测定犬血浆中SodiumDanshensu和Prunasin的浓度的方法与流程

本发明涉及了生物分析领域，尤其涉及一种hplc-ms/ms法测定犬血浆中sodiumdanshensu和prunasin的浓度的方法。

背景技术：

肝纤维化是肝病中的一种。人体患有肝纤维化后，容易出现疲乏无力、食欲减退等症状，可能还会出现慢性消化不良、出血等症状，这些症状会给人体造成很大伤害。

扶正化瘀片是常用的治疗肝纤维化的中成药之一，其主要成分包括：五味子醇甲(schisandrin)、五味子乙素(γ-schisandrin)、马索亚内酯(massoialactone)、丹参素钠(sodiumdanshensu)、野黑樱苷(prunasin)、苦杏仁苷(amygdalin)、柚皮素(naringenin)、槲皮素(quercetin)、芦丁(rutin)、商陆苷(ombuoside)及其代谢产物商陆素(ombuin)、槲皮苷(quercitrin)、山奈酚(kaempferol)、葵烯酸钠(sodium5-hydroxy-2-decenoic)。检测比格犬(beagle犬)血浆中扶正化瘀片的毒代动力学特征，评估药物主要成分在比格犬体内的暴露水平，对于帮助了解药物在人体内的作用效果具有重要意义。因此，本领域技术人员持续致力于研究测定血浆中扶正化瘀片主要成分浓度的hplc-ms/ms方法。

技术实现要素：

为了克服现有技术中的缺陷，本发明实施例提供了一种hplc-ms/ms法测定犬血浆中sodiumdanshensu和prunasin的浓度的方法，phlc-ms/ms分析测定过程的工作条件：

(1)、phlc条件：

色谱柱：inertstainaq-c18(2.1mmx50mm,5.0μm),shimadzu；

柱温：35℃；

流动相a：0.1％乙酸-水溶液；

流动相b：甲醇-乙腈溶液(7/3，v/v)；

进样体积：3.00μl；

运行时间：4.80min；

保留时间：sodiumdanshensu，大约1.68min；prunasin，大约1.82min；osalmide，大约2.04min；

(3)、质谱条件：

质谱仪：absciexapi5000lc/ms/mssystem；

离子源：esi电喷雾电离；

离子化模式：negative；

涡旋离子喷雾温度：550℃。

进一步地，包括如下步骤：

(1)对sodiumdanshensu、prunasin和osalmide各取1.00mg/ml，并且分别溶于甲醇中，配置得到sodiumdanshensu储备液、prunasin储备液和osalmide储备液，≤-15℃密闭，遮光保存，其中osalmide作为内标；

将所述sodiumdanshensu储备液和所述prunasin储备液分别用甲醇溶液稀释成浓度为2*10⁵、1.6*10⁵ng/ml的校正标示样品工作液；将所述sodiumdanshensu和所述prunasin等浓度混合，再用甲醇溶液稀释成浓度为4*10⁴、1.6*10⁴、1600、400、200ng/ml的校正标示样品工作液；

将所述sodiumdanshensu储备液和所述prunasin储备液分别用甲醇溶液稀释成浓度为1.5*10⁵、1.0*10⁵ng/ml的质控工作液；将所述sodiumdanshensu和所述prunasin混合再用甲醇溶液稀释成浓度为6*10⁴、600、200ng/ml的质控工作液；

将所述osalmide储备液用甲醇溶液稀释成浓度为1*10⁴、50ng/ml的内标工作液；

将所述校正标示样品工作液用空白基质稀释成浓度为1*10⁴、8000、2000、800、80、20、10ng/ml的所述校正标示样，所述空白基质为不含分析物与内标的犬血浆，在本实施例中指不含sodiumdanshensu、prunasin和osalmide；

将所述质控工作液用所述空白基质稀释成浓度为7500、5000、300、30、10ng/ml的所述质控样品；

(2)样品处理：取等体积的所述校正标示样和所述质控样品，分别加入270μl的50ng/ml所述内标工作液，封板后涡旋混匀离心，离心后取上清液150μl至所述96孔板中，并加入100μl的甲醇溶液。然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μl在高效液相质谱联用仪(hplc-ms/ms)上进样分析；

