大鼠血浆中氯吡格雷及其代谢物的检测方法与流程

本发明涉及一种血浆中药物代谢的检测方法，具体涉及大鼠血浆中氯吡格雷及其代谢物的检测方法。

背景技术：

心脑血管血栓性疾病是一种常见的疾病。血小板聚集是正常凝血机制中的一个关键环节，血小板的黏附、聚集、释放反应往往容易导致血栓形成。因此，抑制血小板聚集药物在治疗血栓病中发挥着重要作用。氯吡格雷是一种血小板抑制剂，通过可选择性地、不可逆地抑制二磷酸腺苷(adp)与其血小板受体结合及继发的adp介导的gpⅱb/ⅲa复合物的活化，从而抑制血小板聚集。此外，氯吡格雷还能阻断adp释放后引起的血小板活化扩增，从而抑制其他激动剂诱导的血小板聚集。临床适合于治疗动脉粥样硬化、急性冠脉综合征、预防冠脉内支架植入术后再狭窄和血栓性并发症等。

氯吡格雷为前体药，在体内约有85％被水解成无活性的活性巯基氯吡格雷(cca)，而不足15％被代谢为活性的硫醇衍生物(catm)。此前药及其活性硫醇衍生物极不稳定，且浓度极低，在血浆中用常规检测方法很难检测到。

氯吡格雷及其活性巯基代谢物结构式如下：

近年来，药物药代动力学研究在阐释药物药效物质基础及作用机制方面的应用越来越广泛药物药代动力学是利用动力学原理与处理方法，定量地描述药物通过各种途径进入机体后吸收、分布、代谢和排泄等过程的动态变化规律，在阐明药物作用机制及其科学内涵设计及优选给药方案促进新药研发和剂型改进等方面起着重大作用。

现有技术中，研究血浆中氯吡格雷的药代动力学的方法主要是液相色谱-串联质谱法，该法仪器成本较高，未有单纯采用气相色谱法对氯吡格雷及其活性巯基代谢物进行检测的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的旨在提供一种具备准确且能够同时检测大鼠血浆中氯吡格雷及其活性代谢物的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

大鼠血浆中氯吡格雷及其代谢物的检测方法，具体步骤如下：

(1)取大鼠血浆，置于离心管中，加入乙腈沉淀蛋白，涡旋，离心，取上清液置于另一干净的离心管中，加入二氯甲烷-乙醚混合溶液，涡旋，离心；

(2)取c18固相萃取柱，活化，加入上述上清液，甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，复溶，进样；

(3)检测条件：色谱柱：ffap毛细管柱；升温程序：初始温度80℃，以30℃/min的速率升至150℃，再以20℃的速度升至230℃；fid检测器检测。

进一步的，所述沉淀蛋白步骤如下：取大鼠血浆200μl，置于5ml离心管中，加入400μl乙腈，涡旋1min，离心。

进一步的，上述萃取步骤如下：取沉淀蛋白后的上清液，置于另一干净的5ml离心管，加入1000μl二氯甲烷-乙醚混合溶液，涡旋1min，离心。

进一步的，二氯甲烷-乙醚混合溶液中二氯甲烷和乙醚的体积比为1:3。

进一步的，上述两次离心的条件为1000g，3min。

进一步的，活化步骤如下：采用甲醇、水、二氯甲烷依次活化c18固相萃取柱，加入提取后的上清液，采用5ml甲醇洗脱，收集洗脱液。

进一步的，所述浓缩复溶步骤如下：取洗脱液，氮气吹至近干，残留物采用甲醇复溶。

进一步的，色谱条件如下：ffap毛细管柱，30m×0.32mm，0.4μm；升温程序：初始温度80℃，以30℃/min的速率升至150℃，再以20℃的速度升至230℃；进样口温度250℃；载气：氮气，纯度≥99.999％；流速1.0ml/min；进样量1μl；无分流进样。

进一步的，检测条件如下：fid检测器，检测温度250℃，氢气和空气的流速分别为50、400ml/min。

本发明相比现有技术的优点在于：准确度高，灵敏度高，重复性好，加标回收率良好，范围在83.6-93.0％之间。综上可见，本发明适用于血浆中氯吡格雷及其活性巯基代谢物的定量检测，可用于氯吡格雷代谢途径研究。

附图说明

图1.实施例1的气相色谱图，活性巯基代谢物的保留时间为2.90min，氯吡格雷的保留时间为6.31min。

具体实施方式

本发明以下结合具体实施例做进一步描述，但并不限制本发明内容。

主要实验材料，仪器与试剂：

aglient1709f气相色谱仪(安捷伦科技上海有限公司)，带fid检测器；ffap毛细管柱(30m×0.32mm，0.4μm)、c18固相萃取柱(100g/l)为中国科学院大连化学物理研究所提供。

