一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法与流程

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法。

背景技术：

血清中的脂溶性营养素主要包括脂溶性维生素和类胡萝卜素类物质。脂溶性维生素主要包括维生素a、d、e和k，它们都含有环结构和长的脂肪族烃链，不溶于水或甘油，易溶于无水乙醇、甲醇、三氯甲烷、乙醚和油中。维生素a和e是常见的抗氧化剂，能防止细胞内不饱和脂肪酸等易氧化物质的氧化破坏，起到保护细胞膜不被破坏的作用。维生素d为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。维生素k是一类甲萘醌衍生物的总称，具有促进血液正常凝固等生理作用。类胡萝卜素是亲脂性异戊二烯类植物色素，存在于红色、黄色、橙色和深绿色的水果和蔬菜中。在自然界750多种类胡萝卜素中，约有15种存在于人体血清中，在血清中含量较高的有叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素等。因化学结构中含有不饱和双键，类胡萝卜素是有效的抗氧化剂。许多脂溶性营养素参与与全身代谢密切相关的整体过程的稳态调节，包括氧化还原和炎症途径，是维持人体健康所必须的微量营养素。血清中脂溶性营养素含量的测定在营养学研究、癌症或非癌症相关疾病治疗的研究中至关重要。因此，开发快速和灵敏的方法来测量这些营养物质的血清浓度对于营养状况评估、营养不良诊断、干预方案制定和微量营养素可能涉及或改变的氧化或炎症反应研究等具有重要意义。

高效液相色谱法(hplc)作为一种重要的分析技术，由于分离效率高、分析速度快、灵敏度高、所需试样量少等优点，为多种生化标记物的检测提供了新方法，越来越多地被应用于临床评价。专利cn105158394a、cn105372374a、cn109030648a、cn105891384b与cn105891384a公开了血清、奶粉或饲料中多种脂溶性维生素的定量分析方法。前处理过程采用乙醇沉淀蛋白，然后用正己烷或石油醚等溶剂萃取，收集萃取液吹干萃取剂后，用甲醇溶解后经液相色谱或液相色谱-串联质谱检测。该前处理过程步骤多，耗时长，易造成脂溶性维生素的氧化，并且有毒有害试剂的使用量大。专利cn108120788a、cn104749293a、cn107561171a、cn105717209a、cn103175934a以四氢呋喃、丙酮、正己烷、乙醚、乙酸乙酯等为萃取剂，采用液-液萃取的方式富集枸杞、黄肉桃、月季花瓣、辣椒叶片、草莓中的类胡萝卜素类物质，然后经液相色谱进行定量分析。前处理过程中有毒有害挥发性有机溶剂的用量较大，易污染环境。专利cn103175934a以c18色谱柱为固定相，而c18色谱柱对结构相似的类胡萝卜素及其同分异构体的分离效果有限，最为典型的情况是c18色谱柱无法分离互为同分异构体的叶黄素和玉米黄素，因此多将叶黄素和玉米黄素作为一个整体进行报道。而实际上叶黄素和玉米黄素在人体内分布区域不同，作用有别，因此分别测定二者的血清浓度将有助于研究其个体作用。专利cn108120788a公布了以c30色谱柱为固定相检测枸杞果实中叶黄素和玉米黄素含量的方法。但目前尚无专利公开同时检测血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素含量的方法。

液-液萃取作为一种低成本、易操作的前处理技术，其核心在于萃取剂的选择。目前液-液萃取法富集血清中脂溶性营养素所用有机溶剂萃取剂与营养素的相互作用力较弱，萃取回收率低，需要先沉淀与营养素结合较强的蛋白，并多次萃取来提高回收率。因此，前处理操作繁琐，步骤多，有机溶剂用量大，耗时且污染较大。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，该方法操作简单，节省时间，萃取剂使用量少。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，以离子液体或离子液体与有机溶剂组成的二元复合溶剂作为萃取剂，经液-液萃取法对血清进行前处理，选取维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛分别作为脂溶性维生素和类胡萝卜素的内标物，对得到的离子液体萃取相进行高效液相色谱分析，测得血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的含量。

