一种对叶百部指纹图谱的构建方法及鉴定方法与流程

本发明涉及医药领域，具体地说，涉及一种对叶百部指纹图谱的构建方法及鉴定方法。
背景技术：
：中国药典(2015版)一部中百部项下收载直立百部、对叶百部和蔓生百部，三种均可以按百部入药。药典中仅在性状和鉴别项下，对三种百部药用部位外观上的细微差别和纤维特征做了描述，在实际使用中对使用人员的专业程度要求极高。某些产品如需精确使用某一种百部时，难以准确判断。因此，亟待研发一种特异性鉴定对叶百部的方法，并构建一种清晰、无干扰的、可对对叶百部中多种重要活性成分及比例进行鉴定指纹图谱，作为对该产品进行品质监控和评价的客观依据与基础。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种对叶百部指纹图谱的构建方法及鉴定方法。为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：第一方面，本发明提供了一种对叶百部指纹图谱的构建方法，包括下述步骤：(1)参照物溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加30％甲醇制成每1ml含绿原酸0.025mg的溶液，即得；(2)供试品溶液的制备：取对叶百部样品，加水煎煮，保持微沸，同时浓缩体积至20～30ml，冷却至室温，滤过，用水饱和正丁醇振摇提取多次，合并提取液，蒸干，加30％甲醇适量使溶解，定量转移至5ml量瓶中，加30％甲醇定容，摇匀，即得；(3)色谱条件：采用halor5c18色谱柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为以乙腈-0.4％磷酸溶液为3～40：97～60的混合溶液；流速为0.5～1.5ml/min；检测波长为254～325nm；柱温30～40℃，理论板数按绿原酸峰计算应不低于50000；(4)测定：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪，记录4～30min的色谱峰，得到对叶百部指纹图谱。作为优选，所述构建方法包括下述步骤：(1)参照物溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加30％甲醇制成每1ml含绿原酸0.025mg的溶液，即得；(2)供试品溶液的制备：取1g对叶百部样品，加水煎煮，保持微沸，同时浓缩体积约20～30ml，冷却至室温，滤过，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并提取液，蒸干，加30％甲醇适量使溶解，定量转移至5ml量瓶中，加30％甲醇定容，摇匀，即得；(3)色谱条件：采用halor5c18色谱柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为以乙腈-0.4％磷酸溶液为3～40：97～60的混合溶液；流速1ml/min；检测波长为254～325nm；柱温35℃，理论板数按绿原酸峰计算应不低于50000；(4)测定：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录4～30min的色谱峰，得到对叶百部指纹图谱。进一步地，所述构建方法中，以乙腈为流动相a、0.4％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；平衡时间10分钟；流速每分钟为1.0ml；检测波长为梯度波长；柱温35℃；按照上述规定进行梯度洗脱和梯度波长的检测，可以使所得到的图谱中各色谱峰展示清晰、无重叠、无干扰，利于其作为指纹图谱用于鉴定方面的应用中。进一步地，步骤(2)中用滤纸滤过。第二方面，本发明供一种对叶百部标准指纹图谱，该标准指纹图谱是以中国食品药品检验研究院，批号：121221-201003的对叶百部样品作为供试品，根据前述构建方法制作而成的指纹图谱，通过软件生成代表平均状态的图谱，即得对叶百部标准指纹图谱，如图1所示。所述对叶百部标准指纹图谱包括11个特征峰。第三方面，本发明提供一种对叶百部的鉴定方法，以待测样品为供试品，采用前述构建方法的步骤(1)～步骤(4)得到待测样品的指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件将所述待测样品的指纹图谱与前述对叶百部标准指纹图谱进行分析，相似度大于0.80鉴定为对叶百部。本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本发明的有益效果在于：本发明对参照物溶液的制备、供试品溶液的制备及色谱条件等均进行了优化，使得采用本发明所提供的对叶百部指纹图谱的构建方法能够构建出特征峰清晰、无干扰的对叶百部指纹图谱。利用该构建方法制作的标准指纹图谱可同时显示出11个相互不重叠且无干扰的清晰特征峰。利用本发明提供的标准指纹图谱和鉴定方法，能够将市场上的对叶百部与直立百部、蔓生百部进行有效区分，在药材投料前采用本发明所述方法进行检验，可确保药材品种，保证药物品质。附图说明图1为本发明所述构建方法构建得到的对叶百部标准指纹图谱。图2和图3为本发明实施例3中待测样品的鉴定结果。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1指纹图谱的构建1、参照物溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加30％甲醇制成每1ml含绿原酸0.025mg的溶液，即得；2、供试品溶液的制备：取1g对叶百部样品，加水煎煮，保持微沸，同时浓缩体积约20～30ml，冷却至室温，滤过，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并提取液，蒸干，加30％甲醇适量使溶解，定量转移至5ml量瓶中，加30％甲醇定容，摇匀，即得；3、色谱条件：采用halor5c18色谱柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm，厂家为沃特世)，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a、0.4％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；平衡时间10分钟；流速每分钟为1.0ml；检测波长为梯度波长；柱温35℃；理论板数按绿原酸峰计算应不低于50000；4、测定：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪，记录4～30min的色谱峰，得到对叶百部指纹图谱。实施例2标准指纹图谱的构建以中国食品药品检验研究院，批号：121221-201003的对叶百部样品作为供试品，根据前述构建方法制作而成的指纹图谱，通过软件生成代表平均状态的图谱，即为对叶百部标准指纹图谱(如图1所示)。所述对叶百部标准指纹图谱包括11个特征峰。实施例3标准指纹图谱的验证对从市场上选取的9批百部产品，以及易被用于替代对叶百部的枇杷叶，按实施例1所述方法构建指纹图谱，并利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件将所得样品的指纹图谱与实施例2所得的标准指纹图谱进行分析。编号样品产地来源1百部广西用户邮寄2百部广西王亚亚河北省保定市安国药城北大街137804268483百部云南亳州市众益堂中药材销售有限公司军军来淘014百部广西安国药源商贸有限公司5百部广西用户邮寄6百部广西用户邮寄7百部云南用户邮寄8百部云南用户邮寄9百部湖北用户邮寄10枇杷叶广西用户邮寄软件截图如图2所示，表中数据表明编号1-7与9的样品与标准标准图谱相似度在0.907～0.990之间，鉴定为对叶百部。编号8和10的样品与标准图谱相似度为0.842和0.737，按照本发明鉴定方法判断，此两种药材不是对叶百部。后经薄层色谱方法检测，编号1-7与9的样品同样被鉴定为对叶百部，编号8为直立百部，编号10为枇杷叶。由此可见，本发明所述方法的鉴定正确率为100％。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12