氯吡格雷及其活性巯基代谢物标准品，纯度均≥98％；sd大鼠；其他试剂均为市售分析纯。

实施例1

取大鼠血浆200μl，置于5ml离心管中，加入400μl乙腈，涡旋1min，离心。取沉淀蛋白后的上清液，置于另一干净的5ml离心管，加入1000μl二氯甲烷-乙醚混合溶液(1:3)，涡旋1min，离心。上述两次离心的条件为1000g，3min。采用甲醇、水、二氯甲烷依次活化c18固相萃取柱，加入提取后的上清液，采用5ml甲醇洗脱，收集洗脱液。取洗脱液，氮气吹至近干，残留物采用甲醇复溶。

色谱条件如下：ffap毛细管柱，30m×0.32mm，0.4μm；升温程序：初始温度80℃，以30℃/min的速率升至150℃，再以20℃的速度升至230℃；进样口温度250℃；载气：氮气，纯度≥99.999％；流速1.0ml/min；进样量1μl；无分流进样。

检测条件如下：fid检测器，检测温度250℃，氢气和空气的流速分别为50、400ml/min。

记录两个物质的色谱图，标准曲线法定量。

实施例2

标准曲线绘制

在离心管中分别加入不同体积的氯吡格雷及其活性巯基代谢物对照品溶液，水浴吹干之后，加入空白血浆，配成含不同浓度对照品的血浆样品，采用实施例1的前处理-分析方法进行分析，得到色谱图，记录峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。氯吡格雷及其活性巯基代谢物的回归曲线依次如下：y＝3.854x+0.0874、y＝2.547x+0.2554。

方法的回收率

为了验证方法的回收率，在高中低三个水平分别进行了加样回收实验。加入的物质随后被萃取并定量。高中低三个水平分别进行三个重复。结果表明，在1、10、50μg/ml三个水平中，回收率在83.6-93.0％之间。

以上所述仅为本发明的优选实施例，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的相关技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，其中所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种大鼠血浆中氯吡格雷及其代谢物的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)取大鼠血浆，置于离心管中，加入乙腈沉淀蛋白，涡旋，离心，取上清液置于另一干净的离心管中，加入二氯甲烷-乙醚混合溶液，涡旋，离心；

(2)取c18固相萃取柱，活化，加入上述上清液，甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，复溶，进样；

(3)检测条件：色谱柱：ffap毛细管柱(30m×0.25mm，0.33μm)；初始温度80℃，以30℃/min的速率升至150℃，再以20℃的速度升至230℃；fid检测器检测；fid检测器检测。

2.根据权利要求1所述的一种大鼠血浆中氯吡格雷及其代谢物的检测方法，其特征在于，所述沉淀蛋白步骤如下：取大鼠血浆200μl，置于5ml离心管中，加入400μl乙腈，涡旋1min，离心。

3.根据权利要求2所述的一种大鼠血浆中氯吡格雷及其代谢物的检测方法，其特征在于，上述萃取步骤如下：取沉淀蛋白后的上清液，置于另一干净的5ml离心管，加入1000μl二氯甲烷-乙醚混合溶液，涡旋1min，离心。

4.根据权利要求3所述的一种大鼠血浆中氯吡格雷及其代谢物的检测方法，其特征在于，二氯甲烷-乙醚混合溶液中二氯甲烷和乙醚的体积比为1:3。

5.根据权利要求1所述的一种大鼠血浆中氯吡格雷及其代谢物的检测方法，其特征在于，活化步骤如下：采用甲醇、水、二氯甲烷依次活化c18固相萃取柱，加入提取后的上清液，采用5ml甲醇洗脱，收集洗脱液。

6.根据权利要求1所述的一种大鼠血浆中氯吡格雷及其代谢物的检测方法，其特征在于，所述浓缩复溶步骤如下：取洗脱液，氮气吹至近干，残留物采用甲醇复溶。

7.根据权利要求1所述的一种大鼠血浆中氯吡格雷及其代谢物的检测方法，其特征在于，色谱条件如下：进样口温度250℃；载气：氮气，纯度≥99.999％；流速1.0ml/min；进样量1μl；无分流进样。

8.根据权利要求1所述的一种大鼠血浆中氯吡格雷及其代谢物的检测方法，其特征在于，检测条件如下：fid检测器，检测温度250℃，氢气和空气的流速分别为50、400ml/min。

技术总结
本发明涉及血浆中药物代谢的检测，提供一种大鼠血浆中氯吡格雷及其代谢物的检测方法，其特征在于：采用甲醇沉淀蛋白后，二氯甲烷‑乙醚混合溶液提取，固相萃取柱净化，通过气相色谱法实现血浆中氯吡格雷及其活性巯基代谢物的检测。本方法相比现有技术的优点在于：准确度高，灵敏度高，重复性好，适用于血浆中上述两种物质的同时定量检测，可用于血浆中氯吡格雷代谢途径的研究。

技术研发人员：黄润豪
受保护的技术使用者：黄润豪
技术研发日：2019.11.26
技术公布日：2020.04.14