牙周炎诊断方法、用途和试剂盒与流程

本发明属于口腔护理领域，并且涉及基于唾液的牙周病诊断。尤其是，本发明涉及用于诊断牙周炎的试剂盒、用途和方法。

背景技术：

牙龈炎症，或牙龈炎，是非破坏性牙周病，其主要由牙齿细菌生物膜或牙菌斑粘附到牙齿表面上引起的。如果不被检测到并治疗，可逆的牙龈炎通常导致牙齿周围组织(即，牙周组织)的炎症，被称为牙周炎的疾病，这是不可逆的并且引起组织破坏和牙槽骨损失，并且最终导致牙齿损失。在牙龈疾病的发展过程中，通常有与之相关的临床信号和症状，比如牙龈肿胀、颜色由粉红变成深红、牙龈流血、口臭、和牙龈变得起来越脆弱或一碰就疼。

牙周炎是由口腔微生物引起的慢性多因素炎症性疾病，并且具有的特征是硬(骨)和软(牙周韧带)组织的逐步破坏，最终导致牙齿活动并损失。要将这与牙龈炎区别开，牙龈炎是牙龈组织的可逆的感染和发炎。炎症性牙周炎是最普遍的慢性人类疾病之一并且是成年人牙齿损失的主要原因。除了牙周炎对口腔健康的重大负面影响以外，还有越来越多的证据表明牙周炎具有系统性后果并且是若干系统性疾病的风险因素，这些系统性疾病包括心脏病(例如，动脉粥样硬化、中风)、糖尿病、妊娠并发症、类风湿性关节炎和呼吸道感染。

因此，从口腔和整体健康两个角度来说牙周病的早期准确诊断是重要的。

在通常的牙科实践中对牙周病的诊断仍然较差，这导致相对低的治疗性干预率和大量的未治疗案例。目前的诊断依赖于由牙科专业人员对口腔组织状态(颜色、肿胀、探针探测时的出血程度、探针探测袋深度；以及根据口腔x-射线的骨损失)的不精确的、主观的临床检查。这些传统方法是费时的，并且所使用的技术中的一些(袋深度，x-射线)反映历史事件，例如过去的疾病活动性，而不是当前的疾病活动性或对进一步疾病的易感性。因此，需要更加客观、快速、准确、易于使用的诊断，该诊断优选地也可由非专业人士执行。由此，期望的是测量当前的疾病活动性，以及可能地对象对进一步牙周病的易感性。

唾液或口腔流体长期以来被提倡作为口腔和一般疾病的诊断流体，并且随着微型化生物传感器(也被称为芯片实验室)的出现，对快速椅侧测试的即时诊断引起了更大的科学和临床兴趣。尤其是对于牙周病检测，与组织炎症和分解相关的炎症性生物标记由于靠近唾液的原因而可容易地出现在唾液中，这暗示着唾液非常有可能用于牙周病检测。实际上，这个领域因此也引起了重大兴趣并且出现了振奋人心的结果。例如，ramseier等人(jperiodontol.20093月；80(3)：436-46)识别出宿主型细菌引起的生物标记，该生物标记与牙周病有关。但是，尚未出现明确的测试。

生物标记代表巩固临床表现的生物学指标，并因此是用于诊断牙周病的临床结果的客观手段。最终，经证明的生物标记可被用于评估未来疾病的风险、在最早期阶段确定疾病、确定对初期治疗的响应、以及允许防御性策略的实施。

以前对开发用于唾液生物标记的即时测试的限制包括缺乏适于椅侧应用的技术和不能分析个人样本中的多个生物学标记。而且，在这种测试中选择包括哪些生物标记在文献中没有被彻底解决，在实际测试中也没有被实施过。

期望的是提供一种更简单的过程，以及尤其是仅要求从患者提取少量唾液样本的过程，并且可能的是由患者自己提取。期望的是这种样本被输入到体外诊断设备中，该设备基于测量结果将允许对唾液样本分类，从而它能返回对患者要被分类为患有牙周炎的可能性的指示。