其中，所述脂溶性维生素主要包括维生素a、维生素d(维生素d2、维生素d3及代谢物25-羟基维生素d3、25-羟基维生素d2)、维生素e(α-生育酚、γ-生育酚)和维生素k(维生素k1、维生素k2)(图1)。所述类胡萝卜素主要包括叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素等(图1)。

优选地，所述离子液体由阳离子m⁺和阴离子n^-两部分组成，阳离子m⁺为具有取代基的咪唑阳离子、具有取代基的吡啶阳离子、具有取代基的哌啶阳离子、具有取代基的吡咯烷阳离子、具有取代基的胺类阳离子、具有取代基的磷酸类阳离子中的一种；阳离子m⁺上的取代基团包括烷烃类、烯烃类、芳烃类等有机基团，取代数目可以为单取代、二取代、三取代等类型，多取代时不同位点上的取代基可以相同也可以不同；阴离子n^-为四氟硼酸根(bf4^-)、六氟磷酸根(pf6^-)、双(三氟甲烷磺酰)亚胺根(tf2n^-)中的一种。

优选地，二元复合溶剂中离子液体的摩尔百分比为1％～90％，有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、乙酸乙酯、正丁醇、正庚醇、正辛醇、正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、环戊烷、环己烷、沸程为60～90℃石油醚、沸程为90～120℃的石油醚、甲苯中的一种。

在离子液体中添加有机溶剂不仅可以降低萃取剂的粘度，促进两相传递过程的进行，而且减少了离子液体的用量，降低了萃取成本。

优选地，进行液-液萃取前处理时，综合考虑脂溶性营养素的回收率和萃取液中脂溶性营养素的浓度(峰面积)等因素，每250ul血清中，需要的萃取剂体积为50-500ul。单次萃取后脂溶性维生素和类胡萝卜素的回收率为50％～95％。

液相色谱分析采用的固定相为ymcc30色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相a为体积分数90％以上的甲醇水溶液，流动相b为体积分数30％以上的异丙醇/正己烷溶液，洗脱方式为梯度洗脱，流速为1ml/min，检测波长包括324nm(维生素a)、263nm(维生素d)、290nm(维生素e)、254nm(维生素k)和450nm(类胡萝卜素)，柱温为25℃，进样量10μl。脂溶性维生素和类胡萝卜素的同时检测可在40分钟内完成。

比较血清中各组分与标准物质的保留时间和紫外可见吸收光谱图对待测脂溶性维生素和类胡萝卜素进行定性分析。选择维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛分别为脂溶性维生素和类胡萝卜素的内标物，采用内标法建立标准曲线，比较待测脂溶性维生素和类胡萝卜素与内标物的峰面积比值和标准曲线得到血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的含量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开的同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，先选择离子液体对血清进行液-液萃取前处理，再经过高效液相色谱分析，便可同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的含量。首先，与传统溶剂相比，离子液体是一类新型绿色溶剂，具有以下一些独特性质：(1)几乎没有蒸汽压，不挥发、不可燃，因而有助于工艺安全、环保；(2)热稳定性和化学稳定性良好；(3)结构和功能可调，可通过设计离子液体的阴、阳离子部分以达到某种特定的功能特性；(4)具备多种分子间相互作用方式，可兼具π-π、偶极、氢键等多种分子作用并易于调节。因此，本发明利用离子液体具有多重分子间作用力且性质可控的特性，以离子液体或离子液体与有机溶剂组成的二元复合溶剂为萃取剂，无需预沉淀蛋白和吹干萃取剂后复溶，单次萃取后直接将离子液体萃取相进行高效液相色谱分析，前处理过程简单、省时。其次，选择维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛为脂溶性维生素和类胡萝卜素的内标物，采用内标法建立标准曲线，比较待测脂溶性维生素和类胡萝卜素与内标物的峰面积比值和标准曲线得到血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的含量。经实验验证，本发明方法的加样回收率、检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，采用内标法定量提高了定量结果的准确性，重现性良好，误差小，血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的含量测定可在40分钟内完成。

