一种可拆卸式生物传感器及其制备方法与应用与流程

本发明属于电化学检测技术领域，具体涉及一种可拆卸式生物传感器及其制备方法与应用。

背景技术：

生物传感器是由固定化的生物敏感材料作识别元件(包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质)、适当的理化换能器(如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等等)及信号放大装置构成的分析工具或系统。与传统的液质联用、气质联用等方法相比，由于生物传感器的选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低，可以在复杂的体系中进行在线连续监测，特别是其还具有高度自动化、微型化与集成化的特点，使其在近几十年获得蓬勃而迅速的发展。

然而，现有技术中与电化学检测相关的生物传感器多是采用独立固态三电极体系检测,工作电极多采用独立单电极,因此在一次测试完之后工作电极需要重新打磨、活化处理，不仅大大降低了检测效率及不同批次之间的重现性，而且增加了人力成本和技术难度要求，这些缺陷一定程度上限制了电化学生物传感器的推广与应用。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种可拆卸式生物传感器，包括电极板和可拆卸地设置在所述电极板上的单电极；

在所述电极板上设有样品进口、样品出口以及与所述单电极对应设置的电极插口，在所述电极板内部设有连接所述样品进口和样品出口的样品通路，所述电极插口与所述样品通路交叉设置；

所述单电极为丝网印刷电极，在所述单电极上设有试剂层，所述试剂层至少覆盖所述样品通路经过的位置。

本发明发现，通过上述改进后，每次检测时仅需要更换单电极即可，不仅有利于提高检测效率以及批次之间的重现性，也降低了检测人力成本和电极的处理难度。

作为优选，在一个所述样品进口上连接设有两个以上所述样品通路，在每个所述样品通路上交叉设置有所述电极插口。

通过上述设置，不仅有利于简化批量筛查时的操作，而且可以保证其他变量的一致性，进一步减少环境或操作误差等因素对检测结果准确性的影响。

作为优选，为了匹配不同的检测需求，在对应不同的电极插口时，所述单电极的试剂层相同或不同。

本发明中的所述试剂层包括生物组织、微生物、细胞器、酶、抗体、抗原、核酸中的一种或其混合物。在对啶虫脒进行检测时，优选所述试剂层包括序列如seqidno1、2、3所示的核酸中的一种或其混合物；优选为序列如seqidno1所示的核酸。

在一些实施方案中，所述样品出口的开口朝向远地侧，以便于使待测样品与试剂层进行较长时间的孵育。

作为优选，当所述单电极以试剂层朝向近地侧的方式插入所述电极插口中时，更有利于待测样品与试剂层的有效反应。

作为优选，所述样品通路被分为孵育点通路和其他位置通路，所述孵育点通路处于所述样品通路与所述电极插口的交叉位置；所述其他位置通路的孔径<所述孵育点通路的孔径<所述样品进口的孔径≤所述样品出口的孔径。

作为优选，所述电极板的材质为聚甲基丙烯酸甲酯。

本发明进一步提供所述的可拆卸式生物传感器的制备方法，当所述试剂层包括核酸时，所述单电极的制备过程包括：

a)使用缓冲液将核酸溶解，置于70-90℃下活化处理1-10min后，自然冷却至室温，配置浓度为0.2-10μm的核酸溶液；所述核酸的5'端第一个t碱基上修饰有ho-(ch2)6-s-s-(ch2)6基团；

b)将步骤a)配置的核酸溶液与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐混合，控制三(2-羰基乙基)磷盐酸盐终浓度为0.8-1.2mm，室温下孵育25～35min；

c)将步骤b)配置的核酸溶液涂覆于电极界面，室温孵育1.8～2.5h。

在一些实施方案中，可以在所述试剂层表面涂覆封闭剂如6-巯基-1-己醇(1mm)。

所述缓冲液可以由tris、hclo4、hcl、nahco3、na2co3、naoh、nah2po4，na2hpo4、磷酸、醋酸、醋酸钠中的二种或三种配制而得，优选为20mmtris-hclo4缓冲溶液，ph值为7～9，进一步优选为7.5。

为了除去未与电极结合的核酸，在孵育结束后，可以使用缓冲液对所述电极界面进行淋洗的步骤，在此不做进一步限定。

本发明进一步提供所述的可拆卸式生物传感器在电化学检测领域的应用；优选当所述试剂层包括序列如seqidno1、2、3所示的核酸中的一种或其混合物时，将所述可拆卸式生物传感器应用于啶虫脒的检测。

本发明进一步提供所述的可拆卸式生物传感器的使用方法，包括：

1)将所述单电极插入所述电极插口中，组装得到生物传感器；

2)配置不同浓度的待测物标准液，加入所述样品进口，在孵育结束后进行电化学信号检测，构建待测物浓度与电化学信号强度响应的标准曲线；

3)制备待测样品进行电化学信号检测，获得电化学信号强度，根据测得的电化学信号强度以及所述标准曲线，得到所述待测样品的浓度。

一些方案中，在配置待测物标准液和制备待测样品时，所用的缓冲溶液可以由tris、hclo4、hcl、nahco3、na2co3、naoh、nah2po4，na2hpo4、磷酸、醋酸、醋酸钠中的二种或三种配制而得，优选为20mmtris-hclo4缓冲溶液，ph值为7～9，进一步优选为7.5。