技术实现要素：

为了更好地解决前面的期望，本发明一方面涉及一种用于评估人类患者是否有牙周炎的体外方法，该方法包括在来自所述人类患者的唾液样本中检测游离型轻链κ蛋白质和/或游离型轻链λ蛋白质的浓度；确定反映为所述一个或两个蛋白质确定的该浓度或联合浓度的测试值；将该测试值与以相同方式反映所述浓度或联合浓度的与牙周炎有关的阈值进行比较，以评估该测试值是否指示所述患者的牙周炎。

在另一方面，本发明提出了人类患者的唾液样本中的游离型轻链κ蛋白质和/或游离型轻链λ蛋白质的作为用于评估患者是否有牙周炎的生物标记的用途。

可选地，患者的年龄也被用作生物标记。

在另一方面中，本发明存在于一种用于评估人类患者是否有牙周炎的系统中，该系统包括：

-检测装置，能够并且适合于在所述人类患者的唾液样本中检测游离型轻链κ蛋白质和/或游离型轻链λ蛋白质；以及

-处理器，能够并且适合于根据所述蛋白质的所确定的浓度确定该患者具有牙周炎的指示。

该系统可选地包含与界面的数据连接，该界面尤其是图形用户界面，该界面能够展示信息，优选地还能够输入信息，所述界面要么是该系统的一部分要么是远程界面。

可选地，前述物项中的一个或多个，尤其是处理器，被赋予“在云端”正常工作的能力，即，不是在固定机器上，而是借助于基于互联网的应用。

在另外一个方面，本发明提供了一种用于在人类患者的唾液样本中检测针对牙周炎的至少一个生物标记的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测游离型轻链κ蛋白质和/或游离型轻链λ蛋白质的一个或两个检测试剂。通常，使用两个检测试剂，其中每一个检测试剂结合一个不同的生物标记。在一个实施例中，第一检测试剂能够结合游离型轻链κ，而第二检测试剂能够结合游离型轻链λ。

在又一个方面中，本发明提供了一种用于确定在从第一时间点t1到第二时间点t2的时间间隔上人类患者中的牙周炎的状态变化的体外方法，该方法包括在在t1从所述患者获得的至少一个唾液样本中和在t2从所述患者获得的至少一个唾液样本中，检测游离型轻链λ蛋白质和/或游离型轻链κ蛋白质的浓度，并且比较所述浓度，由此在所述浓度的任一个或全部两个中的差反映状态变化。

在另一方面，本发明提供了一种诊断人类患者是否具有牙周炎的方法，包括在该人类患者的唾液样本中检测游离型轻链λ蛋白质和/或游离型轻链κ蛋白质，并且基于所述一个或两个蛋白质在所述唾液样本中的浓度评估牙周炎在所述患者中的存在。可选地，这个方面的方法包括另外的步骤：治疗该患者中的牙周炎。

在又一个方面中，本发明提供了一种检测人类患者中的游离型轻链λ蛋白质和/或游离型轻链κ蛋白质的方法，包括：

(a)从人类患者获得唾液样本；以及

(b)通过将所述样本与用于结合所述蛋白质的一个或多个检测试剂接触并且检测每个蛋白质与所述一个或多个检测试剂之间的结合来检测在所述样本中是否存在游离型轻链λ蛋白质和/或游离型轻链κ蛋白质。通常，存在能够结合游离型轻链λ蛋白质的第一检测试剂，第二检测试剂能够结合游离型轻链κ蛋白质。

附图说明

图1示意性地图示了用于在本公开中描述的方法中使用的系统。

具体实施方式

总的来说，本发明基于如下明智的洞悉：甚至单个蛋白质就能作为人类患者的唾液样本中的生物标记，用于识别牙周炎的存在或不存在。已经确定了两个蛋白质，它们能够被单独使用或组合使用以诊断牙周炎。

这些蛋白质是游离型轻链λ蛋白质和/或游离型轻链κ蛋白质。当使用单个生物标记蛋白质时，游离型轻链λ蛋白质是优选的。

当检测这两个蛋白质时，这两个蛋白质的和、比率、或它们之间的差可在某些实施例中被确定。所述和、比率和/或差可被可选地相互组合使用。例如，可根据一个实施例组合这两个链的比率与和，或者可在另一个实施例中组合所述比率和所述差。所述和、比率、差或它们的组合能可选地进一步与游离型轻链λ蛋白质和/或游离型轻链κ蛋白质的测量值组合。例如：κ/λ比率可被有用地与游离型轻链λ的测量值组合；κ/λ比率可被有用地与游离型轻链κ的测量值组合；或者κ/λ比率可被有用地与游离型轻链κ和游离型轻链λ的测量值组合。