附图说明

图1为脂溶性维生素和类胡萝卜素物质的分子结构示意图；

图2为本专利中的血清样本前处理过程与传统血清样本前处理过程比较图示；

图3为血清中典型脂溶性维生素和类胡萝卜素的液相色谱图；其中，(a)为维生素a；(b)为25-羟基维生素d3；(c)为γ-生育酚；(d)为叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素及番茄红素。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明公开的同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

①在待测血清中加入已知浓度的维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛的甲醇溶液并混匀；

②向待测血清中加入萃取剂，涡旋2分钟后置于4℃离心机中，在12000r/min的转速下离心10分钟，收集离子液体萃取相；

③取一定体积的脂溶性维生素和类胡萝卜素标准品的储备液，用模拟血清稀释后制备一系列浓度的标准溶液，取标准溶液按照步骤①、②的操作进行处理，得到标准品的萃取相溶液；

④将血清萃取相和标准品萃取相溶液进行液相色谱分析，采用内标法建立脂溶性维生素和类胡萝卜素的标准曲线，比较血清中各待测组分与内标物的峰面积比值和标准曲线得到血清中脂溶性营养素的含量。

所述脂溶性维生素主要包括维生素a、维生素d(维生素d2、维生素d3及代谢物25-羟基维生素d3、25-羟基维生素d2)、维生素e(α-生育酚、γ-生育酚)和维生素k(维生素k1、维生素k2)(图1)。所述类胡萝卜素主要包括叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素等(图1)。

参见图2，与现有方法相比，本发明上述方法的优势体现在：前处理过程简单易操作，样品制备时间短，并减少了有毒有害有机溶剂的用量；高效液相色谱分析方法分离效果好，检测精度高，可在40分钟内同时检测十种以上脂溶性营养素(血清中典型脂溶性维生素和类胡萝卜素的hplc色谱图如图3所示)，高通量、低成本，易于临床推广及普及。

实施例1

一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

①在250ul血清中加入5ul已知浓度的维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛的甲醇溶液并混匀；

②向血清中加入100ul摩尔分数50％的1-丁基-3-甲基咪唑双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([bmim][tf2n])的正己烷溶液，涡旋2分钟后置于4℃离心机中，在12000r/min的转速下离心10分钟，收集离子液体萃取相；

③取一定体积的脂溶性维生素和类胡萝卜素标准品的储备液，用模拟血清稀释后制备一系列浓度的标准溶液，取250ul标准溶液重复步骤①②，得到标准品的萃取相溶液；

④将血清萃取相和标准品萃取相溶液进行液相色谱分析，采用内标法建立脂溶性维生素和类胡萝卜素的标准曲线，比较血清中各待测组分与内标物的峰面积比值和标准曲线得到血清中脂溶性营养素的含量；所述色谱条件如下：色谱柱为ymcc30色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相a为甲醇，流动相b为体积分数30％的异丙醇正己烷溶液，流速为1ml/min，洗脱方式为梯度洗脱(0-20min,100％a-50％a；20-22min，50％a-0％a；22-30min,0％a-0％a；30-31min,0％a-100％a)，多波长检测(维生素a324nm、维生素d263nm、维生素e290nm、维生素k254nm、类胡萝卜素450nm)，柱温为25℃，进样量为10ul。

该定量分析方法准确可靠，所测脂溶性维生素和类胡萝卜素的加样回收率为83.2％～108.5％，最低检出限为0.005ug/ml～0.025ug/ml。实验测得20个正常人血清中维生素a、25-羟基维生素d3、α-生育酚、γ-生育酚、叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素的含量分别为1.05±0.23μmol/l、0.051±0.036μmol/l、34.2±10.8μmol/l、4.14±0.9μmol/l、0.48±0.24μmol/l、0.072±0.026μmol/l、0.16±0.14μmol/l、0.073±0.057μmol/l、0.53±0.37μmol/l、0.17±0.12μmol/l，与文献报道正常人中各营养素的含量范围一致。

实施例2

一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，操作步骤如下：

①在250ul血清中加入15ul已知浓度的维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛的甲醇溶液并混匀；

②向血清中加入50ul摩尔分数30％的1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([hmim][bf4])的二氯甲烷溶液，涡旋2分钟后置于4℃离心机中，在12000r/min的转速下离心10分钟，收集离子液体萃取相；