(3)标准曲线的制作：以y＝ax+b制作标准曲线，x为分析物浓度，y为色谱峰面积比；

(4)定量分析：根据步骤(2)对待测样品进行处理，并按照步骤(3)所得所述标准曲线计算得到所述待测样品中的sodiumdanshensu、prunasin的浓度。

进一步地，所述步骤(2)中的离心条件为：10℃，4000rpm，离心10min。

进一步地，所述步骤(2)中还包括对空白(bk)样品的处理：吸取30μl的空白基质，加入270μl的甲醇溶液，封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min，离心后取上清液150μl至所述96孔板中，并加入100μl的甲醇溶液，然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μl进行分析。

进一步地，所述步骤(2)中还包括对qc0样品的处理：吸取30μl空白基质，再加入270μl所述内标工作液，封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min，离心后取上清液150μl至所述96孔板中，并加入100μl的甲醇溶液，然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μl进行分析。

进一步地，所述步骤(2)中还包括对uloqwithoutis样品的处理：最高定量限不含内标的空白基质，加入270μl的甲醇溶液，封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min，离心后取上清液150μl至所述96孔板中，并加入100μl的甲醇溶液。然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μl进行分析。

进一步地，所述步骤(2)中还包括对基质效应样品的处理：取单个供体(n≥6)的30μl的空白基质，并加入270μl甲醇溶液，涡旋离心后取上清液150μl，并加入100μlneat溶液，然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μl进行分析。

进一步地，所述步骤(2)中还包括对回收率样品的处理：取单个供体的空白基质，再取30μl的多个供体的混合的所述空白基质形成所述回收率样品，并加入270μl甲醇溶液，涡旋离心后取上清液150μl，并加入100μlneat溶液，然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μl进行分析。

本发明的有益效果如下：通过色谱柱、溶解液、流动相、保留时间等工艺条件的优化，使得整个测试过程更加可行，测量结果增加准确，减少了残留，提高了准确度以及回收率高，减小了基质效应以及干扰性。

为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中sodiumdanshensu-reagent样品的谱图；

图2是本发明实施例中sodiumdanshensu-blank空白样品的谱图；

图3是本发明实施例中sodiumdanshensu-qc0样品的谱图；

图4是本发明实施例中sodiumdanshensu-carryoverblank样品的谱图；

图5是本发明实施例中sodiumdanshensu-lloq样品的谱图；

图6是本发明实施例中sodiumdanshensu-uloq样品的谱图；

图7是本发明实施例中prunasin-reagent空白样品的谱图；

图8是本发明实施例中prunasin-blank空白样品的谱图；

图9是本发明实施例中prunasin-qc0样品的谱图；

图10是本发明实施例中prunasin-carryoverblank样品的谱图；

图11是本发明实施例中prunasin-lloq样品的谱图；

图12是本发明实施例中prunasin-uloq样品的谱图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或隐含地包括一个或者更多个该特征。

为达到上述目的，本发明提供一种hplc-ms/ms法测定犬血浆中sodiumdanshensu和prunasin的浓度的方法，包括以下步骤。

一、phlc-ms/ms分析测定过程的工作条件

(1)、phlc条件：

色谱柱：inertstainaq-c18(2.1mmx50mm,5.0μm),shimadzu；

柱温：35℃；

流动相a：0.1％乙酸-水溶液；

流动相b：甲醇-乙腈溶液(7/3，v/v)；

泵梯度：

进样体积：3.00μl；

运行时间：4.80min；

保留时间：sodiumdanshensu，大约1.68min；prunasin，大约1.82min；osalmide，大约2.04min；

(4)、质谱条件：

质谱仪：absciexapi5000lc/ms/mssystem；

离子源：esi电喷雾电离；

离子化模式：negative；

涡旋离子喷雾温度：550℃；

二、样品的配置

储备液的配置：对sodiumdanshensu、prunasin和osalmide各取1.00mg/ml，并且分别溶于甲醇中，配置得到sodiumdanshensu储备液、prunasin储备液和osalmide储备液，≤-15℃密闭，遮光保存，其中osalmide作为内标；如表1所示。

校正标示样品工作溶液的配置：将所述sodiumdanshensu储备液和所述prunasin储备液分别用甲醇溶液稀释成浓度为2*10⁵、1.6*10⁵ng/ml的校正标示样品工作液；将所述sodiumdanshensu和所述prunasin等浓度混合，再用甲醇溶液稀释成浓度为4*10⁴、1.6*10⁴、1600、400、200ng/ml的校正标示样品工作液；如表2所示。

