一种检测塞来昔布中芳胺类及芳香肼基因毒性杂质的方法与流程

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种检测塞来昔布中苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、磺胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f的lc-ms/ms方法。
背景技术：
：塞来昔布（celecoxib），即4-[5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-1-基]苯磺酰胺，其分子式为c17h14f3n3o2s，分子量为381.38，，其结构式：塞来昔布（celecoxib）是美国西尔公司开发的第一个特异性环氧合酶-2（cox-2）抑制剂，用于骨关节炎和类风湿性关节炎的治疗，是目前全球处方量最大的非甾体抗炎镇痛药。在塞来昔布合成起始物料对氨基苯磺酰胺中，涉及多种具有警示结构的潜在基因毒性杂质。结合生产工艺，以及文献所述苯胺，乙酰氨基苯结构为警示结构，我们对其中涉及的含有警示结构的基因毒性杂质进行分析。对氨基苯磺酰胺合成路线中涉及的基因毒性杂质有如下四个：苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酸。在塞来昔布合成过程中，涉及到合成中间体对肼基苯磺酰胺和合成工艺杂质杂质f，需对其中对肼基苯磺酰胺和杂质f毒性杂质进行研究。各基因毒杂质在塞来昔布合成工艺流程图中的分布见说明书附图1。苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酸、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f共六个基因毒杂质，可以按结构分为三类：苯胺类（苯胺和对氨基苯磺酸）、乙酰苯胺类（乙酰苯胺和对乙酰氨基苯磺酰胺）和苯肼类（对肼基苯磺酰胺盐酸盐、塞来昔布杂质f(对甲苯腙基苯磺酰胺)）。塞来昔布最大日暴露量可达600mg，欧洲药物管理局发布了关于基因毒性杂质（gti）的最大摄取量为1.5μg/d，各基因毒性杂质ttc值按1.5μg/d计算，总含量不得超过2.5ppm。由于基因毒性杂质含量低，限度要求严格，故本研究采用hplc-ms/ms法，对塞来昔布及其关键中间体物料中的潜在基因毒性杂质，进行专属和灵敏的检查。所以，本试验研究选择高灵敏度的液相色谱色谱分离-质谱检测的技术对塞来昔布中苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、磺胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f进行直接限度检查，可以更好的控制塞来昔布原料药的质量，更好地对塞来昔布原料药中可能存在的苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、磺胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f进行检测。技术实现要素：本发明的目的是建立一个塞来昔布中苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、磺胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f残留检测的lc-ms/ms方法，该方法为塞来昔布的潜在基因毒性杂质含量的测定提供了一种准确的、高效的检测方法。为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种检测塞来昔布中苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、磺胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f的lc-ms/ms方法，它包括如下步骤：1、溶液配制（1）卡马西平内标溶液的配制：称取卡马西平约10mg，精密称定，置100ml容量容量瓶中，以甲醇为溶剂溶解，并稀释至刻度，摇匀作为卡马西平储备液（100μg/ml），-20℃保存。（2）供试品溶液的配制：取塞来昔布供试品约80mg，精密称定，置于2.0ml聚塑离心管中，精密加入甲醇500μl，适当震荡使样品完全溶解，依次精密加入5%二硫苏糖醇（dtt）的1%乙酸铵（用氨水调节ph在8~10）水溶液20μl，内标卡马西平工作液（500ng/ml）20μl，涡旋混匀30s，再加入500μl纯净水，摇匀析出塞来昔布，15800rpm/min冷冻离心10min，吸取上清液过0.22μm滤膜，弃去适量初滤液，续滤液置于装有塑料内衬管的2ml玻璃进样小瓶中，取20μl，进行lc-ms/ms分析。