③取一定体积的脂溶性维生素和类胡萝卜素标准品的储备液，用模拟血清稀释后制备一系列浓度的标准溶液，取250ul标准溶液重复步骤①②，得到各标准溶液的萃取相溶液；

④将血清萃取相和标准溶液萃取相溶液进行液相色谱分析，采用内标法建立脂溶性维生素和类胡萝卜素的标准曲线，比较实际血清中各待测组分与内标物的峰面积比值和标准曲线测得血清中各脂溶性营养素的含量；

所述色谱条件如下：色谱柱为ymcc30色谱柱，流动相a为体积分数90％的甲醇水溶液，流动相b为体积分数40％的异丙醇正己烷溶液，流速为1ml/min，洗脱方式为梯度洗脱(0-15min,100％a-40％a；15-18min，40％a-0％a；18-23min,0％a-0％a；23-25min,0％a-100％a)，多波长检测(维生素a324nm、维生素d263nm、维生素e290nm、维生素k254nm、类胡萝卜素450nm)，柱温为25℃，进样量为10ul。

该定量分析方法准确可靠，所测脂溶性维生素和类胡萝卜素的加样回收率为89.8％～110.2％，最低检出限为0.005ug/ml～0.025ug/ml。实验测得30个正常人血清中维生素a、25-羟基维生素d3、α-生育酚、γ-生育酚、叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素的含量分别为2.45±0.53μmol/l、0.068±0.04μmol/l、39.1±14.7μmol/l、2.96±0.77μmol/l、0.64±0.31μmol/l、0.13±0.09μmol/l、0.089±0.067μmol/l、0.046±0.033μmol/l、0.44±0.34μmol/l、0.21±0.14μmol/l，与文献报道正常人中各营养素的含量范围一致。

实施例3

一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，操作步骤如下：

①在250ul血清中加入10ul已知浓度的维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛的甲醇溶液并混匀；

②向血清中加入200ul摩尔分数40％的n-十二烷基吡啶六氟磷酸盐([c12py][pf6])的甲苯溶液，涡旋2分钟后置于4℃离心机中，在12000r/min的转速下离心10分钟，收集离子液体萃取相；

③取一定体积的脂溶性维生素和类胡萝卜素标准品的储备液，用模拟血清稀释后制备一系列浓度的标准溶液，取250ul标准溶液重复步骤①②，得到各标准溶液的离子液体萃取相溶液；

④将血清萃取相和标准溶液萃取相溶液进行液相色谱分析，采用内标法建立脂溶性维生素和类胡萝卜素的标准曲线，比较实际血清中各待测组分与内标物的峰面积比值和标准曲线测得血清中各脂溶性营养素的含量；

所述色谱条件如下：色谱柱为ymcc30色谱柱，流动相a为体积分数95％的甲醇水溶液，流动相b为体积分数50％的异丙醇正己烷溶液，流速为1ml/min，洗脱方式为梯度洗脱(0-30min,100％a-10％a；30-32min，10％a-10％a；32-33min,10％a-100％a)，多波长检测(维生素a324nm、维生素d263nm、维生素e290nm、维生素k254nm、类胡萝卜素450nm)，柱温为25℃，进样量为10ul。

该定量分析方法准确可靠，所测脂溶性维生素和类胡萝卜素的加样回收率为90.3％～99.5％，最低检出限为0.005ug/ml～0.025ug/ml。实验测得50个正常人血清中维生素a、25-羟基维生素d3、α-生育酚、γ-生育酚、叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素的含量分别为1.88±0.43μmol/l、0.13±0.08μmol/l、38.9±14.2μmol/l、5.66±1.7μmol/l、0.61±0.16μmol/l、0.089±0.02μmol/l、0.14±0.03μmol/l、0.038±0.017μmol/l、0.62±0.45μmol/l、0.19±0.13μmol/l，与文献报道正常人中各营养素的含量范围一致。

实施例4

一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，操作步骤如下：

①在250ul血清中加入20ul已知浓度的维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛的甲醇溶液并混匀；

②向血清中加入150ul摩尔分数为70％的1-苄基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([bzmim][pf6])的环戊烷溶液，涡旋2分钟后置于4℃离心机中，在12000r/min的转速下离心10分钟，收集离子液体萃取相；

