骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物、筛选方法及用途与流程

本发明属于营养和功能食品领域，涉及骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物，还涉及骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物的筛选方法，以及还涉及骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物的用途。

背景技术：

随着我国进入老龄化社会，居民骨质疏松症的发病率也呈逐年上升的态势。目前，我国骨质疏松患者约9300万，预测到2050年骨质疏松症患者人数将接近2亿。骨质疏松症是一种以骨质减少、骨显微结构发生退化、骨脆性增加为特征的全身性机体骨代谢性疾病。骨质疏松症诱发的骨折增加了病残率和病死率，己成为严重的公众健康问题。临床上，骨质疏松症治疗药物包括利塞膦酸盐、对苯二甲酸、阿仑膦酸、二磷酸盐、唑来膦酸、特立帕肽等，但存在诱发食道炎、恶心、腹痛，甚至罹患生殖系统癌变等副作用，在一定程度上限制了其应用。因此，寻找能够促进骨形成和逆转骨结构损伤的更安全、食物源的天然替代品正受到越来越多的关注。

畜禽骨中含有丰富的胶原蛋白，研究表明补充胶原蛋白肽可以增加骨胶原纤维网架的规则性和牢固性，促进钙盐有序沉积，增加骨强度和骨密度，是一种潜在的抗骨质疏松活性肽的理想来源。目前，关于骨肽抗骨质疏松活性及作用机制已开展一定程度的研究，但仅通过观察骨组织或器官中的一个或几个典型指标来评价其抗骨质疏松活性作用，在研究水平和层次上面存在很大局限性和片面性，不能系统全面地反映和阐释骨肽的作用机制，极大地限制了其开发和利用。

代谢组学是了解复杂疾病历程的系统生物学技术，是关于生物体系受刺激或扰动后其代谢产物(内源代谢物质)种类、数量及其变化规律的科学。生物体中许多生命过程都是发生在小分子代谢物层面，例如细胞之间信号的释放、能量之间的传递、细胞之间通信识别等均是通过小分子代谢物相互调控而完成的，基于代谢组学层面研究机体受外界扰动刺激后的变化，对于揭示其内在机制具有重要的前瞻性意义。其全局、动态理念与骨肽多组分作用于多靶点的整体观研究思路不谋而合。代谢组学基于系统和整体对骨肽的抗骨质疏松活性作用机制进行研究将有助于客观、科学的反映其在干预作用过程中对系统的动态调控及影响，阐明骨肽治疗骨质疏松过程所调控的代谢网络与靶点群。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物。

本发明另有一个目的是提供骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物的筛选方法。

本发明再有一个目的是提供骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物的用途。

为此，本发明提供的技术方案为：

骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物，所述生物标志物包括脂类和类脂分子、有机酸及其衍生物和/或神经递质类物质，所述脂类和类脂分子选自以下物质的任意一种或几种：牛磺酸、花生四烯酸、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、牛磺酸脱氧胆酸、牛磺去氧胆酸和牛磺胆。

优选的是，所述的骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物中，所述有机酸及其衍生物包括：d-erythro-鞘氨醇-1-磷酸和/或l-瓜氨酸。

优选的是，所述的骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物中，所述神经递质类物质为血清素。

一种骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：步骤一、收集样品：收集骨肽处理后动物的骨组织和血清样本，所述骨组织包括左股骨、右股骨和右胫骨；步骤二、利用全自动血清生化分析仪测定血清骨转换标志物含量，分析骨肽对血清骨转换标志物含量的影响；步骤三、利用三点弯曲试验法测定左侧股骨样本的生物力学指标，分析骨肽对股骨机械力学指标的影响；步骤四、利用micro-ct法测定右侧股骨样本的生物力学指标，分析骨肽对股骨形态力学指标的影响；步骤五、利用h&e染色法测定右侧胫骨样本的骨微结构指标，分析骨肽对大鼠胫骨骨微结构的影响；步骤六、基于非靶向代谢组学的方法系统筛选并分析骨肽抗骨质疏松活性作用的差异生物标志物(血清中)及其代谢通路和调控网络。

优选的是，所述的骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物的筛选方法中，所述血清骨转换标志物包括骨钙素、血清骨特异性碱性磷酸酶、血清i型原胶原n-端前肽、血清抗酒石酸酸性磷酸酶、血清i型胶原c-末端肽交联和尿脱氧吡啶啉；所述机械力学指标包括骨的断裂载荷、最大载荷、弹性饶度、弯曲能量和刚性系数；所述形态力学指标包括：骨小梁密度、骨体积分数、骨小梁间距、骨小梁厚度、骨小梁数目、骨皮质厚度。

优选的是，所述的骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物的筛选方法中，所述动物为大鼠。

优选的是，所述的骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物的筛选方法中，步骤一中，骨肽处理动物中，采用骨肽溶液以灌胃方法对动物进行实验，所述骨肽溶液的浓度为依照动物体重以100mg/kg、200mg/kg和500mg/kg的浓度处理。

优选的是，所述的骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物的筛选方法中，步骤一中，骨肽处理动物中，采用代谢笼自动收集动物尿液，所述代谢笼包括带有笼底的笼体本体和代谢物收集部，所述代谢物收集部设置于所述笼体的下方，所述代谢物收集部包括一桶体和一安装于所述桶体第一侧的周壁上端的盖体，所述桶体第二侧周壁上端开设有引流口，所述桶体内设置有一固液分离部，所述固液分离部包括第一端固接于所述桶体周壁上的弧形隔板和多级过滤板，将所述桶体的内部空间分割为第一容置空间和第二容置空间，多级过滤板沿竖直方向设置于所述第二容置空间内，且所述多级过滤板之间首尾顺次相接排列形成折线型导流通道，所述桶体的底壁由其第一侧向第二侧的方向的深度越来越大；所述盖体具有一向上弯折的上沿，于所述盖体连接至所述桶体的第一部分上，所述盖体具有第一通孔，所述弧形隔板的第一端处开设有第二通孔，所述第二通孔处设置有5～20μm孔径的过滤膜，所述多级过滤板沿竖直方向上的过滤孔径越来越小，且均大于所述第二通孔处的过滤膜的孔径。

优选的是，所述的骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物的筛选方法中，所述骨肽包含如下肽段：如seqidno：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59所示的氨基酸序列。

所述的生物标志物在科学研究、骨质疏松症干预治疗或诊断中的用途。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明首次公开了基于血清骨转换标志物、骨生物力学指标和骨形态力学指标系统评价骨肽抗骨质疏松活性作用，并在此基础上利用uplc/q-tof-ms技术筛选了骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物，进一步明确了其代谢通路和调控网络，从整体水平全面、高效、系统评价了骨肽抗骨质疏松活性作用机制。该发明为天然产物(多肽)活性功能评价提供了示范性研究，为系统评价骨肽抗骨质疏松活性作用和开发具有生物活性功能骨肽产品提供了理论支撑。

