制乳粉中维生素k1和维生素k2含量的测定方法，以解决维生素k1和维生素k2含量同时准确测量的问题。

本发明提供的一种调制乳粉中维生素k1和维生素k2含量的测定方法，包括以下步骤：

(1)采用酶解、皂化的方式提取待测调制乳粉中的维生素k1和维生素k2，得到样品提取液；

(2)采用柱后锌粉还原-高效液相色谱-荧光检测方法，对所述样品提取液中维生素k1和维生素k2进行检测，得到液相色谱数据；

(3)根据维生素k1和维生素k2的液相色谱标准工作曲线，得到待测调制乳粉中维生素k1和维生素k2的含量。

可选地，步骤(1)包括：避光条件下，将待测调制乳粉经脂肪酶酶解，氢氧化钠-乙醇皂化，正己烷萃取，氮吹浓缩，甲醇复溶，有机滤膜过滤，得到样品提取液。

可选地，步骤(2)的色谱条件如下：

色谱柱：c18色谱柱；柱后锌粉还原柱；

流动相：含0.03％冰乙酸、1.5g/l氯化锌和0.5g/l无水乙酸钠的甲醇溶液；

流速1.0ml/min；

进样体积10μl；

柱温35℃。

可选地，步骤(2)中，荧光检测器的激发波长为326nm，发射波长为432nm。

可选地，酶解过程中，待测调制乳粉与脂肪酶的质量比为1：(0.3-0.4)，酶解时间在4h以上。

可选地，皂化过程中，在酶解后样液中加入naoh溶液，涡旋30s后，再加入无水乙醇皂化3-8min，其中，naoh溶液的浓度为2-3mol/l。

可选地，萃取过程中，使用正己烷萃取两次，饱和nacl溶液水洗1次。

可选地，步骤(1)包括：称取2.5g待测调制乳粉于50ml离心管中，加入0.8g的脂肪酶，用10ml温水溶解，涡旋混匀，于37℃±2℃恒温水浴震荡，酶解4h后，得到酶解后样液；在所述酶解后样液中加入1ml2.5mol/l的naoh溶液，涡旋30s后，再加入10ml无水乙醇，混匀皂化5min，得到皂化后样液；在所述皂化后样液中加入10ml正己烷，涡旋提取5min，6000r/min离心3min，移取上层正己烷层于另一个50ml离心管，再加入10ml正己烷萃取一次，合并提取液，用10ml饱和氯化钠溶液水洗有机相后氮气吹干，用甲醇2ml复溶，过0.22μm有机滤膜，得到样品提取液。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明建立了柱后锌粉还原-高效液相色谱-荧光检测方法同时测定调制乳粉中的维生素k1和维生素k2的含量，通过柱后锌粉还原后使维生素k同系物的母核萘醌环发生荧光反应，产生荧光物质，从而提高其在高效液相色谱荧光检测上的灵敏度和选择性。

(2)在待测调制乳粉基质复杂的情况下，将待测调制乳粉经脂肪酶酶解，低浓度氢氧化钠-乙醇皂化，正己烷萃取，充分提取其中的维生素k1和维生素k2，步骤简单，检测效率高。

综上，本方法定性定量准确，灵敏度高，重现性好，能满足调制乳粉中维生素k含量的检测要求，可以对维生素k1和维生素k2的质量控制和市场监管提供技术支持，有利于提高婴幼儿调制乳粉的安全性。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为脂肪酶用量对维生素k1和维生素k2提取回收率的影响图；

图2为酶解时间对维生素k1和维生素k2提取回收率的影响图；

图3为碱量对维生素k1和维生素k2提取回收率的影响图；

图4为锌粉还原后维生素k1和维生素k2的激发和发射光谱图(固定激发波长为243nm)；

图5为锌粉还原后维生素k1和维生素k2的激发和发射光谱图(固定激发波长为326n)；

图6为维生素k1和维生素k2的标准品(a)和样品(b)色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种调制乳粉中维生素k1和维生素k2含量的测定方法，以解决维生素k1和维生素k2含量同时准确测量的问题。下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1仪器与设备

高效液相色谱仪(带荧光检测器，美国waters公司)；xbridgec18色谱柱(3.5μm，4.6×150cm，美国waters公司)；锌粉还原柱(50mm×4.6mm，上海安谱实验科技股份有限公司)；3-18k型冷冻离心机(德国sigma公司)；ab204-s型电子天平(德国mettlertoledo公司)；ms3型旋涡混合器(德国ika公司)；sb-800dtd超声清洗仪(中国宁波新芝生物科技股份有限公司)；sw22恒温水浴振荡器(中国宁波新芝生物科技股份有限公司)；hgc-24型氮吹仪(中国恒奥科技有限公司)；milli-q超纯水系统(美国millipore公司)。