③取一定体积的脂溶性维生素和类胡萝卜素标准品的甲醇储备液，用模拟血清稀释后制备一系列浓度的标准溶液，取250ul标准溶液重复步骤①②，得到各标准溶液的离子液体萃取相溶液；

④将血清萃取相和标准溶液萃取相溶液进行液相色谱分析，采用内标法建立脂溶性维生素和类胡萝卜素的标准曲线，比较血清中各待测组分与内标物的峰面积比值和标准曲线测得血清中各脂溶性营养素的含量；

所述色谱条件如下：色谱柱为ymcc30色谱柱，流动相a为体积分数98％的甲醇水溶液，流动相b为体积比7/3的异丙醇/正己烷溶液，流速为1ml/min，洗脱方式为梯度洗脱(0-25min,100％a-0％a；25-35min，0％a-100％a)，多波长检测(维生素a324nm、维生素d263nm、维生素e290nm、维生素k254nm、类胡萝卜素450nm)，柱温为25℃，进样量为10ul。

该定量分析方法准确可靠，所测脂溶性维生素和类胡萝卜素的加样回收率为86.5％～112.3％，最低检出限为0.005ug/ml～0.025ug/ml。实验测得40个正常人血清中维生素a、25-羟基维生素d3、α-生育酚、γ-生育酚、叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素的含量分别为0.75±0.26μmol/l、0.098±0.03μmol/l、33.3±11.1μmol/l、6.23±0.61μmol/l、0.70±0.34μmol/l、0.065±0.022μmol/l、0.12±0.05μmol/l、0.039±0.015μmol/l、0.59±0.31μmol/l、0.11±0.092μmol/l，与文献报道正常人中各营养素的含量范围一致。

实施例5

一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，操作步骤如下：

①在250ul血清中加入15ul已知浓度的维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛的甲醇溶液并混匀；

②向血清中加入400ul摩尔分数为10％的n-辛基-n-甲基吡咯烷双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([opyr][tf2n])的乙酸乙酯溶液，涡旋2分钟后置于4℃离心机中，在12000r/min的转速下离心10分钟，收集离子液体萃取相；

③取一定体积的脂溶性维生素和类胡萝卜素标准品的甲醇储备液，用模拟血清稀释后制备一系列浓度的标准溶液，取250ul标准溶液重复步骤①②，得到各标准溶液的离子液体萃取相溶液；

④将血清萃取相和标准溶液萃取相溶液进行液相色谱分析，采用内标法建立脂溶性维生素和类胡萝卜素的标准曲线，比较血清中各待测组分与内标物的峰面积比值和标准曲线测得血清中各脂溶性营养素的含量；

所述色谱条件如下：色谱柱为ymcc30色谱柱，流动相a为甲醇，流动相b为体积分数60％的异丙醇正己烷溶液，流速为1ml/min，洗脱方式为梯度洗脱(0-10min,100％a-85％a；10-25min，85％a-0％a，25-30min,0％a-100％a)，多波长检测(维生素a324nm、维生素d263nm、维生素e290nm、维生素k254nm、类胡萝卜素450nm)，柱温为25℃，进样量为10ul。

该定量分析方法准确可靠，所测脂溶性维生素和类胡萝卜素的加样回收率为80.3％～98.2％，最低检出限为0.005ug/ml～0.025ug/ml。实验测得60个正常人血清中维生素a、25-羟基维生素d3、α-生育酚、γ-生育酚、叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素的含量分别为2.58±0.70μmol/l、0.034±0.026μmol/l、35.2±4.8μmol/l、3.14±0.6μmol/l、0.62±0.18μmol/l、0.042±0.017μmol/l、0.10±0.09μmol/l、0.044±0.033μmol/l、0.59±0.31μmol/l、0.11±0.06μmol/l，与文献报道正常人中各营养素的含量范围一致。

实施例6

一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，操作步骤如下：

①在250ul血清中加入5ul已知浓度的维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛的甲醇溶液并混匀；

②向血清中加入100ul摩尔分数为60％的四丁基胺双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([n4,4,4,4][tf2n])的正辛醇溶液，涡旋2分钟后置于4℃离心机中，在12000r/min的转速下离心10分钟，收集离子液体萃取相；