本发明提供的生物标志物中的一个或几个可以特异性指示牛骨胶原蛋白肽对大鼠骨质疏松改善后的血清代谢指纹图谱的变化，从而反映牛骨肽对去卵巢大鼠骨质疏松的积极作用。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明中骨肽对大鼠血清骨转换标志物含量的影响结果图；

图2为本发明中骨肽对大鼠左股骨生物力学指标的影响结果图；

图3为本发明中骨肽对大鼠右股骨形态力学指标的影响结果图；

图4为本发明中骨肽对大鼠右胫骨微结构(骨组织病理学)的影响结果图；

图5为本发明中骨肽干预后大鼠血清代谢指纹图谱分析图；

图6为本发明骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物筛选方法的流程示意图；

图7为本发明中代谢笼的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

如图1至7所示，本发明提供一种骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物，所述生物标志物包括脂类和类脂分子、有机酸及其衍生物和/或神经递质类物质，所述脂类和类脂分子选自以下物质的任意一种或几种：牛磺酸、花生四烯酸、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、牛磺酸脱氧胆酸、牛磺去氧胆酸和牛磺胆。在上述方案中，作为优选，所述有机酸及其衍生物包括：d-erythro-鞘氨醇-1-磷酸和/或l-瓜氨酸。在上述方案中，作为优选，所述神经递质类物质为血清素。

如图6所示，本发明还提供了一种骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：步骤一、收集样品：收集骨肽处理后动物的骨组织和血清样本，所述骨组织包括左股骨、右股骨和右胫骨；步骤二、利用全自动血清生化分析仪测定血清骨转换标志物含量，分析骨肽对血清骨转换标志物含量的影响；步骤三、利用三点弯曲试验法测定左侧股骨样本的生物力学指标，分析骨肽对股骨机械力学指标的影响；步骤四、利用micro-ct法测定右侧股骨样本的生物力学指标，分析骨肽对股骨形态力学指标的影响；步骤五、利用h&e染色法测定右侧胫骨样本的骨微结构指标，分析骨肽对大鼠胫骨骨微结构的影响；步骤六、基于非靶向代谢组学的方法系统筛选并分析骨肽抗骨质疏松活性作用的差异生物标志物(血清中)及其代谢通路和调控网络。

在上述方案中，作为优选，所述血清骨转换标志物包括：骨钙素、血清骨特异性碱性磷酸酶、血清i型原胶原n-端前肽、血清抗酒石酸酸性磷酸酶、血清i型胶原c-末端肽交联和尿脱氧吡啶啉；所述机械力学指标包括：骨的断裂载荷、最大载荷、弹性饶度、弯曲能量和刚性系数；所述形态力学指标包括：骨小梁密度(骨密度)、骨体积分数(骨体积/总体积)、骨小梁间距、骨小梁厚度、骨小梁数目、骨皮质厚度。在上述方案中，作为优选，所述动物为大鼠。

在上述方案中，作为优选，步骤一中，骨肽处理动物中，采用骨肽溶液以灌胃方法对动物进行实验，所述骨肽溶液的浓度为依照动物体重以100mg/kg、200mg/kg和500mg/kg的浓度处理。

在上述方案中，作为优选，步骤一中，骨肽处理动物中，采用代谢笼自动收集动物尿液，如图7所示，所述代谢笼包括带有笼底的笼体本体和代谢物收集部，所述代谢物收集部设置于所述笼体的下方，所述代谢物收集部包括一桶体1和一安装于所述桶体第一侧的周壁上端的盖体2，所述桶体第二侧周壁上端开设有引流口，所述桶体内设置有一固液分离部，所述固液分离部包括第一端固接于所述桶体周壁上的弧形隔板3和多级过滤板4，将所述桶体的内部空间分割为第一容置空间和第二容置空间，多级过滤板沿竖直方向设置于所述第二容置空间内，且所述多级过滤板之间首尾顺次相接排列形成折线型导流通道，所述桶体的底壁由其第一侧向第二侧的方向的深度越来越大；所述盖体具有一向上弯折的上沿5，于所述盖体连接至所述桶体的第一部分上，所述盖体具有第一通孔，所述弧形隔板的第一端处开设有第二通孔，所述第二通孔处设置有5～20μm孔径的过滤膜，所述多级过滤板沿竖直方向上的过滤孔径越来越小，且均大于所述第二通孔处的过滤膜的孔径。

在上述方案中，作为优选，所述骨肽包含如下肽段：如seqidno：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59所示的氨基酸序列。

骨肽，包含如下肽段：如seqidno：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59所示的氨基酸序列。

生物标志物或骨肽各自分别在科学研究、骨质疏松症干预治疗或诊断中的用途。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面以发明人制备得到的体外具有显著促进成骨细胞增殖活性的牛骨胶原蛋白肽(骨肽)为研究对象进行说明：

一种骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物筛选方法，包含以下主要步骤：步骤一、所需样品的收集：收集骨肽处理后大鼠骨组织(左股骨、右股骨和右胫骨)和血清；步骤二、利用全自动血清生化分析仪测定血清骨转换标志物含量，考查骨肽对大鼠血清骨转换标志物含量的影响；步骤三、利用三点弯曲试验法测定大鼠左侧股骨生物力学指标，考查骨肽对大鼠股骨机械力学指标的影响；步骤四、利用micro-ct法测定大鼠右侧股骨生物力学指标，考查骨肽对大鼠股骨形态力学指标的影响；步骤五、利用h&e染色法测定大鼠右侧胫骨骨微结构指标，考查骨肽对大鼠胫骨骨微结构的影响；步骤六、基于非靶向代谢组学的方法系统筛选并考查骨肽抗骨质疏松活性作用的差异生物标志物(血清中)及其代谢通路和调控网络。

骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物筛选方法中所需大鼠骨组织(左股骨、右股骨和右胫骨)和血清均来自于发明人饲喂的大鼠，具体实现步骤如下：

1.去卵巢大鼠模型构建：将sd大鼠置于清洁级环境中饲养，室温控制在25±2℃，每天12/12明暗交替，自由取食。对大鼠进行一周适应性饲养。随机取8只雌性大鼠，体积浓度为1％的戊巴比妥钠(40mg/kgbw)麻醉大鼠，去除大鼠卵巢附近少许脂肪；其余40只大鼠戊巴比妥钠麻醉行去卵巢手术。手术恢复期4周，观察大鼠手术恢复情况，检测其体重变化。申请人前期制备得到。(据现有文献，尚未见关于骨肽干预去卵巢骨质疏松大鼠代谢指纹图谱变化的研究报道。)