2材料与试剂

甲醇、正己烷、二氯甲烷(色谱纯，德国merck公司)；冰乙酸(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)；无水乙醇、氯化锌、氯化钠、乙酸钠、氢氧化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；碳酸钾(优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；标准物质：维生素k1标准品(德国dr.ehrenstorfer公司)；维生素k2标准品(美国chromadex公司)；脂肪酶(酶活力≥700u/mg，美国sigma公司)；待测调制乳粉购自超市。

3溶液配制

流动相：含0.03％冰乙酸的甲醇溶液1l，加入1.5g氯化锌和0.5g无水乙酸钠，溶解后用0.22μm有机滤膜过滤。

维生素k1、维生素k2标准储备溶液(1.0mg/ml)的配制：分别准确称取维生素k1标准品和维生素k2标准品各10mg于10ml容量瓶中，用正己烷溶解并定容至刻度线，充分摇匀，此溶液保存在棕色试剂瓶中于-18℃冰箱中储存。

维生素k1和维生素k2混合标准溶液：分别吸取一定量的维生素k1和维生素k2标准储备液，氮气吹干后，用甲醇稀释，混匀，配制成质量浓度为100μg/ml的混合标准溶液。将上述混合标准溶液用水逐级稀释成0.0025、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0μg/ml的混合标准工作溶液。现配现用。

4维生素k1和维生素k2含量的测定方法

(1)采用酶解、皂化的方式提取待测调制乳粉中的维生素k1和维生素k2，得到样品提取液。具体地，该步骤(1)包括以下步骤：酶解→皂化→萃取。

如图1所示，为酶解过夜条件下，脂肪酶用量对维生素k1和维生素k2提取回收率的影响图，脂肪酶的添加量为0.8g时，维生素k1和维生素k2的回收率最高，分别为93％和91％。脂肪酶用量不足，萃取时乳化严重，影响提取效率。脂肪酶使用过量会降低维生素k的提取效率，可能的原因是酶的使用量太高时不利于乳粉的溶解，导致回收率下降。如图2所示，为脂肪酶0.8g时，酶解时间对维生素k1和维生素k2提取回收率的影响图，酶解时间过短，酶解不完全，影响后续萃取效率，酶解时间4小时以上提取效率趋于稳定，回收率均达到90％以上。综上所述，酶解过程中，待测调制乳粉与脂肪酶的质量比为1：(0.3-0.4)，酶解时间在4h以上。故本发明提供的测定方法中，可优选待测调制乳粉与脂肪酶的质量比为1：0.32，酶解4小时的酶解条件。

皂化条件包括碱的加入量、皂化温度与皂化时间等，直接影响着检测结果的准确性。经过反复实验，皂化过程中，在酶解后样液中加入naoh溶液，涡旋30s后，再加入无水乙醇皂化3-8min，其中，naoh溶液的浓度为2-3mol/l。除此之外，如图3所示，低浓度的氢氧化钠溶液(2.5mol/l)加入量为1ml时效果较好，维生素k1和维生素k2的回收率分别达到93％和92％。氢氧化钠溶液加入量过少时，皂化不完全，萃取时不容易分层；加入量过多时，维生素k被碱破坏，均会影响萃取效率。碱加入后，要给予一定的反应时间，约30s后再加入乙醇，乙醇可以保护维生素k，还可以起到消泡作用促进分层的作用。故本发明提供的测定方法中，可优选采用2.5mol/l氢氧化钠溶液1ml加入酶解后样液，涡旋30s后，再加入10ml无水乙醇进行皂化。

脂溶性维生素需采用有机溶剂萃取法进行提取，使用有机溶剂正己烷通过液液分配将维生素k萃取出来。维生素k在碱性条件下不稳定，水洗可以把萃取溶剂正己烷中微溶的碱液洗掉。选用饱和氯化钠溶液作为水洗溶液，即可防止液液分配过程的乳化，更有利于分层。本申请对于正己烷的萃取剂量(10ml和15ml)、萃取次数(一次和两次)进行了考察，结果见表1。发现10ml和15ml提取两次的结果差异不大，对维生素k1和维生素k2的提取回收率均达到90％以上，两次萃取对维生素k1和维生素k2的提取更充分。因此，从提高前处理效率和成本的角度，建议提取条件为10ml正己烷萃取两次，10ml饱和氯化钠溶液水洗一次。