③取一定体积的脂溶性维生素和类胡萝卜素标准品的储备液，用模拟血清稀释后制备一系列浓度的标准溶液，取250ul标准溶液重复步骤①②，得到各标准溶液的离子液体萃取相溶液；

④将血清萃取相和标准溶液萃取相溶液进行液相色谱分析，采用内标法建立脂溶性维生素和类胡萝卜素的标准曲线，比较血清中各待测组分与内标物的峰面积比值和标准曲线测得血清中各脂溶性营养素的含量；

所述色谱条件如下：色谱柱为ymcc30色谱柱，流动相a为体积分数98％的甲醇水溶液，流动相b为异丙醇，流速为1ml/min，洗脱方式为梯度洗脱(0-10min,100％a-70％a；10-20min，70％a-0％a，20-30min,0％a-100％a)，多波长检测(维生素a324nm、维生素d263nm、维生素e290nm、维生素k254nm、类胡萝卜素450nm)，柱温为25℃，进样量为10ul。

该定量分析方法准确可靠，所测脂溶性维生素和类胡萝卜素的加样回收率为93.2％～105.8％，最低检出限为0.005ug/ml～0.025ug/ml。实验测得35个正常人血清中维生素a、25-羟基维生素d3、α-生育酚、γ-生育酚、叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素的含量分别为2.05±0.66μmol/l、0.048±0.04μmol/l、35.2±7.8μmol/l、5.06±1.0μmol/l、0.46±0.12μmol/l、0.063±0.039μmol/l、0.12±0.05μmol/l、0.030±0.019μmol/l、0.44±0.19μmol/l、0.43±0.25μmol/l，与文献报道正常人中各营养素的含量范围一致。

实施例7

一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，操作步骤如下：

①在250ul血清中加入20ul已知浓度的维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛的甲醇溶液并混匀；

②向血清中加入80ul摩尔分数为50％的n-十六烷基-n-甲基哌啶六氟磷酸盐([c16mpip][pf6])的石油醚(沸程60～90℃)溶液，涡旋2分钟后置于4℃离心机中，在12000r/min的转速下离心10分钟，收集离子液体萃取相；

③取一定体积的脂溶性维生素和类胡萝卜素标准品的储备液，用模拟血清稀释后制备一系列浓度的标准溶液，取250ul标准溶液重复步骤①②，得到各标准溶液的离子液体萃取相溶液；

④将血清萃取相和标准溶液萃取相溶液进行液相色谱分析，采用内标法建立脂溶性维生素和类胡萝卜素的标准曲线，比较血清中各待测组分与内标物的峰面积比值和标准曲线测得血清中各脂溶性营养素的含量；

所述色谱条件如下：色谱柱为ymcc30色谱柱，流动相a为体积分数93％的甲醇水溶液，流动相b为体积分数80％的异丙醇正己烷溶液，流速为1ml/min，洗脱方式为梯度洗脱(0-20min,100％a-50％a；20-23min，50％a-0％a，23-30min,0％a-100％a)，多波长检测(维生素a324nm、维生素d263nm、维生素e290nm、维生素k254nm、类胡萝卜素450nm)，柱温为25℃，进样量为10ul。

该定量分析方法准确可靠，所测脂溶性维生素和类胡萝卜素的加样回收率为90.4％～113.5％，最低检出限为0.005ug/ml～0.025ug/ml。实验测得40个正常人血清中维生素a、25-羟基维生素d3、α-生育酚、γ-生育酚、叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素的含量分别为1.63±0.35μmol/l、0.058±0.045μmol/l、30.2±8.2μmol/l、3.45±1.2μmol/l、0.61±0.16μmol/l、0.067±0.036μmol/l、0.14±0.03μmol/l、0.06±0.06μmol/l、0.62±0.45μmol/l、0.07±0.03μmol/l，与文献报道正常人中各营养素的含量范围一致。

实施例8

一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，操作步骤如下：

①在250ul血清中加入15ul已知浓度的维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛的甲醇溶液并混匀；