2.动物分组及样品采集：去除卵巢附近脂肪的8只大鼠为假手术组。将行去卵巢手术后的40只大鼠，随机平均分为5组，每组8只，分别为阴性对照组、阳性对照组、低浓度处理组、中浓度处理组和高浓度处理组。将牛骨肽用超纯水(灭菌后)依次按照大鼠体重配置灌胃浓度为100mg/kg、200mg/kg、500mg/kg；阴性对照组灌胃等体积的超纯无菌水(一般灌胃体积为1-2ml/100gbw)；阳性对照组灌胃50μg/kg17β-estradiol(雌二醇，es)。观察大鼠体重变化，每两周测定一次体重。

代谢笼自动收集尿液，每隔4周收集12小时尿液(在保证大鼠体征正常的前提下，尽量多采集)，加入1mmol/l的nan3溶液作为防腐剂，尿液置于4℃，10000×g转速离心机，离心10min，取上清液分装，置-80℃冰箱保存，待测。分别于4周、8周、12周时，对大鼠进行12小时空腹，用体积浓度为1％的戊巴比妥钠(40mg/kgbw)腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血(在保证大鼠体征正常的前提下，尽量多采集)，4℃静置3h，离心处理(5000rpm)10min，取上层血清(收集2ml血液，分离血清后分装4管)，分装于0.5mlep管中，放置于-80℃冰箱保存备用。代谢笼包括带有笼底的笼体本体和代谢物收集部，代谢物收集部设置于笼体的下方，代谢物收集部包括一桶体1和一安装于桶体第一侧的周壁上端的盖体2，桶体第二侧周壁上端开设有引流口，桶体内设置有一固液分离部，固液分离部包括第一端固接于桶体周壁上的弧形隔板3和多级过滤板4，将桶体的内部空间分割为第一容置空间和第二容置空间，多级过滤板沿竖直方向设置于第二容置空间内，且多级过滤板之间首尾顺次相接排列形成折线型导流通道，桶体的底壁由其第一侧向第二侧的方向的深度越来越大；盖体具有一向上弯折的上沿5，于盖体连接至桶体的第一部分上，盖体具有第一通孔，弧形隔板的第一端处开设有第二通孔，第二通孔处设置有5～20μm孔径的过滤膜，多级过滤板沿竖直方向上的过滤孔径越来越小，且均大于第二通孔处的过滤膜的孔径。

大鼠灌胃试验结束后，按照动物福利操作规程处死大鼠，摘取两侧股骨、胫骨，剔除骨组织周围附着的肌肉及筋膜等软组织。右侧胫骨置于磷酸-福尔马林缓冲液中固定24h后，做石蜡切片h&e染色处理，用于大鼠股骨骨形态计量学分析；左侧股骨和右侧股骨用生理盐水浸润并反复冲洗3次后，用医用纱布(生理盐水预先浸润)包裹，再用锡纸包裹完整，放置于-20℃冰箱冷冻保存备用，用于大鼠股骨骨小梁微观结构(显微micro-ct扫描)和骨生物力学指标(三点弯曲试验)的机械强度试验。

骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物筛选方法中利用全自动血清生化分析仪测定血清骨转换标志物含量方法具体实现步骤如下：将大鼠麻醉后，腹腔主动脉采血，后室温静置10min，10000×g转速，高速离心10min，收集上层血清，-80℃冰箱冻存或直接采用全自动血液生化分析仪器测定血清生化指标(试剂盒法测定骨转换标志物)，包括：骨钙素(bonegamma-carboxyglutamicacidcontainingproteins,bgp)、血清骨特异性碱性磷酸酶(bonealkalinephosphatase,b-alp)、血清i型原胶原n-端前肽(procollagentypein-peptide,pinp)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,trap)、血清i型胶原c-末端肽交联(serumc-terminaltelopeptideoftypeicollagen,s-ctx)、尿脱氧吡啶啉(urinarydeoxypyridinoline,dpd)。

骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物筛选方法中利用三点弯曲试验法测定大鼠左侧股骨生物力学指标方法具体实现步骤如下：三点弯曲试验是测定骨生物力学反映骨强度变化的常用方法。取-20℃冷冻保存的大鼠右侧股骨，常温解冻，用生理盐水冲洗、浸润。将骨组织置于lloyd万能材料试验机，参数设置如下：跨距(l)10mm、加载速度2mm/min，通过软件自动记录断裂载荷(fractureload,fd)、最大载荷(又称弹性载荷,elasticload,ed)、弹性饶度(elasticdeformation,en)、弯曲能量(bendingenergy,be)、刚性系数(stiffnesscoefficient,sc)。

骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物筛选方法中micro-ct法测定大鼠右侧股骨生物力学指标方法具体实现步骤如下：采用micro-ct(microcomputedtomography)(inveon型，siemens，德国)测定大鼠股骨显微结构。扫描参数设置为：扫描电压80kv，扫描电流500μa，扫描厚度(分辨率)14.93μm。股骨体积感兴趣区域(regionofinterest,roi)起始于距离骨组织生长板下方1mm处，依次向下画层，选择层厚数100层的骨组织为松质骨感兴趣区域roi进行三维重构获得可视化的3d图像。扫描数据采用inveonresearchworkplace软件(siemens，德国)进行大鼠股骨骨组织形态计量学计算，主要指标包括：骨小梁密度(骨密度)、骨体积分数(骨体积/总体积)、骨小梁间距、骨小梁厚度、骨小梁数目、骨皮质厚度。

骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物筛选方法中利用h&e染色法测定大鼠右侧胫骨骨微结构指标方法具体实现步骤如下：将大鼠右侧胫骨标本用10％福尔马林固定液固定48h，edta脱钙30d，组织石蜡包埋，切成3mm后切片，采用苏木精-伊红(h&e)溶液对胫骨组织染色，并在切片自动数字扫描系统(kf-pro-120，宁波江峰生物信息技术有限公司)下进行胫骨组织学观察。

骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物筛选方法中基于非靶向代谢组学的方法筛选并考查骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物(血清中)及其代谢通路和调控网络方法具体实现步骤如下：

1.动物血清样品前处理方法：质控样本(qualitycontrol，qc)的前处理：准确移取适量样品等比例混合用于制备qc质控样本。qc样本主要用于监测、确证仪器设备的状态及稳定、平衡高效液相色谱串联质谱分析系统，并综合评估整个实验过程中系统的稳定性。取每个血清样本，在4℃缓慢解冻后按照100μl/管进行分装；另外取每个样品100μl，混合后制备成qc样品。4℃环境下每100μl样品中加入400μl预冷的甲醇/乙腈(v/v,1:1)溶液，震荡混匀，-20℃静置10min，14000×g，4℃离心15min，取上清液冻干，置于-80℃冰箱冷冻保存备用。