（3）杂质储备液的配制：称取苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐、对氨基苯磺酰胺和塞来昔布杂质f对照品各约10mg，精密称定，置100ml棕色容量瓶中。加入适量甲醇，超声溶解，并稀释至刻度，摇匀作为苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐、对氨基苯磺酰胺和塞来昔布杂质f混合对照品储备液（100μg/ml），-20℃保存。（4）杂质对照溶液的配制：精密吸取杂质储备液和卡马西平内标溶液适量，配制成含各杂质浓度均为5μg/ml和内标卡马西平500ng/ml的混合标准工作溶液。精密吸取甲醇500μl，置2.0ml聚塑离心管中，依次精密加入5%二硫苏糖醇（dtt）的1%乙酸铵（用氨水调节ph在8~10）水溶液20μl，加入混合标准工作溶液20μl，涡旋混匀30s，再加入纯净水500μl，摇匀，配制成50%限度浓度（苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f均为100ng/ml，内标卡马西平为10ng/ml）的混合对照溶液，取20μl，进行lc-ms/ms分析。（5）空白溶液的配置：取50%甲醇1ml，精密加入5%二硫苏糖醇（dtt）的1%乙酸铵（用氨水调节ph在8~10）水溶液20μl。2、将空白溶剂、供试品溶液、杂质对照溶液，分别注入液相色谱和质谱联用仪，记录色谱图，按内标法以峰面积计算。具体条件如下：色谱条件设置：色谱柱：thermoscientificbdshypersilc18（100×4.6mm,2.4μm）流动相：a相：95%甲醇0.1%甲酸0.1%乙酸铵溶液b相：5%甲醇0.1%甲酸0.1%乙酸铵溶液洗脱梯度：时间（分钟）流动相a（%）流动相b（%）040601.5406028515585155.1406074060流速：0.65ml/min，柱后分流6:4进行lc-ms/ms测定；柱温：40℃质谱条件设置：电喷雾正离子化(esi+)测定喷口电压4000v，雾化温度100℃，吹扫气压力0.5psi，鞘气压力35psi，辅助气压力5psi，毛细管温度350℃，碰撞气氩气压力1.2mtorr。用于定量的[m+h]+离子反应监测如下：3、杂质含量计算公式内标法计算公式如下：校正因子：供试品浓度：式中：as——对照溶液中内标物质的峰面积；ar——对照溶液中被测物质的峰面积；ax——供试品溶液中被测物质的峰面积；——供试品溶液中内标的峰面积；cs——对照溶液中内标物质的浓度(ng/ml)；cr——对照溶液中被测物的浓度(ng/ml)；——供试品溶液中内标物质的浓度(ng/ml)；cx——供试品溶液中被测物质的浓度(ng/ml)。本发明提供了一种塞来昔布中苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、磺胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f残留含量的检测方法，本发明提供的技术方案显示出对塞来昔布潜在基因毒性杂质的检测优势，为塞来昔布潜在基因毒性杂质含量的检测提供了一种专属性强、准确度高的检测方法，从而实现对药物质量的控制。说明书附图：附图1：塞来昔布各基因毒性杂质产生途径说明。具体实施方式：本发明提供了一种塞来昔布中苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、磺胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f残留含量的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的塞来昔布中苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、磺胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f的检测方法中所用原料药、试剂或仪器或对照品均可由市场购得。下面结合对比例和实施例，进一步阐述本发明：实施例1空白溶剂的确定空白溶剂：取50%甲醇1ml，精密加入5%二硫苏糖醇（dtt）的1%乙酸铵（用氨水调节ph在8~10）水溶液20μl。杂质对照溶液：精密吸取甲醇500μl，置2.0ml聚塑离心管中，依次精密加入5%二硫苏糖醇（dtt）的1%乙酸铵（用氨水调节ph在8~10）水溶液20μl，加入（含各杂质浓度均为5μg/ml和内标卡马西平500ng/ml）混合标准工作溶液20μl，涡旋混匀30s，再加入纯净水500μl，摇匀，即得。精密分别取杂质对照溶液连续进样6次，记录图谱，计算rsd。