②向血清中加入120ul摩尔分数为10％的n-辛基吡啶四氟硼酸盐([opy][bf4])的环己烷溶液，涡旋2分钟后置于4℃离心机中，在12000r/min的转速下离心10分钟，收集离子液体萃取相；

③取一定体积的脂溶性维生素和类胡萝卜素标准品的储备液，用模拟血清稀释后制备一系列浓度的标准溶液，取250ul标准溶液重复步骤①②，得到各标准溶液的离子液体萃取相溶液；

④将血清萃取相和标准溶液萃取相溶液进行液相色谱分析，采用内标法建立脂溶性维生素和类胡萝卜素的标准曲线，比较血清中各待测组分与内标物的峰面积比值和标准曲线测得血清中各脂溶性营养素的含量；

所述色谱条件如下：色谱柱为ymcc30色谱柱，流动相a为体积分数97％的甲醇水溶液，流动相b为体积分数90％的异丙醇正己烷溶液，流速为1ml/min，洗脱方式为梯度洗脱(0-18min,100％a-40％a；18-25min，40％a-0％a，25-33min,0％a-100％a)，多波长检测(维生素a324nm、维生素d263nm、维生素e290nm、维生素k254nm、类胡萝卜素450nm)，柱温为25℃，进样量为10ul。

该定量分析方法准确可靠，所测脂溶性维生素和类胡萝卜素的加样回收率为84.3％～97.5％，最低检出限为0.005ug/ml～0.025ug/ml。实验测得60个正常人血清中维生素a、25-羟基维生素d3、α-生育酚、γ-生育酚、叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素的含量分别为1.91±0.12μmol/l、0.068±0.04μmol/l、35.6±13.1μmol/l、3.28±1.7μmol/l、0.46±0.12μmol/l、0.042±0.023μmol/l、0.21±0.05μmol/l、0.063±0.042μmol/l、0.85±0.27μmol/l、0.28±0.09μmol/l，与文献报道正常人中各营养素的含量范围一致。

实施例9

一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，操作步骤如下：

①在250ul血清中加入10ul已知浓度的维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛的甲醇溶液并混匀；

②向血清中加入500ul摩尔分数为20％的十六烷基三甲基季磷六氟磷酸盐([p1,1,1,16][pf6])的正庚醇溶液，涡旋2分钟后置于4℃离心机中，在12000r/min的转速下离心10分钟，收集离子液体萃取相；

③取一定体积的脂溶性维生素和类胡萝卜素标准品的储备液，用模拟血清稀释后制备一系列浓度的标准溶液，取250ul标准溶液重复步骤①②，得到各标准溶液的离子液体萃取相溶液；

④将血清萃取相和标准溶液萃取相溶液进行液相色谱分析，采用内标法建立脂溶性维生素和类胡萝卜素的标准曲线，比较血清中各待测组分与内标物的峰面积比值和标准曲线测得血清中各脂溶性营养素的含量；

所述色谱条件如下：色谱柱为ymcc30色谱柱，流动相a为体积分数96％的甲醇水溶液，流动相b为体积分数65％的异丙醇正己烷溶液，流速为1ml/min，洗脱方式为梯度洗脱(0-25min,100％a-0％a；25-28min，0％a-100％a)，多波长检测(维生素a324nm、维生素d263nm、维生素e290nm、维生素k254nm、类胡萝卜素450nm)，柱温为25℃，进样量为10ul。

该定量分析方法准确可靠，所测脂溶性维生素和类胡萝卜素的加样回收率为85.4％～100.3％，最低检出限为0.005ug/ml～0.025ug/ml。实验测得70个正常人血清中维生素a、25-羟基维生素d3、α-生育酚、γ-生育酚、叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素的含量分别为3.41±0.53μmol/l、0.081±0.04μmol/l、44.2±12.6μmol/l、7.14±2.45μmol/l、0.33±0.14μmol/l、0.052±0.046μmol/l、0.13±0.08μmol/l、0.062±0.037μmol/l、0.72±0.35μmol/l、0.32±0.04μmol/l，与文献报道正常人中各营养素的含量范围一致。

实施例10

一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，操作步骤如下：

①在250ul血清中加入20ul已知浓度的维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛的甲醇溶液并混匀；