2.色谱-质谱条件分析：大鼠血清样品经agilent1290infinity型超高效液相色谱系统(ultra-highpressureliquidchromatography,uplc)进行分离(色谱柱为hilic色谱柱)。色谱参数设置如下：柱温，25℃；流速，0.3ml/min；进样量，2μl；流动相a(水+25mm乙酸铵+25mm氨水)，b(乙腈)。

梯度洗脱程序如下：

采用电喷雾离子源(esi)正离子和负离子模式进行检测，样品经uplc分离后用agilent6550质谱仪对大鼠血清样品进行质谱分析。esi参数设置如下：去溶剂气温度，250℃，流速16l/min；锥孔气温度，400℃，流速，12l/min；毛细管电压，3.0kv；fragment:175v；质量范围，50-1200；acquisitionrate，4hz；cycletime,250ms。

血清样本检测完毕后，采用abtripletof6600质谱仪对大鼠血清中检测的代谢物进行鉴定，采集qc样品的一级、二级谱图。所采集获得的数据分别使用自建metdda和lipdda方法进行代谢物的结构鉴定。

esi源参数设置如下：

3.色谱-质谱数据处理方法：将agilent检测的大鼠血清样品样本检测数据一级原始数据经msconventer进行格式转换(mzxml)，采用xcms程序对检出代谢物色谱峰和保留时间进行校正，并对色谱检测到的代谢物峰面积进行准确提取，minfrac参数设置为0.5。将大鼠血清样本检测物质列表与鉴定结果进行匹配，主要使用荷质比m/z和保留时间rt两个参数，按照m/z(±30ppm)，rt(±60s)进行精准匹配。使用svr方法对所提取色谱质谱数据进行标准化和归一化处理，采用simca-p14.1(umetrics，sweden)软件进行多维统计数据分析(pca、opls-da、t检验、变异倍数分析、r语言火山图分析)。

结果及分析

1、利用全自动血清生化分析仪测定血清骨转换标志物含量，考查牛骨肽(ybp)对大鼠血清骨转换标志物含量的影响

血清骨转换标志物(boneturnovermarkers，btms)是机体骨组织自身合成和分解代谢产物，简称骨转换标志物。按照作用类型分为骨吸收标志物和骨形成标志物，其中骨吸收标志物主要反映破骨细胞活性及骨吸收水平情况，骨形成标志物则反映了成骨细胞及骨形成状态情况。这类骨转换标志物的测定对于早期筛查骨质疏松症、评估骨折风险、监测病人服用药物后治疗效果等方面具有很大利用潜力。通常情况，分别以bgp、b-alp和pinp等3个敏感性较高指标反映骨形成状态；以trap、s-ctx和dpd等3个敏感性较高指标反映骨吸收情况来评判机体全身骨代谢的动态变化。

假手术组(sham)、模型组(model)、阳性对照组(es)、低浓度牛骨肽处理组(ybp100)、中浓度牛骨肽处理组(ybp200)和高浓度牛骨肽处理组(ybp500)处理后sd大鼠血清骨转换标志物测定结果见图1。结果表明，模型组大鼠血清骨特异性碱性磷酸酶(b-alp)、骨钙素(bgp)较假手术组显著下降(p<0.05)，提示去卵巢骨质疏松大鼠模型构建成功，这与王蓉等(2017)研究结果一致；与模型组相比，多肽处理组和阳性对照组(es)大鼠血清骨特异性碱性磷酸酶(b-alp)、血清骨钙素(bgp)均显著上升(p<0.05)，不同浓度牛骨肽处理组之间存在一定的浓度效应，ybp200处理组、ybp500处理组、阳性对照组之间血清骨特异性碱性磷酸酶(b-alp)含量无显著差异；血清骨钙素(bgp)在不同浓度多肽组和阳性对照组之间无显著差异(p>0.05)。模型组大鼠血清i型原胶原n-端前肽(pinp)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)、血清i型胶原c-末端肽交联(s-ctx)、尿脱氧吡啶啉(dpd)较假手术组显著下降(p<0.05)。牛骨肽处理组和阳性对照组大鼠(es)血清上述四项生化标志物均呈下降趋势，提示牛骨肽和雌二醇具有相同的改善骨质疏松相关骨转换标志物的作用。值得注意的是，高浓度牛骨肽处理组(ybp500)相较阳性对照组(es)大鼠血清i型原胶原n-端前肽(pinp)、血清i型胶原c-末端肽交联(s-ctx)、尿脱氧吡啶啉(dpd)含量均呈显著下降趋势(p<0.05)，提示牛骨肽在此三项血清生化指标上改善效果均较雌二醇处理组(es)更强。

2、利用三点弯曲试验法测定大鼠左侧股骨生物力学指标，考查牛骨肽对大鼠股骨机械力学指标的影响

分别取假手术组(sham)、阴性对照组(model)、阳性对照组(es)、低浓度牛骨肽处理组(ybp100)、中浓度牛骨肽处理组(ybp200)和高浓度牛骨肽处理组(ybp500)大鼠右侧股骨组织。采用三点弯曲实验法测定不同处理组大鼠股骨组织生物力学指标变化(图2)。结果表明，与假手术组(sham)相比，模型组(model)大鼠股骨弹性载荷、断裂载荷、弯曲能量、刚性系数均呈下降趋势，其中弹性载荷、断裂载荷显著降低(p<0.05)，提示去卵巢骨质疏松大鼠模型构建成功；多肽处理组(ybp100、ybp200、ybp500)和阳性对照组(es)大鼠股骨弹性载荷、断裂载荷呈上升趋势，但不同浓度牛骨肽处理组之间无显著差异(p>0.05)，牛骨肽处理组和雌二醇处理组亦无显著差异(p>0.05)。此外，牛骨肽处理组(ybp100、ybp200、ybp500)和阳性对照组(es)大鼠股骨弯曲能量和刚性系数虽呈现一定的浓度效应，但各组之间均无显著差异。