质控工作液的配置：将所述sodiumdanshensu储备液和所述prunasin储备液分别用甲醇溶液稀释成浓度为1.5*10⁵、1.0*10⁵ng/ml的质控工作液；将所述sodiumdanshensu和所述prunasin混合再用甲醇溶液稀释成浓度为6*10⁴、600、200ng/ml的质控工作液；如表3所示。

内标工作液的配置：将所述osalmide储备液用甲醇溶液稀释成浓度为1*10⁴、50ng/ml的内标工作液；如表4所示。

neat溶液的配置：将所述质控溶液和所述内标工作液用甲醇溶液稀释成neat溶液；如表5所示。

注：上述校正标示样品工作液、所述质控工作液、所述内标工作液和所述回收率和基质效应的纯溶液，只要终浓度不变，稀释过程/体积可以改变。只要溶液id唯一，溶液id可以改变，不影响实验的可追溯性。并且均在室温下制备。

校正标示样的配置：将所述校正标示样品工作液用空白基质稀释成浓度为1*10⁴、8000、2000、800、80、20、10ng/ml的所述校正标示样，所述空白基质为不含分析物与内标的犬血浆，在本实施例中指不含sodiumdanshensu、prunasin和osalmide；如表6所示。

质控样品的配置：将所述质控工作液用所述空白基质稀释成浓度为7500、5000、300、30、10ng/ml的所述质控样品；如表7所示。

三、样品处理

取96孔板，在所述96孔板上标注校正标示样品、质控样品、空白样品、qc0样品、uloqwithoutis样品、reagent样品、基质效应样品和回收率样品，形成样品map图。

吸取30μl的所述校正标示样、所述质控样品分别放入校正标示样品孔、质控样品孔内；

吸取30μl的空白基质放入空白样品孔内，所述空白样品中无分析物，无内标；

吸取30μl空白基质中放入qc0样品孔内；

吸取30μl最高定量限不含内标的空白基质放入uloqwithoutis样品孔内；

吸取30.0μl水溶液至所述96孔板中的reagent样品的孔内。

吸取单个供体(n≥6)的30μl的空白基质放入基质效应样品孔内；

取单个供体的空白基质，再吸取30μl的多个供体的混合的所述空白基质放入回收率样品孔内。

在所述校正标示样、所述质控样品、所述qc0样品中分别加入270μl的所述内标工作液，封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min。离心后取上清液150μl至所述96孔板中，并加入100μl的甲醇溶液。然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μl进行分析。

在所述空白样品、所述uloqwithoutis样品、所述reagent样品中加入270μl的甲醇溶液，封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min。离心后取上清液150μl至所述96孔板中，并加入100μl的甲醇溶液。然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μl进行分析。

在所述基质效应样品、所述回收率样品中加入270μl的甲醇溶液，封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min。离心后取上清液150μl至所述96孔板中，并加入100μlneat溶液。然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取3.0μl进行分析。

四、直线回归模型的建立

按上述色谱和质谱条件对所述校正标示样、所述质控样品进行检测，色谱图采集和色谱峰积分由软件analyst1.6.3,appliedbiosystem进行处理。以sodiumdanshensu比内标osalmide、prunasin比内标osalmide的色谱峰面积比为纵坐标，以犬血浆中sodiumdanshensu、prunasin的浓度为横坐标，用加权(权重为1/x²)最小二乘法以犬血浆中sodiumdanshensu、prunasin的浓度(x)与色谱峰面积比(y)进行线性回归，所构建的线性回归方程(y＝ax+b)即为标准曲线。结果表明，sodiumdanshensu、prunasin的校正曲线范围在10.0ng/ml-10000ng/ml内线性良好制作标准曲线。

五、定量分析

取试验样品按照上述的样品处理步骤的方法处理，并按样品处理步骤所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中分析物sodiumdanshensu、prunasin的浓度。

六、测试方法的评价

所述空白(bk)样品、qc0样品、uloqwithoutis样品用来相互校正，减少干扰性。

所述基质效应样品和回收率样品用来评价该方法的基质效应和回收率。分析得到该方法的基质效应为100～110％。分析得到该方法的sodiumdanshensu回收率为：72.5％～100％，prunasin的回收率为：90％～100％。

本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。