对象的年龄可可选地被包括以作为额外的标记。

游离型轻链蛋白质是免疫球蛋白轻链。它们与免疫球蛋白重链不相关。不像典型的完整免疫球蛋白分子，游离型轻链蛋白质不是共价键连接到免疫球蛋白重链，即，游离型轻链不是二硫键结合到重链。通常，游离型轻链包括大约220个氨基酸。通常，游离型轻链蛋白质包括可变区(经常被称为轻链可变区域，vl)和恒定区(经常被称为轻链恒定区，cl)。人类产生两种类型的免疫球蛋白轻链，以字母κ和λ命名。这些轻链中的每一个都可被基于可变区中的变化进一步分成多个子组，共有四个κ子类型(vκ1、vκ2、vκ3和vκ4)和六个λ子类型(vλ1、vλ2、vλ3、vλ4、vλ5和vλ6)。游离型轻链κ通常是单体的。游离型轻链λ通常是二聚的，通过二硫键链接(到另一个游离型轻链λ)。已经识别出游离型轻链λ和游离型轻链κ的聚合物形式。这些游离型轻链由骨髓和淋巴结细胞产生以及局部地在牙周组织中由弥漫性淋巴细胞产生，并且迅速地被从血液中清除并且由肾脏分解代谢。单体游离型轻链在2-4小时内被清除，而二聚游离型轻链在3-6小时内被清除。

上面提到的这两种蛋白质是本领域已知的。本领域技术人员知道它们的结构，以及在水相样本中检测它们的方法，例如唾液样本。此后，上面提到的蛋白质生物标记被统称为“本发明的生物标记群组”。本发明的一个生物标记群组在一个实施例中由本发明中识别出的两个蛋白质生物标记组成，即游离型轻链λ和游离型轻链κ。除了本发明的生物标记群组之外，其它的生物标记和/或数据，比如人口数据(例如，年龄、性别)，可被包含在用于确定牙周炎类型的数据组中。

当可选地包括其它的生物标记时，生物标记的总数量(即，本发明的生物标记群组加上其它的生物标记)通常是3、4、5或6。

但是，本发明的期望优点是通过测量优选地不多于两个生物标记就能确定患者的牙周炎分类，其中由游离型轻链λ和游离型轻链κ两者组成的生物标记群组是优选的。尤其是，所述确定无需涉及使用其它数据，这有利地提供了简单且直接的诊断测试。

如所期望的，该方法仅要求从对象提取少量的唾液样本，例如，一滴大小。样本的大小将通常在从0.1μl到2ml的范围内，例如1-2ml，由此更小的量，例如0.1-100μl可被用于体外设备处理，并且由此提取更大的量，例如高达20ml，例如7.5-17ml，也是可行的。

该样本被输入到体外诊断设备中，该设备测量所涉及的一个或多个蛋白质的浓度，并且该设备返回诊断结果，该诊断结果基于具有牙周炎的可能性对对象进行分类。

本发明的易于使用将使得可以以定期方式(例如，作为定期牙科检查的一部分或者甚至是在家里)测试大多数的患有牙周炎或具有发展成牙周炎的高风险的牙科患者。这尤其允许在已经发展成牙周炎之后很快就检测到牙周炎的存在，并且因此使得能够进行更及时地采取口腔护理措施以防止牙周炎进一步发展。或者，例如，对于已知具有患牙周炎高风险并且首次接受测试的患者来说，该方法允许识别牙周炎是否已经发展。而且，该方法可在对之前被诊断患有牙周炎的患者进行治疗之后被施用，以检查牙周炎是否已经被成功地治疗。尤其是，该方法也适合于自我诊断，由此可由患者自己进行提取样本的步骤和将它输入到设备的步骤。