3、利用micro-ct法测定大鼠右侧股骨生物力学指标，考查牛骨肽对大鼠股骨形态力学指标的影响

采用micro-ct对假手术组(sham)、模型组(model)、阳性对照组(es)、低浓度牛骨肽处理组(ybp100)、中浓度牛骨肽处理组(ybp200)和高浓度牛骨肽处理组(ybp500)处理后sd大鼠股骨骨显微结构进行三维立体重建(图3a)。结果表明，模型组(model)较假手术组(sham)大鼠股骨骨小梁数目和密度显著下降(p<0.05)，提示去卵巢骨质疏松大鼠模型构建成功；经牛骨肽和雌二醇处理后，大鼠骨质疏松情况均得到一定程度的改善，且牛骨肽在改善大鼠骨质疏松方面呈现一定的量效关系，随着多肽浓度的增大，骨质疏松改善效应也逐渐增强。

对假手术组(sham)、模型组(model)、阳性对照组(es)、低浓度牛骨肽处理组(ybp100)、中浓度牛骨肽处理组(ybp200)和高浓度牛骨肽处理组(ybp500)处理后sd大鼠骨密度(tb.bmd)、骨体积分数(骨体积/总体积，bv/tv)、骨小梁厚度(tb.th)、骨小梁数目(tb.n)、骨小梁间距(tb.sp)、骨皮质厚度(cw.t)等参数进行测定(图3b)。结果表明，与假手术组(sham)相比，模型组(model)大鼠股骨tb.bmd、bv/tv、tb.th、tb.n均呈显著下降趋势(p<0.05)，tb.sp呈显著上升趋势(p<0.05)，提示去卵巢骨质疏松大鼠模型构建成功。与模型组相比，牛骨肽和雌二醇处理大鼠骨tb.bmd、bv/tv、tb.th、tb.n均呈上升趋势，但牛骨肽处理组(ybp100、ybp200、ybp500)大鼠之间股骨tb.bmd、tb.th、tb.n无显著差异。

尤其是发现，较高浓度牛骨肽处理组(ybp500)大鼠可显著提高大鼠股骨骨密度(tb.bmd)、bv/tv、tb.n，具有改善大鼠骨质疏松症的潜力。

尤其是发现，h&e染色结果显示干预治疗12周后，模型组大鼠骨小梁结构较假手术组明显缺失。此外，所有牛骨肽和雌二醇处理组干预后大鼠骨小梁面积均显著增加，小梁连接更加紧密，宽度变宽，小梁间隙变小(图4)。总之，牛骨肽可明显改善去卵巢大鼠骨微结构，保持骨量，尤其是高浓度牛骨肽处理组。

4、基于非靶向代谢组学的方法系统筛选并考查牛骨肽抗骨质疏松活性作用的差异生物标志物(血清中)代谢通路及调控网络分析

实验质控数据分析：采用质控qc样本谱图比对和pca分析两种方法，对实验仪器的系统稳定性进行综合评价。将8次qc样本uhplc-q-tofms总离子流图进行色谱峰重叠比较分析。结果表明，8次检测物质的色谱峰的响应强度(responsevalue)和保留时间(retentiontime)基本一致，提示整个实验过程中仪器设备状态稳定、方法误差引起的变异程度较小，可满足本实验需求。

采用xcms软件对代谢物离子峰进行提取，离子峰数目分别为：9676(正离子)和5584(负离子)。经pareto-scaling后对所有不同处理组大鼠血清和qc样本提取得到的峰进行主成分分析，结果表明，在正、负离子扫描模式下，8个质控样本均可以紧密聚集在一定的区域，提示本实验仪器设备条件重复性、稳定性较好。

总体样本hotellingst2的分析通常用来检测是否有离群样本存在，结果表明，本实验样本负离子模式下全部在99％置信区间内，提示实验仪器状态稳定、数据真实可靠。

对qc质控样本进行皮尔森(pearson)相关性分析，图中横、纵坐标分别代表强度值的对数值，一般相关系数大于0.9表明相关性较好。结果表明，本实验中样品相关系数均大于0.9，满足后续试验分析测定。

对qc样本进行mcc(maleimide-cyclohexane-1-carboxylate，马来酰亚胺基-环己烷-1-羧化物)分析，基于所有x变量的组合产生的一个多变量控制图，可以实时显示测量的实验数据并监测实验过程中发生的变化。mcc中的每个点表示一个qc样本，通常情况下，大多数点都在控制范围内并在x轴上下波动。一般在正、负三个标准差范围内是合理的，仪器波动性较小。结果表明，实验条件较为稳定，监测的数据可以用于后续分析。

5、采用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物

主成分分析(principalcomponentanalysis，pca)是一种非监督的数据统计分析方法，通过将鉴定到的所有代谢物重新进行线性排列组合，从而形成一组新的综合统计变量，并通过从中选取几个综合变量，使它们尽可能充分地反映原有变量的纵横信息，近而达到降低维度、精准分析的目的。通常情况下，对不同处理组大鼠血清代谢物进行主成分分析后，还能从总体上反映大鼠血清样本组间和组内的变异程度。综上，pca可以根据不同处理组大鼠血清代谢指纹图谱的差异将样本进行精准分类，进而实现对海量数据的快速挖掘。对假手术组(sham)、模型组(model)、阳性对照组(es)、低浓度牛骨肽处理组(ybp100)、中浓度牛骨肽处理组(ybp200)和高浓度牛骨肽处理组(ybp500)处理后sd大鼠血清样本代谢物进行pca处理(图5)。结果表明，假手术组(sham)、模型组(model)、阳性对照组(es)大鼠血清样本代谢差异较大，代谢物分布呈现一定的规律性，除极个别样品外，pca可将上述6组不同处理大鼠血清代谢物进行分类；不同浓度牛骨肽处理组之间重叠区域较多，表明其代谢指纹图谱存在一定的交叉，值得注意的是，随着牛骨肽作用浓度的增大，代谢物有向雌二醇阳性对照组和假手术组代谢指纹图谱靠拢的趋势，因此，本文以高浓度牛骨肽(ybp500)处理组为研究对象，系统分析其抗骨质疏松活性作用机制。

基于以上分析，对高浓度牛骨肽(ybp500)处理组和模型组(model)大鼠血清代谢物进行主成分分析(表1和图5)。第一主成分pc1(t[1])表示pca模型的横坐标表示用，第二主成分pc2用t[2]表示纵坐标表示，主成分模型参数主要参考r2x的值，r2x越接近1表明模型越稳定可靠。对浓度牛骨肽(ybp500)处理组和模型组(model)大鼠血清进行pca分析，pca得分图见图5。其中，a代表模型中主成分个数；r2x代表模型对x变量的解释率；q2代表主成分模型的预测能力。