②向血清中加入200ul摩尔分数为35％的n-丁基-n-甲基哌啶双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([bmpip][tf2n])的二氯乙烷溶液，涡旋2分钟后置于4℃离心机中，在12000r/min的转速下离心10分钟，收集离子液体萃取相；

③取一定体积的脂溶性维生素和类胡萝卜素标准品的储备液，用模拟血清稀释后制备一系列浓度的标准溶液，取250ul标准溶液重复步骤①②，得到各标准溶液的离子液体萃取相溶液；

④将血清萃取相和标准溶液萃取相溶液进行液相色谱分析，采用内标法建立脂溶性维生素和类胡萝卜素的标准曲线，比较血清中各待测组分与内标物的峰面积比值和标准曲线测得血清中各脂溶性营养素的含量；

所述色谱条件如下：色谱柱为ymcc30色谱柱，流动相a为甲醇，流动相b为体积分数40％的异丙醇正己烷溶液，流速为1ml/min，洗脱方式为梯度洗脱(0-16min,100％a-40％a；16-20min，40％a-0％a，20-25min,0％a-100％a)，多波长检测(维生素a324nm、维生素d263nm、维生素e290nm、维生素k254nm、类胡萝卜素450nm)，柱温为25℃，进样量为10ul。

该定量分析方法准确可靠，所测脂溶性维生素和类胡萝卜素的加样回收率为87.0％～112.5％，最低检出限为0.005ug/ml～0.025ug/ml。实验测得20个正常人血清中维生素a、25-羟基维生素d3、α-生育酚、γ-生育酚、叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素的含量分别为3.05±0.93μmol/l、0.081±0.026μmol/l、54.2±6.5μmol/l、5.69±3.13μmol/l、0.23±0.14μmol/l、0.055±0.024μmol/l、0.19±0.04μmol/l、0.062±0.043μmol/l、0.72±0.32μmol/l、0.29±0.06μmol/l，与文献报道正常人中各营养素的含量范围一致。

实施例11

一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，操作步骤如下：

①在250ul血清中加入5ul已知浓度的维生素a醋酸酯和反式-β-阿朴-8′-胡萝卜醛的甲醇溶液并混匀；

②向血清中加入100ul摩尔分数为20％的n-十二烷基吡啶四氟硼酸盐([c12py][bf4])的正己烷溶液，涡旋2分钟后置于4℃离心机中，在12000r/min的转速下离心10分钟，收集离子液体萃取相；

③取一定体积的脂溶性维生素和类胡萝卜素标准品的储备液，用模拟血清稀释后制备一系列浓度的标准溶液，取250ul标准溶液重复步骤①②，得到各标准溶液的离子液体萃取相溶液；

④将血清萃取相和标准溶液萃取相溶液进行液相色谱分析，采用内标法建立脂溶性维生素和类胡萝卜素的标准曲线，比较血清中各待测组分与内标物的峰面积比值和标准曲线测得血清中各脂溶性营养素的含量；

所述色谱条件如下：色谱柱为ymcc30色谱柱，流动相a为体积分数95％的甲醇水溶液，流动相b为体积比分数75％的异丙醇/正己烷溶液，流速为1ml/min，洗脱方式为梯度洗脱(0-20min,80％a-0％a；20-23min，0％a-0％a，23-30min,0％a-100％a)，多波长检测(维生素a324nm、维生素d263nm、维生素e290nm、维生素k254nm、类胡萝卜素450nm)，柱温为25℃，进样量为10ul。

该定量分析方法准确可靠，所测脂溶性维生素和类胡萝卜素的加样回收率为93.7％～106.4％，最低检出限为0.005ug/ml～0.025ug/ml。实验测得30个正常人血清中维生素a、25-羟基维生素d3、α-生育酚、γ-生育酚、叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素的含量分别为3.18±0.23μmol/l、0.087±0.034μmol/l、43.2±15.2μmol/l、8.14±1.90μmol/l、0.38±0.26μmol/l、0.065±0.029μmol/l、0.21±0.05μmol/l、0.071±0.037μmol/l、0.83±0.23μmol/l、0.29±0.07μmol/l，与文献报道正常人中各营养素的含量范围一致。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。