当执行本发明以确认是否存在牙周炎时，通常可能已知或怀疑患者具有牙周炎。因此在某些实施例中，该方法用于评估已知或怀疑具有牙周炎的患者是否具有牙周炎。

本发明的方法通常包括通过使用一个或多个检测试剂检测前述的构成本发明的生物标记群组的一个或多个蛋白质，以及可选的其它的生物标记蛋白质。

根据本发明被测试的“唾液”可以是未经稀释唾液，其可通过啐吐或擦拭来获得，或者是经稀释唾液，这可通过用流体漱口来获得。经稀释唾液的获得可通过患者用无菌水(例如5ml或10ml)或其它合适的流体漱口或对口部清洗几秒钟，然后吐到容器里。经稀释唾液有时可被称为口腔冲洗流体。

“检测”用于指对生物标记蛋白质的浓度的测量、量化、评分或测定。本领域中已知评估包括生物标记蛋白质在内的生物化合物的方法。认识到检测蛋白质生物标记的方法包括直接测量和间接测量。本领域技术人员将能够选择合适的测定特定生物标记蛋白质的方法。

与蛋白质生物标记相关的术语“浓度”被赋予其通常含义，即一定体积中的该蛋白质的丰度。蛋白质生物标记通常以质量每体积为单位被测量，最常见的是mg/ml，μg/ml或者ng/ml，但是有时也低至pg/ml。另外的测量值是摩尔浓度(或者摩尔浓度)，mol/l或“m”。该浓度可通过检测体积已知、被确定或预先确定的样本中的蛋白质量来确定。

代替确定浓度，可以确定样本中的蛋白质生物标记的绝对量，或者确定样本中的生物标记的质量分数，例如该生物标记相对于该样本中的全部其它蛋白质的总量的量。

“检测试剂”是特异性(或选择性地)与感兴趣的蛋白质生物标记结合、相互作用或检测该蛋白质生物标记的试剂或组合物。这种检测试剂可包括，但不限于，抗体、多克隆抗体或者优先结合蛋白质生物标记的单克隆抗体。

短语“特异性(或选择性地)结合”或“特异性(或选择性地)与……免疫反应”，当指检测试剂时，指的是能确定在各类蛋白质和其它生物制剂中存在蛋白质生物标记的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，规定的检测试剂(例如，抗体)以背景的至少两倍结合特定蛋白质并且基本不以显著量结合到样本中存在的其它蛋白质。在这种条件下的特异性结合可要求抗体依它对特定蛋白质的特异性而被选择。各种免疫测定设计可被用于选择与特定蛋白质进行特异性免疫反应的抗体。例如，固相elisa免疫测定(酶联免疫吸附测定)通常被用于选择与蛋白质进行特异性免疫反应的抗体(见，例如，harlow和lane,antibodies,alaboratorymanual(1988),foradescriptionofimmunoassayformatsandconditionsthatcanbeusedtodeterminespecificimmunoreactivity(对可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定计划和条件的描述))。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍并且更通常是背景的10倍以上至100倍。

“抗体”指的是基本上由一个或多个免疫球蛋白基因编码的多肽配体，或其片段，它特异性地结合并认出抗原表位(例如，抗原)。被认出的免疫球蛋白基因包括κ和λ轻链恒定区基因、alpha、gamma、delta、epsilon和mu重链恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。抗体存在例如以作为完整的免疫球蛋白或作为由利用各种肽酶的消化所产生的多个特征明显的片段。这包括例如fab’和f(ab)’2片段。术语“抗体”在本文中被使用时也包括由完整抗体的改变所产生的抗体片段或者使用重组dna方法重新合成的那些。它还包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。抗体的“fc”部分指的是免疫球蛋白重链的包括一个或多个重链恒定区结构域，ch1、ch2和ch3，但不包括重链可变区的那部分。抗体可以是双特异性抗体，例如具有特异性结合到第一抗原的第一可变区和特异性结合到第二不同的抗原的第二可变区的抗体。使用至少一个双特异性抗体可减少所需检测试剂的数量。

诊断方法的区别在于它们的敏感性和特异性。诊断测定的“敏感性”是患病人员测试呈阳性的百分比(“真阳性”的百分比)。未被所述测定检测出的患病人员是“假阴性”。没有患病且在测定中测试呈阴性的对象被叫做“真阴性”。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率被定义为那些没有患病却测试呈阳性的人员的比例。