表1

正交偏最小二乘判别分析(orthogonalprojectionstolatentstructuresdiscriminantanalysis，opls-da)是一种有监督的数据统计判别分析方法。该方法可有效运用偏最小二乘回归方法建立大鼠血清代谢物表达量与样品分组和类别(sham、model、es、ybp100、ybp200、ybp500)两两之间的关系模型，从而快速实现对样品组别和类别的精准预测，可有效滤除与分类信息不相关的噪音，提高了对模型的解析能力和数据分类的可靠性和有效性。建立高浓度牛骨肽(ybp500)处理组和模型组(model)大鼠血清样本的opls-da模型(表2和图5)，在opls-da得分图上，有两种主成分，即预测主成分(唯一性，t[1])和正交主成分(可以有多个)。opls-da模型往往会将组间差异最大化的反映在预测主成分t[1]上，所以从横坐标(t[1])上能直接区分组间变异，而在纵坐标(正交主成分)上则反映了组内的变异。

表2

对建立高浓度牛骨肽(ybp500)处理组和模型组(model)大鼠血清样本的opls-da模型进行验证(多次循环交互)，模型评价参数(r2y，q2)见表9.2，r2y值和q2值越接近1，说明所构建的模型越真实可靠，一般来讲，q2大于0.5即提示所建模型稳定可靠，0.3＜q2≤0.5说明模型稳定性较好，q2＜0.3说明模型可靠性较低。其中，a表示主成分数；r2x表示所建模型对x变量的解释率；r2y表示所建模型对y变量的解释率；q2表示模型预测能力。

根据opls-da模型分析得到的变量权重值(variableimportancefortheprojection,vip)来衡量和评价代谢物的表达模式对高浓度牛骨肽(ybp500)处理组和模型组(model)大鼠血清样本分类判别的影响强弱和解释能力。本研究以vip大于1为筛选标准，初步筛选出高浓度牛骨肽处理组(ybp500)和模型组(model)大鼠血清样本间的差异代谢物，进而基于单变量统计分析结果对各代谢物之间(组间)是否存在显著性差异进行合理化验证。一般情况下，将同时满足vip值大于1和单变量统计分析p-value小于0.05的代谢物认同为显著性差异的潜在生物标志物；将vip值大于1但p-value介于0.05和0.1之间的化合物认同为差异代谢物。

对所鉴定筛选出的41种具有显著差异的代谢物进行数据库检索比对，41种潜在生物标志物共包含14种有机酸及其衍生物(异亮氨酸-丙氨酸、l-蛋氨酸、l-哌啶酸、l-缬氨酸、l-酪氨酸、n2-乙酰-l-鸟氨酸、ng,ng-二甲基-l-精氨酸、脯氨酸-丙氨酸、脯氨酸-丝氨酸、ergothioneine、l-瓜氨酸、亮氨酸-甘氨酸、二氨基庚二酸、芥酸酰胺、dl-吲哚-3-乳酸)、11种脂类和类脂分子(牛磺酸、牛磺酸脱氧胆酸、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、牛磺胆、(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、taurochenodeoxycholate、tauroursodeoxycholicacid、thioetheramide-pc、d-erythro-鞘氨醇-1-磷酸、花生四烯酸和1-棕榈酰-2-羟基-甘油-3-磷酸乙醇胺)、3种有机氮化合物(左旋肉碱、二乙醇胺、羟基喹啉)、3种有机杂环类化合物(胆红素、血清素、4-吡哆酸)、4种糖类及糖类多酮类物质(d-果糖、d-塔格糖、大豆苷元、4-羟基肉桂酸)、2种苯环类物质(维生素l1、多巴胺)、1种有机氧化物、核苷、核苷酸和类似物(5-甲基胞苷)和2种维生素类(l-抗坏血酸、泛酸)。

6、潜在生物标志物生物信息学分析

为了更准确、更客观地评价候选生物标志物的合理性，全面直观地反映不同处理组样本之间的关系以及代谢物在不同样本中的表达模式的差异性，本研究对所定性高浓度牛骨肽(ybp500)处理组和模型组(model)大鼠血清样本中差异代谢物表达量进行了层次聚类(hierarchicalclustering)分析。一般情况下，当筛选出的潜在生物标志物种类、含量、数目合理且准确时，同组样本才能够通过聚类出现在同一簇(cluster)中。出现在同一簇内的代谢物往往具有相同或者相似的表达模式，他们在代谢过程中可能处于相同或者较为接近的反应进程中。通过相关性分析可以帮助衡量显著性差异代谢物之间的相关密切程度，进一步了解高浓度牛骨肽(ybp500)处理组和模型组(model)大鼠状态变化过程中代谢物之间的相互关系。kegg(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)是代谢调控通路研究最常用的数据库之一，通过产生特定的图形语言来表达和描述海量的代谢途径以及各种代谢途径之间的相互关联关系。kegg代谢通路富集分析是以kegg通路为基本单位，以该物种或亲缘关系较接近的物种所参与的代谢通路为主要背景，通过fisher精确检验来分析计算差异代谢物所在各个通路代谢物富集程度的显著性水平，从而快速筛选出受到影响程度最大(显著)的代谢和信号转导途径的数据统计方法。

通常情况下，kegg通路富集分析图中条带(不同信号通路)颜色代表显著性差异的p值，p值越小(p<<0.05)，说明该代谢途径或通路富集程度越显著，越具有统计学意义；相较而言，kegg通路富集分析中横坐标值得大小代表了所包含的差异表达代谢物数目，该数值大小直接反映了实验设计中不同处理组对各个通路的影响程度的大小。综上，在对代谢通路进行kegg通路富集分析时，需同时考虑上述两个因素(p值和差异物个数)选择较为感兴趣的代谢或信号转导途径和对这些途径影响较为显著的差异表达代谢物进行后续的生物信息学分析、生物学试验验证或相关作用机制研究更有前瞻性意义。本研究中，通过fisher精确检验方法对高浓度牛骨肽(ybp500)和模型组(model)大鼠血清样本差异表达代谢物进行了kegg通路富集分析。结果表明，高浓度牛骨肽(ybp500)处理去卵巢骨质疏松大鼠后centralcarbonmetabolismincancer、proteindigestionandabsorption、aminoacyl-trnabiosynthesis、abctransporters、mineralabsorption、bilesecretion等重要通路发生了显著变化。