本发明具有以下优点：

本发明中的可拆卸式生物传感器制备简单、可靠性高，应用不同的试剂层时，可以保证其高灵敏性和高选择性，有利于降低检测的成本。此外，其不仅操作简单、响应速度快、样品用量少、无污染，还具有高效、高通量的特点，对完善现有检测技术手段具有重要意义和较好的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中的可拆卸式生物传感器的俯视示意图；

图2为图1a处的放大图；

图3为实施例1中的可拆卸式生物传感器实体图；

图4为实施例2中的修饰seqidno1核酸前、后电化学信号测定结果；图4中，a代表未修饰核酸的丝网印刷电极电化学阻抗谱图；b代表修饰核酸的丝网印刷电极电化学阻抗谱图。

其中，1、电极板；11、样品进口；12、样品出口；13、电极插口；14、样品通路；141、孵育点通路；142、其他位置通路；2、单电极。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

本发明中所使用的序列如seqidno1、2、3所示的核酸在5'端第一个t碱基上修饰有ho-(ch2)6-s-s-(ch2)6基团。

实施例1

本实施例提供一种可拆卸式生物传感器(示意图如图1～2所示，实物图如图3所示)，包括电极板1和可拆卸地设置在所述电极板1上的单电极2；

在所述电极板1上设有开口朝向远地侧的样品进口11、样品出口12，还设有与所述单电极2对应设置的电极插口13，在所述电极板1内部设有连接所述样品进口11和样品出口12的样品通路14，所述电极插口13与所述样品通路14交叉设置；在一个所述样品进口11上连接设有8个所述样品通路14，在每个所述样品通路14上交叉设置有所述电极插口13。所述样品通路14被分为孵育点通路141和其他位置通路142，所述孵育点通路141处于所述样品通路14与所述电极插口13的交叉位置。其中，所述其他位置通路142的孔径为1mm，所述孵育点通路141的孔径为4mm，所述样品进口11的孔径为5mm，所述样品出口12的孔径为5mm。

所述单电极2为丝网印刷电极，在所述单电极2上设有试剂层，所述试剂层至少覆盖所述样品通路14经过的位置。所述试剂层中含有序列如seqidno1所示的核酸。

实施例2

本实施例提供实施例1中可拆卸式生物传感器的制备过程，具体如下：

(1)将固体seqidno1所示核酸粉末用适量tris-hclo4缓冲液(ph＝7.5,20mm)溶解，用漩涡振荡器混匀，并置于80-95℃的水浴锅中加热活化处理3-15min，然后自然冷却至室温，备用。

用tris-hclo4(ph＝7.5,20mm)缓冲溶液配制浓度2μm的seqidno1所示核酸溶液，然后分别加入适量tcep(三(2-羰基乙基)磷盐酸盐)，tcep终浓度为1mm，用漩涡振荡器混匀，然后室温静置30min，得到dna组装液，备用。

(2)将上述步骤(1)中配制的10μl核酸组装液滴涂于电极界面，于室温、无尘环境静置2h，然后用tris-hclo4(ph＝7.5,20mm)缓冲溶液淋洗界面，然后取10μl6-巯基-1-己醇(1mm)滴涂于上述电极界面1h，然后再次用tris-hclo4(ph＝7.5,20mm)缓冲溶液淋洗界面，氮气吹干，得到丝网印刷单电极，备用。

修饰seqidno1核酸前、后电化学信号测定结果如图4所示。图4中，a代表未修饰核酸的丝网印刷电极电化学阻抗谱图；b代表修饰核酸的丝网印刷电极电化学阻抗谱图。

(3)将上述步骤(2)中制备的丝网印刷单电极分别插入电极板对应的电极插口，并采用密封胶密封固定，静置24h，得到可拆卸式生物传感器，如图1和图3所示。

试验例1

使用实施例2中的方法分别制备含有seqidno2、3所示核酸的丝网印刷单电极，并采用同样的方法固定在同一个电极板的不同电极插口中。

将100nm的农药啶虫脒加入样品入口，使其分别与上述单电极作用，室温下孵育30min后，用tris-hclo4(ph＝7.5,20mm)缓冲溶液淋洗界面，然后进行电化学阻抗谱测定。不同核酸传感器测定的电化学阻抗谱信号r见表1。

表1不同核酸传感器测定产生的电化学阻抗谱信号

结果表明，seqidno1所示核酸电化学阻抗谱信号强度最强。

试验例2

用tris-hclo4(ph＝7.5,20mm)配制不同浓度的农药啶虫脒，然后将不同浓度的农药啶虫脒溶液分别加入实施例1中的可拆卸生物传感器，室温下孵育1h后，进行电化学阻抗谱信号测定。不同浓度农药啶虫脒产生的电化学信号r见表2。

表2不同浓度农药啶虫脒产生的电化学阻抗谱信号变化

结果表明，丝网印刷阵列电极电化学核酸传感器与农药啶虫脒作用后产生的电化学阻抗谱信号强度随着农药啶虫脒的浓度升高而增强，二者呈线性相关，根据线性关系计算检测限达到1nm。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京农业质量标准与检测技术研究中心

<120>一种可拆卸式生物传感器及其制备方法与应用

<130>khp191115027.7f

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tttttgcagcggttcttgatcgctgacaccatattatgaaga42

<210>2

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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