结果：本法连续进样6次，苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f六个杂质峰面积与内标峰面积的比值rsd，均小于5%。表明建立的基因毒性杂质检查方法的精密度符合要求。保留时间的rsd小于1%，实验结果表明仪器精密度良好。表1塞来昔布原料药中添加50%限度浓度苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f（均为100ng/ml），内标卡马西平（10ng/ml）进样精密度的峰面积杂质指标123456rsd(%)a303066311239314029313963310729326724b581745758048995815325571796557408045733188c179281160985177082178737173781167592d218845231752225256214968214534210604e252312570226703264642703026581f158512016278921609480157347515669151574773is272223427775322877918272401427419492765773a(a/is)0.11130.11210.10910.11530.11330.11812.79a(b/is)2.1372.0902.0212.0992.0942.0731.83a(c/is)0.065860.057960.061530.065620.063380.060594.90a(d/is)0.080390.083440.078270.078920.078240.076153.12a(e/is)0.0092680.0092540.0092790.0097150.0098580.0096112.79a(f/is)0.58230.58610.55930.57760.57150.56941.69注：a代表苯胺；b代表乙酰苯胺；c代表对乙酰氨基苯磺酰胺；d代表对氨基苯磺酰胺；e代表对肼基苯磺酰胺盐酸盐；f代表塞来昔布杂质f，下同。表2塞来昔布原料药中添加50%限度浓度苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f（均为100ng/ml），内标卡马西平（10ng/ml）进样保留时间(min)精密度杂质123456rsd(%)a2.532.532.532.52.532.530.49b3.393.363.363.363.363.360.36c1.911.911.911.911.911.910.00d1.791.801.801.801.801.800.23e1.761.761.761.771.761.760.23f4.704.674.664.674.674.660.32对比例1空白溶剂：50%甲醇。杂质对照溶液：精密吸取甲醇500μl，置2.0ml聚塑离心管中，加入（含各杂质浓度均为5μg/ml和内标卡马西平500ng/ml）混合标准工作溶液20μl，涡旋混匀30s，再加入纯净水500μl，摇匀，即得。精密分别取杂质对照溶液连续进样6次，记录图谱，计算rsd。结果：杂质对照溶液中对肼基苯磺酰胺（shh），在相邻两个进样分析时的色谱峰差别较大，且连续六次分析rsd却超过50%，并且有响应明显逐次减小的现象，推测原因是对肼基苯磺酰胺（shh）盐酸盐在水溶液中极度不稳定。分析并解决问题：溶样液为50%甲醇测得其表观ph为酸性，推测苯肼化合物在酸性水溶液中易发生氧化反应，故考虑加入适量的抗氧剂。二硫苏糖醇是一种常用的抗氧剂，当ph在8~10之间时能发挥较好的抗氧化作用，但在酸性条件下无法起到抗氧化作用。故溶样液50%甲醇用浓氨水调节ph在8~9。配制5%二硫苏糖醇（dtt）的1%乙酸铵（用氨水调节ph在8~10）水溶液，在各样品中加入二硫苏糖醇溶液20μl。经测试加入稳定剂二硫苏糖醇和调节溶样液ph后，shh的水溶液稳定性得到显著改善。实施例2线性试验色谱条件设置：色谱柱：thermoscientificbdshypersilc18（100×4.6mm,2.4μm）流动相：a相：95%甲醇0.1%甲酸0.1%乙酸铵溶液b相：5%甲醇0.1%甲酸0.1%乙酸铵溶液洗脱梯度：时间（分钟）流动相a（%）流动相b（%）040601.5406028515585155.1406074060流速：0.65ml/min，柱后分流6:4进行lc-ms/ms测定；柱温：40℃质谱条件设置：电喷雾正离子化(esi+)测定喷口电压4000v，雾化温度100℃，吹扫气压力0.5psi，鞘气压力35psi，辅助气压力5psi，毛细管温度350℃，碰撞气氩气压力1.2mtorr。用于定量的[m+h]+离子反应监测如下：空白溶剂：取50%甲醇1ml，精密加入5%二硫苏糖醇（dtt）的1%乙酸铵（用氨水调节ph在8~10）水溶液20μl。