7、潜在生物标志物参与代谢通路及其调控网络分析

牛骨肽处理组与模型组(ybp500vs.model)和假手术与模型组(shamvs.model)共有的差异代谢物包括芥酸酰胺、(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、异亮氨酸-丙氨酸(ila-ala)、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、dl-吲哚-3-乳酸、4-吡哆酸、丙酮醛、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、泛酸、d-甘露糖、d-塔格糖和d-果糖等12种代谢物。其中，(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和异亮氨酸-丙氨酸(ila-ala)等4种代谢物在牛骨肽处理组和假手术中变化趋势一致，均呈上调趋势，4-吡哆酸、d-甘露糖、丙酮醛、d-塔格糖和d-果糖等5种代谢物均呈下调趋势，提示1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、异亮氨酸-丙氨酸(ila-ala)、4-吡哆酸、d-甘露糖、丙酮醛、d-塔格糖和d-果糖等9种代谢物可能为潜在生物标志物。雌二醇处理组与模型组(esvs.model)和假手术组与模型组(shamvs.model)共有的差异代谢物包括1-硬脂酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱、1-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-o-(顺式-9-十八碳烯基)-2-o-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、l-棕榈酰、l-焦谷氨酸、异亮氨酸-精氨酸、1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和泛酸等8种代谢物，且上述8种代谢物在雌二醇(es)处理组与和假手术组(sham)中变化趋势呈现高度一致性，其中，1-硬脂酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱、1-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-o-(顺式-9-十八碳烯基)-2-o-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、l-棕榈酰、1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和泛酸等6种代谢物均呈上调趋势，异亮氨酸-精氨酸和l-焦谷氨酸均呈下调趋势。此外，本研究还发现高浓度牛骨肽处理组与模型组(ybp500vs.model)和雌二醇与模型组(esvs.model)筛查出l-瓜氨酸、泛酸和花生四烯酸等3种共有差异代谢物，且三者在上述两组处理中变化趋势一致，提示二者可能在干预大鼠骨质疏松骨代谢方面可能具有相似的作用机制。综上，共筛选8种脂类和类脂分子(牛磺酸、花生四烯酸、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、牛磺酸脱氧胆酸、taurochenodeoxycholate、牛磺胆)，2种有机酸及其衍生物(d-erythro-鞘氨醇-1-磷酸、l-瓜氨酸)，以及1种神经递质类物质(血清素)等11种代谢物为骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物。

通过对上述差异代谢物进行信号通路富集分析，牛骨肽干预去卵巢大鼠骨质疏松过程与membranetransport(abctransports)、消化系统(proteindigestionandabsorption、mineralabsorption)、翻译(aminoacyl-trnabiosynthesis)、氨基酸代谢(arginineandprolinemetabolism、valine,leucineandisoleucinedegradation)和脂质代谢(bilesecretion、primarybileacidbiosynthesis、taurineandhypotaurinemetabolism)，且与细胞免疫、神经系统、碳代谢及内分泌系统等通路均有一定关联性。机体骨架是代谢非常活跃的组织器官，该部分通过不断清除旧骨、合成新骨来维持骨量的恒定。在机体骨重塑过程中，脂质代谢起着至关重要的作用。已有大量证据表明机体骨量与骨髓脂肪含量之间具有密切关系，骨脂质代谢在机体骨代谢领域研究比重日益增加。脂肪酸、磷脂及内源性脂类代谢物已被证明与成骨细胞增殖、分化及骨矿化的关键信号传导相关。本发明基于uplc/q-tof-ms联合非靶向代谢组学法筛选了骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物，进一步明确了其代谢通路和调控网络，从整体水平全面、高效、系统评价了骨肽抗骨质疏松活性作用机制。为骨肽活性功能评价及抗骨质疏松活性的生物标志物筛选提供了示范性研究，为开发具有生物活性功能骨肽产品提供了理论支撑。

深入分析不同处理组干预后去卵巢骨质疏松大鼠血清代谢模式的变化，有助于进一步揭示牛骨肽干预后代谢重组机制。该方法鉴定出了8种脂类和类脂分子，2种有机酸及其衍生物，以及1种神经递质类物质等11个显著上调或下调的内源性代谢物作为牛骨肽干预治疗的潜在生物标志物。由此可见，作为糖、氨基酸、脂质和胆汁酸代谢的关键器官，骨质疏松大鼠体内与这些营养素相关的肝脏代谢通路发生了广泛的改变。牛骨肽干预组可以显著逆转骨质疏松大鼠代谢异常，支持了牛骨肽对去卵巢大鼠治疗作用。kegg通路分析表明，去卵巢手术可显著改变大鼠内源性代谢产物，诱发代谢紊乱，牛骨肽主要通过干预氨基酸代谢和脂质代谢(尤其是不饱和脂肪酸代谢)来平衡代谢紊乱，相关通路调控网络见图6。综上，所筛选的11个骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物可以较好地预测和评价多肽的抗骨质疏松活性作用，该发明为天然产物(多肽)活性功能评价提供了示范性研究，为系统评价骨肽抗骨质疏松活性作用和开发具有生物活性功能骨肽产品提供了理论支撑。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的骨肽干预治疗骨质疏松中生物标志物、筛选方法及用途中的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

如上所述，为阐明骨肽对骨质疏松症的保护或恢复作用机制，本发明基于全自动血清生化分析、三点弯曲试验法、micro-ct、h&e染色和uplc/q-tof-ms联合非靶向代谢组学系统评价骨肽抗骨质疏松活性作用，利用血清代谢指纹图谱进行判别分析鉴别并筛选出显著差异的代谢物(生物标志物)，为系统评价骨肽抗骨质疏松活性作用提供基础数据，为开发具有生物活性功能骨肽产品提供理论支撑。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