本发明的生物标记蛋白质能够通过任何装置在样本中被检测到。用于生物标记检测的优选方法是基于抗体的测定、蛋白质阵列测定、基于质谱分析法(ms)的测定、和基于(近)红外光谱法的测定。例如，免疫测定，包括但不限于使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、elisa、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、荧光免疫测定等技术的竞争性和非竞争性测定系统。这些测定在本领域是常规的且公知的。下面仅简要描述了示例性的免疫测定(但是用于限定目的)。

免疫沉淀方案通常包括在裂解缓冲液(如补充有蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如edta，pmsf，抑肽酶，钒酸钠)的ripa缓冲液(1％np-40或tritonx-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％sds，0.15mnacl，0.01mph7.2的磷酸钠，1％抑肽酶))，向细胞裂解液中添加感兴趣的抗体，在4℃下培养一段时间(例如1-4小时)，将蛋白质a和/或蛋白质g琼脂糖珠添加到细胞裂解液中，在4℃下培养约一小时或更长时间，在裂解缓冲液中洗涤所述珠并将所述珠重新悬浮在sds/样本缓冲液中。抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如蛋白质印迹分析来评估。本领域技术人员将了解可以被修改以增加抗体与抗原的结合并降低背景的参数(例如，用琼脂糖珠预先清除细胞裂解物)。

蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如，根据抗原的分子量，8％-20％sds-page)中电泳蛋白质样品，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上例如硝酸纤维素、pvdf或尼龙，在封闭溶液(例如含3％bsa的pbs或脱脂牛奶)中封闭所述膜，在洗涤缓冲液(例如，pbs-tween20)中洗涤所述膜，用稀释在封闭缓冲液中的第一抗体(感兴趣的抗体)封闭所述膜，在洗涤缓冲液中洗涤所述膜，用偶联到酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)上的第二抗体(其识别所述第一抗体，例如抗人抗体)或稀释在封闭缓冲液中的放射性分子(例如32p或125i)封闭所述膜，在洗涤缓冲液中洗涤所述膜，并检测抗原的存在。本领域技术人员将能够认识到可以被修改以增加检测到的信号并减少背景噪声的参数。

elisa通常包括制备抗原(即，感兴趣的生物标记蛋白质或其片段)，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，添加与可检测化合物例如酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联的感兴趣抗体到所述孔并且培养一段时间，并检测抗原的存在。在elisa中，感兴趣抗体不必与可检测的化合物偶联；相反，可以将与可检测化合物偶联的第二抗体(其识别感兴趣抗体)添加到所述孔。此外，代替用抗原包被所述孔，可以将抗体包被到孔。在这种情况下，在将感兴趣抗原添加到经包被的孔之后，可以添加与可检测化合物偶联的第二抗体。本领域技术人员将能够了解可以被修改以增加检测到的信号的参数以及本领域已知的elisa的其他变型。

当使用多个标记时，基于这些生物标记的联合浓度确定阈值。当使用单个生物标记时，基于该生物标记的浓度确定阈值。该阈值确定患者是否被分类为患有牙周炎。本发明反映了这样的见解，即基于如上所述的单个生物标记或两种生物标记的组合的测量结果，可以以足够的准确性来检测牙周炎。

该见解支持本发明的另一方面，其是使用游离型轻链λ蛋白质和/或游离型轻链κ蛋白质作为人类患者唾液样本中的一个或多个生物标记，以评估患者是否患有牙周炎。

这种使用可实施在基本上如在上文和下文中描述的方法中。

当检测到游离型轻链λ和游离型轻链κ两者时，本发明的方法包括确定反映针对所述蛋白质测量的联合浓度的测试值。联合浓度值可以是通过输入确定的浓度和对该这些值的算术运算而获得的任何值。例如，这可以是浓度的简单相加。它还可以包括将每个浓度乘以反映这些浓度的期望权重的因子，然后将结果相加。它还可以涉及将浓度彼此相乘，或乘法、除法、减法、取幂和加法的任意组合。它可能进一步涉及求浓度的某次幂。在优选的实施例中，使用两种生物标记的和(κ+λ)。在其他优选的实施例中，使用两种生物标记的比率(例如κ/λ或λ/κ)。在其他实施方案中，使用两种生物标记之间的差(例如κ-λ或λ-κ)。