混合标准曲线工作溶液：精密吸取含苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f的混合对照品储备液（各100μg/ml）和卡马西平储备液（100μg/ml）适量，置10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，配制成含苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f浓度均分别为1.0μg/ml，1.5μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，7.5μg/ml，10μg/ml；内标卡马西平为500ng/ml的系列浓度混合标准溶液，作为苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f测定用的混合标准曲线工作溶液(现配现用)。标准曲线待测溶液：精密吸取甲醇500μl置2ml聚塑离心管中，依次精密加入5%二硫苏糖醇（dtt）的1%乙酸铵（用氨水调节ph在8~10）水溶液20μl，精密加入苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f的系列浓度标准曲线工作溶液20μl，涡旋混匀30s后，再精密加入纯净水500μl，摇匀，配制成含苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f浓度分别为20.00ng/ml，30.00ng/ml，50.00ng/ml，100.0ng/ml，150.0ng/ml，200.0ng/ml；内标卡马西平均为10.00ng/ml的系列浓度标准曲线待测溶液。分别精密量取上述标曲待测溶液和空白待测溶液20μl进样，记录色谱图，按最小二乘法，以苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f峰面积与内标卡马西平峰面积之比(ax/ai)，对各基因毒性杂质成分的浓度c(ng/ml)，进行线性回归。结果表明，在上述测定条件下，苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f，均在20~200ng/ml浓度范围内线性关系均良好。表3苯胺的标准曲线数据表4乙酰苯胺的标准曲线数据表5对乙酰氨基苯磺酰胺的标准曲线数据表6塞来昔布杂质f的标准曲线数据表7对氨基苯磺酰胺的标准曲线数据表8对肼基苯磺酰胺盐酸盐的标准曲线数据实施例3回收率试验塞来昔布原料药供试品中添加限度浓度含量低（50%）、中（100%）、高（150%）三个水平浓度作为准确度实验的样品。回收率对照溶液：精密吸取甲醇500μl，置2.0ml聚塑离心管中，依次精密加入5%二硫苏糖醇（dtt）的1%乙酸铵（用氨水调节ph在8~10）水溶液20μl，加入含苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f（浓度均为5μg/ml）和内标卡马西平（500ng/ml）的混合标准工作液20μl，涡旋混匀30s，再加入纯净水500μl，配制成50%限度浓度（苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f均为100ng/ml，内标卡马西平为10ng/ml）的混合对照溶液，作为回收率对照溶液。回收率样品溶液：取塞来昔布原料药供试品约80mg，精密称定，置2.0ml聚塑离心管中，精密加入甲醇500μl，适当震荡使样品完全溶解，依次精密加入5%二硫苏糖醇（dtt）的1%乙酸铵（用氨水调节ph在8~10）水溶液20μl，加入含苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f（浓度分别为2.5μg/ml，5μg/ml或7.5μg/ml），内标卡马西平（500ng/ml）的标准工作液20μl，涡旋混匀30s，再加入纯净水500μl，摇匀析出塞来昔布，15800rpm/min高速冷冻离心10min，吸取上清液过0.22μm滤膜，弃去适量初滤液，取续滤液作为低（50%）、中（100%）或高（150%）浓度水平供试品添加标准对照溶液。每个添加水平平行配制3份，分别进样测定。根据峰面积比，按内标法计算苯胺、乙酰苯胺、对乙酰氨基苯磺酰胺、对氨基苯磺酰胺、对肼基苯磺酰胺盐酸盐和塞来昔布杂质f，六个杂质的测得浓度，扣除样品中的本底含量计算回收率。结果，经计算低、中、高浓度的回收率均约位于80~120%之间，表明准确度良好。表9塞来昔布原料药中苯胺回收率试验表10塞来昔布原料药中乙酰苯胺回收率试验表11塞来昔布原料药中对乙酰氨基苯磺酰胺回收率试验表12塞来昔布原料药中对肼基苯磺酰胺盐酸盐回收率试验表13塞来昔布原料药中对氨基苯磺酰胺回收率试验表14塞来昔布原料药中塞来昔布杂质f回收率试验当前第1页12