<110>中国农业科学院农产品加工研究所

<120>骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物、筛选方法及用途

<130>2018

<160>59

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>24

<212>prt

<213>bovine

<400>1

glylysserglyaspargglygluthrglyproalaglyproalagly

151015

proileglyprovalglyalaarg

20

<210>2

<211>23

<212>prt

<213>bovine

<400>2

glylysserglyaspargglygluthrglyproalaglyproalagly

151015

proileglyprovalglyala

20

<210>3

<211>21

<212>prt

<213>bovine

<400>3

serglyaspargglygluthrglyproalaglyproalaglyproile

151015

glyprovalglyala

20

<210>4

<211>20

<212>prt

<213>bovine

<400>4

glylysserglyaspargglygluthrglyproalaglyproalagly

151015

proileglypro

20

<210>5

<211>21

<212>prt

<213>bovine

<400>5

glylysserglyaspargglygluthrglyproalaglyproalagly

151015

proileglyproval

20

<210>6

<211>14

<212>prt

<213>bovine

<400>6

glyalaaspglyalaproglylysaspglyvalargglyleu

1510

<210>7

<211>20

<212>prt

<213>bovine

<400>7

glyaspargglygluthrglyproalaglyproalaglyproilegly

151015

provalglyala

20

<210>8

<211>19

<212>prt

<213>bovine

<400>8

serglyaspargglygluthrglyproalaglyproalaglyproile

151015

glyproval

<210>9

<211>20

<212>prt

<213>bovine

<400>9

lysserglyaspargglygluthrglyproalaglyproalaglypro

151015

ileglyproval

20

<210>10

<211>18

<212>prt

<213>bovine

<400>10

glyaspargglygluthrglyproalaglyproalaglyproilegly

151015

proval

<210>11

<211>18

<212>prt

<213>人工合成

<400>11

glyproproglyproalaglyproalaglygluargglygluglngly

151015

proala

<210>12

<211>19

<212>prt

<213>人工合成

<400>12

glyalaproglyalaaspglyproalaglyalaproglythrprogly

151015

proglngly

<210>13

<211>17

<212>prt

<213>人工合成

<400>13

aspargglygluthrglyproalaglyproalaglyproileglypro

151015

val

<210>14

<211>16

<212>prt

<213>bovine

<400>14

serthrglyileservalproglyprometglyproserglyproarg

151015

<210>15

<211>18

<212>prt

<213>bovine

<400>15

argglygluthrglyproalaglyproalaglyproileglyproval

151015

glyala

<210>16

<211>15

<212>prt

<213>bovine

<400>16

thrglyproalaglyproalaglyproileglyprovalglyala

151015

<210>17

<211>16

<212>prt

<213>bovine

<400>17

argglygluthrglyproalaglyproalaglyproileglyproval

151015

<210>18

<211>12

<212>prt

<213>bovine

<400>18

glygluargglypheproglyleuproglyproser

1510

<210>19

<211>14

<212>prt

<213>bovine

<400>19

glyileservalproglyprometglyproserglyproarg

1510

<210>20

<211>13

<212>prt

<213>bovine

<400>20

ileservalproglyprometglyproserglyproarg

1510

<210>21

<211>13

<212>prt

<213>bovine

<400>21

thrglyproalaglyproalaglyproileglyproval

1510

<210>22

<211>12

<212>prt

<213>bovine

<400>22

servalproglyprometglyproserglyproarg

1510

<210>23

<211>11

<212>prt

<213>bovine

<400>23

glyileservalproglyprometglyproser

1510

<210>24

<211>12

<212>prt

<213>bovine

<400>24

glyproalaglyproalaglyproileglyproval

1510

<210>25

<211>12

<212>prt

<213>bovine

<400>25

glyproalaglyproproglyproileglyasnval

1510

<210>26

<211>9

<212>prt

<213>bovine

<400>26

glyproalaglyproileglyproval

15

<210>27

<211>7

<212>prt

<213>bovine

<400>27

ileservalproglypromet

15

<210>28

<211>12

<212>prt

<213>bovine

<400>28

glyleuproglyproproglyalaproglyprogln

1510

<210>29

<211>20

<212>prt

<213>bovine

<400>29

leualaglyhishisglyaspglnglyalaproglyalavalglypro

151015

alaglyproarg

20

<210>30

<211>19

<212>prt

<213>bovine

<400>30

glyproalaglyproserglyproalaglylysaspglyargilegly

151015

glnprogly

<210>31

<211>17

<212>prt

<213>bovine

<400>31

leualaglyhishisglyaspglnglyalaproglyalavalglypro

151015

ala

<210>32

<211>20

<212>prt

<213>bovine

<400>32

glyproalaglyproserglyproalaglylysaspglyargilegly

151015

glnproglyala

20

<210>33

<211>20

<212>prt

<213>bovine

<400>33

glyproalaglyproserglyproalaglylysaspglyargilegly

151015

glnproglyala

20

<210>34

<211>16

<212>prt

<213>bovine

<400>34

glyproserglyproalaglylysaspglyargileglyglnprogly

151015

<210>35

<211>9

<212>prt

<213>bovine

<400>35

glyglulysglygluthrglyleuarg

15

<210>36

<211>13

<212>prt

<213>bovine

<400>36

glyproalaglylysaspglyargileglyglnprogly

1510

<210>37

<211>13

<212>prt

<213>bovine

<400>37

leuargglyproargglyaspglnglyprovalglyarg

1510

<210>38

<211>8

<212>prt

<213>bovine

<400>38

glypheaspglyaspphetyrarg

15

<210>39

<211>14

<212>prt

<213>bovine

<400>39

alaargglyseraspglyservalglyprovalglyproala

1510

<210>40

<211>15

<212>prt

<213>bovine

<400>40

glyaspglnglyalaproglyalavalglyproalaglyproarg

151015

<210>41

<211>15

<212>prt

<213>bovine

<400>41

glyalaargglyseraspglyservalglyprovalglyproala

151015

<210>42

<211>13

<212>prt

<213>bovine

<400>42

argglyseraspglyservalglyprovalglyproala

1510

<210>43

<211>14

<212>prt

<213>bovine

<400>43

alavalglyproalaglyproargglyproalaglyproser

1510

<210>44

<211>12

<212>prt

<213>bovine

<400>44

glyseraspglyservalglyprovalglyproala

1510

<210>45

<211>12

<212>prt

<213>bovine

<400>45

glyalaalaglyprothrglyproileglyserarg

1510

<210>46

<211>15

<212>prt

<213>bovine

<400>46

glyseraspglyservalglyprovalglyproalaglyproile

151015

<210>47

<211>11

<212>prt

<213>bovine

<400>47

alaalaglyprothrglyproileglyserarg

1510

<210>48

<211>12

<212>prt

<213>bovine

<400>48

glyileaspglyargproglyproileglyproala

1510

<210>49

<211>9

<212>prt

<213>bovine

<400>49

glyprovalglyprovalglylyshis

15

<210>50

<211>9

<212>prt

<213>bovine

<400>50

glyproserglyleuproglygluarg

15

<210>51

<211>10

<212>prt

<213>bovine

<400>51

alaglyprothrglyproileglyserarg

1510

<210>52

<211>9

<212>prt

<213>bovine

<400>52

glyprothrglyproileglyserarg

15

<210>53

<211>13

<212>prt

<213>bovine

<400>53

valglyproalaglyproargglyproalaglyproser

1510

<210>54

<211>10

<212>prt

<213>bovine

<400>54

valglyproargglyproserglyprogln

1510

<210>55

<211>12

<212>prt

<213>bovine

<400>55

glyproargglyproalaglyproserglyproala

1510

<210>56

<211>12

<212>prt

<213>bovine

<400>56

valglyproalaglyproargglyproalaglypro

1510

<210>57

<211>12

<212>prt

<213>bovine

<400>57

glyproalaglyproargglyproalaglyproser

1510

<210>58

<211>10

<212>prt

<213>bovine

<400>58

valglyproalaglyproargglyproala

1510

<210>59

<211>9

<212>prt

<213>bovine

<400>59

glyproalaglyproalaglyproarg

15