可选地，测试值反映与对象的年龄组合的针对所述蛋白质确定的联合浓度的浓度。

将得到的联合浓度值与阈值进行比较，该阈值以相同的方式反映与牙周炎的存在相关的联合浓度。所述比较允许评估测试值是否指示其唾液接受测试的患者中牙周炎的存在。

阈值可以例如是浓度或联合浓度值，其是基于在与牙周炎的存在相关的参考样本中针对相同蛋白质确定的浓度以相同方式获得的，即在被诊断患有牙周炎的患者中。通常，由此反映相同或更高联合浓度的值指示受测患者中牙周炎的存在。类似地，反映被测牙周炎患者的唾液中较低的联合浓度的值表明牙周炎不存在。但是，应当理解，也可以计算阈值(例如，通过使用负乘数)，使得指示牙周炎的测试值将低于阈值，而指示不存在牙周炎的测试值将高于该阈值。

阈值还可以基于测量一组样本中目前生物标记蛋白质的浓度来确定，所述样本包括具有牙周炎和“非”牙周炎的已知诊断的患者。由此，可以对所测得的浓度值进行统计分析，可能包括机器学习方法，以允许以期望的敏感性和特异性来区分被分类为牙周炎的患者和被分类为不患有牙周炎的患者。由此，可以获得期望的阈值。基于该阈值，可以对待测样本进行相同的浓度测量，然后以与获得阈值相同的方式处理浓度值，从而确定联合浓度值，可以将该联合浓度值与所述阈值进行比较，从而允许将被测试样本分类为患有牙周炎或不患有牙周炎。

在一个有趣的实施例中，如下以得分数的形式获得浓度或联合浓度值。数值(蛋白质浓度值，以例如ng/ml为单位)被分配给每个测量结果，并且这些值以线性或非线性组合被使用以计算零和一之间的得分数。在如上所述基于一组对象确定阈值的情况下，通常使用将联合浓度作为输入的s型函数来计算0到1之间的得分数(如进一步所示)。

当得分数超过某个阈值时，该方法表明患者患有牙周炎。该阈值可以基于期望的敏感性和特异性来选择。

应当理解，根据本发明，在对对象进行“牙周炎分类”时，这是在可被认为具有患牙周炎风险或患有牙周炎的对象上进行的。这可以是从例如先前进行过的牙周炎诊断已知的，尽管该诊断可能不能区分牙周炎的程度，或者例如是根据对象的口腔健康状况记录认为的。

本领域承认的临床定义基于以下内容：

牙龈指数(gi)

将基于在0到4尺度上分级的lobene改良牙龈指数(mgi)记录全口牙龈指数，其中：

0＝无炎症，

1＝轻度炎症；边缘或乳突状牙龈单位的任一部分而不是全部出现颜色略有变化肌理略有变化，

2＝轻度炎症；但涉及整个边缘或乳突状单位，

3＝中度炎症；边缘或乳突状单位的发亮、发红、水肿和/或肥大，

4＝严重炎症；边缘或乳突状牙龈单位明显发红、水肿和/或肥大，自发性出血、充血或溃疡。

探测深度(pd)

将使用手动unc-15牙周探针将探测深度记录到最接近的毫米。探测深度是指从探针尖端(假设位于袋底部)到自由牙龈边缘的距离。

牙龈退缩(rec)

将使用手动unc-15牙周探针将牙龈退缩记录到最接近的毫米。牙龈退缩是指从自由牙龈边缘到牙骨质-牙釉质结合处的距离。牙龈退缩将以正数来表示，而牙龈过度生长将以负数来表示。

临床附着丧失(cal)

临床附着丧失将被计算为每个部位的探测深度+退缩之和。

探测出血(bop)

探测后，针对探测出血对每个部位进行评估，如果在探测的30秒内发生出血，则将给该部位赋予1分，否则将赋予0分。

所得到的对象组(患者组)定义如下，其中轻度-中度牙周炎和晚期牙周炎组是与本发明相关的“牙周炎”：

-健康组(h)：所有部位的pd≤3mm(但将允许在最后的恒磨牙的远侧有最多四个4mm的袋)，没有部位出现邻间附着丧失，≤10％部位中出现gi≥2.0，％bop得分数≤10％；