表1萃取条件对维生素k1和维生素k2提取回收率的影响

因此，本实施例提供了步骤(1)的一种优选方法：称取2.5g待测调制乳粉于50ml离心管中，加入0.8g的脂肪酶，用10ml温水溶解，涡旋混匀，于37℃±2℃恒温水浴震荡，酶解4h后，得到酶解后样液；在所述酶解后样液中加入1ml2.5mol/l的naoh溶液，涡旋30s后，再加入10ml无水乙醇，混匀皂化5min，得到皂化后样液；在所述皂化后样液中加入10ml正己烷，涡旋提取5min，6000r/min离心3min，移取上层正己烷层于另一个50ml离心管，再加入10ml正己烷萃取一次，合并提取液，用10ml饱和氯化钠溶液水洗有机相后氮气吹干，用甲醇2ml复溶，过0.22μm有机滤膜，得到样品提取液。

(2)采用柱后锌粉还原-高效液相色谱-荧光检测方法，对所述样品提取液中维生素k1和维生素k2进行检测，得到液相色谱数据。

对荧光条件而言，维生素k同系物本身不带荧光，经锌粉还原后产生荧光物质进行检测，当有锌离子存在时，维生素k可以通过锌柱被还原后具有荧光，为了提高被测样品在高效液相色谱仪荧光检测器上的响应值，提高灵敏度，必须选择合适的激发和发射波长。本文采用waters2475荧光检测器的3d(three-dimensional)扫描功能，对锌粉还原后的维生素k1和维生素k2混合标准工作溶液进行扫描，扫描结果见图4和图5。结果表明，固定发射波长为430nm在波长200～420nm范围内测定2种维生素k柱后锌粉还原产物的激发波长，2种维生素k激发波长有2个吸收峰，分别为243nm和326nm，激发波长326nm时维生素k1和维生素k2的响应值约为243nm时的1.5倍。固定激发波长为243nm，在253～610nm范围内测定2种维生素k柱后锌粉还原产物的发射波长，由图4所示的维生素k1和维生素k2的最佳发射波长分别是434nm和430nm；固定激发波长为326nm时，在336～610nm范围内测定发射波长，由图5所示的维生素k1和维生素k2的最佳发射波长分别是434nm和432nm。因此，本发明提供的测定方法中，可优选326nm为最佳激发波长、432nm为最佳发射波长检测，使维生素k1和维生素k2均具有较高的响应值。

对色谱条件而言，维生素k1和维生素k2脂溶性较强，具有弱极性使其在反相色谱柱上保留很强，容易导致峰宽拓展，峰形钝化，影响测定的灵敏度。本实施例采用含0.03％冰乙酸、1.5g/l氯化锌和0.5g/l无水乙酸钠的甲醇溶液为流动相，通过4.6×150mm的xbridgec18色谱柱进行分离，锌粉还原柱还原后荧光检测器检验，由图6可见维生素k1和维生素k2的峰高、峰形较理想，出峰时间最快，缩短了分析检测时间。因此，本发明提供的测定方法中，色谱条件如下：色谱柱：c18色谱柱；柱后锌粉还原柱；流动相：含0.03％冰乙酸、1.5g/l氯化锌和0.5g/l无水乙酸钠的甲醇溶液；流速1.0ml/min；进样体积10μl；柱温35℃。

(3)根据维生素k1和维生素k2的液相色谱标准工作曲线，得到待测调制乳粉中维生素k1和维生素k2的含量。

将浓度分别为0.0025、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2μg/ml的维生素k1和维生素k2混合标准工作液注入液相色谱仪，采用采用柱后锌粉还原-高效液相色谱-荧光检测方法，按上述步骤(2)的色谱条件和荧光条件进行测定，以峰面积(y)为纵坐标，对应的质量浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线，以3倍信噪比s/n确定检出限(lod)。维生素k1和维生素k2线性关系良好，线性相关系数(r²)均在0.999以上，维生素k1的线性回归方程为：y＝237e+006x-2.18e+003，lod为0.1μg/100g；维生素k2的线性回归方程为：y＝1.55e+006x-1.15e+004，lod为0.2μg/100g。

分别以低(0.05mg/kg)、中(0.50mg/kg)、高(1.00mg/kg)三水平向空白样品中进行标准添加试验，每个浓度水平平行测定6次，考察方法的回收率与精密度，结果见表2。方法的平均回收率在80％～95％之间，精密度在0.85％～3.98％之间，表明方法的精密度和准确度良好。

表2方法的回收率和精密度(n＝6)

5实际样品检测

按照上述步骤中的最优条件对市售的10份儿童乳粉和10份孕产妇乳粉进行分析。检测结果显示：其中维生素k1有16份有检出，含量范围在35～70μg/100g，符合标示值及国家标准的规定值，其余4份未添加；维生素k2均为检出，因调制乳粉中植物甲萘醌(维生素k1)为维生素k添加剂，维生素k2作为营养强化剂处于发展阶段，未在市售的调制乳粉中添加。

以上所述的本发明实施方式并不构成对本发明保护范围的限定。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。