-牙龈炎组(g)：>30％的部位中出现gi≥3.0，没有部位出现邻间附着丧失，没有部位出现pd>4mm，％bop得分数>10％；

-中度-轻度牙周炎组(mp)：≥8颗牙齿处的邻间pd为5-7毫米(相当于大约2-4毫米cal)，％bop得分数>30％；

-晚期牙周炎组(ap)：≥12颗牙齿处的邻间pd≥7mm(相当于大约≥5mmcal)，％bop得分数>30％。

在一个实施例中，本发明的方法利用如图1中示意性表示的系统。该系统可以是具有集成在其中的各种设备部件(单元)的单个装置。该系统还可以将其各种部件或这些部件中的一些作为单独的装置。图1所示的部件是测量设备(a)、图形用户界面(b)和计算机处理单元(c)。

如上所述，本发明的系统包括到界面的数据连接，由此该界面本身可以是系统的一部分或可以是远程界面。后者是指使用不同的装置(优选是手持装置，例如智能手机或平板电脑)提供实际界面的可能性。在这些情况下，数据连接将优选地涉及无线数据传输，例如通过wi-fi或蓝牙，或通过其他技术或标准。

测量设备(a)被构造为例如通过将唾液滴放在筒(a1)上来接收唾液样本，该筒可以被插入到设备(a)中。该设备可以是能够根据相同的唾液样本确定游离型轻链λ蛋白质和游离型轻链κ蛋白质中至少一个的浓度的现有设备。

测量设备(a)应该能够接收唾液样本，例如通过将唾液滴放在筒(a1)上，该筒可被插入到设备(a)中。该设备可以是能够根据相同的唾液样本确定游离型轻链λ蛋白质和游离型轻链κ蛋白质中至少一个的浓度的现有设备。

处理单元(c)从部分(a)接收蛋白质浓度的数值。单元(c)设有软件(通常为嵌入式软件)，该软件允许单元(c)计算介于0和1之间的得分数(s)。该软件还包括用于阈值(t)的数值。如果计算值(s)超过(t)，则单元(c)将向gui(b)输出“牙周炎”的指示(i)，否则它将输出“无牙周炎”。另一实施例可以使用(s)的特定值来指示做出指示(i)的确定性。这可以是可能性得分数，由此0.5是可能的阈值，例如得分数s＝0.8将表明牙周炎的可能性。有趣的选项是：

基于得分数s，可以直接指示确定性，即s＝0.8表示牙周炎的确定性为80％；或者

为了通过范围为r1-r2的定义做出指示，使得当r1<s<r2时，指示(i)将读作“不确定”。

得分数的具体计算可以例如通过使用以下公式的s型函数来实施：

其中n是所使用的蛋白质/生物标记的数量。c0、c1等是系数(数值)，并且b1、b2等是相应的蛋白质浓度。

系数的确定可以通过训练过程来完成：

-选择n1名患有牙周炎的对象(由牙医根据当前标准确定)和n2名没有牙周炎的对象(具有健康的齿龈或牙龈炎)。

-从每个对象获取唾液样本，并如上所述地确定生物标记组合的蛋白质浓度。

-对于牙周炎，将得分数s定义为1，而对于无牙周炎，将得分数定义为0。

-将s型函数应用到该得分数和蛋白质浓度值。

可以使用其他回归或机器学习方法(线性回归、神经网络、支持向量机)，其中对牙周炎患者而言得分数s高而对于无牙周炎对照者得分数s低。

参考前述系统，在另一方面，本发明还提供一种用于评估人类患者是否患有牙周炎的系统，该系统包括：

-能够并且适于检测人类患者的唾液样本中的游离型轻链κ蛋白质和/或游离型轻链λ蛋白质的检测装置；如上所述，这样的装置是已知的，并且对于本领域技术人员而言是容易获得的；通常，提供一种用于在其中接收对象的口腔样本的容器，该容器设置有该检测装置。

-能够并适于从确定的所述蛋白质的浓度中确定患者患有牙周炎的指示的处理器。

-可选地，该系统包括能够呈现信息的用户界面(或到远程界面的数据连接)，特别是图形用户界面(gui)；gui是一种用户界面，它允许用户通过图形图标和可视指示符(例如辅助符号)与电子设备进行交互，代替基于文本的用户界面、键入的命令标签或文本导航(这些界面类型没有一个在本发明中被排除)；gui是众所周知的，并且通常用于手持移动设备中，例如mp3播放器、便携式媒体播放器、游戏设备、智能手机以及较小的家庭、办公室和工业控制装置中；如上所述，该界面可选地还可以被选择为能够输入信息，例如对象的年龄、性别、bmi(体重指数)。

本发明还单独地或作为前述系统的一部分提供了一种试剂盒，其用于检测人类患者唾液样本中的牙周炎的至少一个生物标记，所述试剂盒包括一个或多个用于检测游离型轻链κ蛋白质和/或游离型轻链λ蛋白质的检测试剂。通常，该试剂盒包括两个检测试剂，每一个针对不同的生物标记，其中第一个检测试剂能够结合游离型轻链κ蛋白质，第二个检测试剂能够结合游离型轻链λ蛋白质。如以上参考本发明的方法所讨论的，试剂盒可以包括更多的检测试剂，例如用于其他蛋白质的试剂。在一个优选的实施例中，试剂盒中可用的检测试剂由用于构成本发明的2-生物标记群组的所选两种蛋白质的检测试剂组成，如所提及的。

优选地，所述试剂盒包括固体支撑件，例如芯片、微量滴定板或包含所述检测试剂的珠或树脂。在一些实施例中，试剂盒包括质谱探针，例如proteinchip^tm。

试剂盒还可提供专门针对未结合的检测试剂或所述生物标记的洗涤溶液和/或检测试剂(三明治型测定)。

在一个有趣的方面，本发明的生物标记群组的识别被应用于随时间监测人类患者中牙周炎的状态。因此，本发明还提供了一种体外方法，其用于确定在从第一时间点t1到第二时间点t2的时间间隔内患有牙周炎的人类患者中牙周炎的状态变化，该方法包括在在t1时从所述患者获得的至少一个唾液样本中和在在t2时从所述患者获得的至少一个唾液样本中，检测游离型轻链κ蛋白质和/或游离型轻链λ蛋白质的浓度，并比较该浓度，从而优选至少一个浓度的，并且更优选两个浓度的差异反映状态的变化。可以将该差异视为浓度差，从而无需首先生成0到1之间的数字或任何其他分类即可进行直接比较。将理解的是，在两个时间点接收的测量结果也可以以与如上确定牙周炎状态时所采用的完全相同的方式被处理。

本发明还提供了一种诊断人类患者是否患有牙周炎的方法，其包括在人类患者的唾液样本中检测游离型轻链κ蛋白质和/或游离型轻链λ蛋白质。通常基于所述样本中所述蛋白质的浓度评估患者中牙周炎的存在。可选地，该方面的方法包括另一个步骤：治疗患者的牙周炎。该可选的治疗步骤可包括施用已知的治疗剂或牙科程序，或治疗剂与牙科程序的组合。已知的治疗剂包括施用含抗菌剂，例如漱口剂、碎屑、凝胶或微球。用于治疗牙周炎的典型抗菌剂是洗必泰。其他治疗剂包括抗生素，通常是口服抗生素，以及酶抑制剂，例如强力霉素。已知的非手术治疗程序包括洗牙和根部平整(srp)。已知的外科手术程序包括通过手术的袋减少、皮瓣手术、齿龈移植或骨移植。

本发明还提供了一种在人类患者中检测游离型轻链κ蛋白质和/或游离型轻链λ蛋白质的方法，包括：

(a)从人类患者获取唾液样本；和

(b)通过使所述样本与一个或多个用于结合所述蛋白质的检测试剂接触并检测每种蛋白质与所述一个或多个检测试剂之间的结合来检测该样本中是否存在游离型轻链κ蛋白质和/或游离型轻链λ蛋白质。

将参考以下非限制性示例进一步说明本发明。

示例

对153名具有不同牙周健康状况的对象进行了临床研究(通过牙科专家根据当前标准(例如美国牙周病学会标准)进行临床评估确定)。其中39个对象具有健康齿龈(h)，35个对象被诊断为牙龈炎(g)，41个对象被诊断为轻度牙周炎(mp)，而38个对象被诊断患有晚期牙周炎(ap)，在两个独立的临床地点进行了重复临床访问后，获得了roc(接受者-操作者-特征)曲线下面积(auc)值。

通过带有留一法交叉验证(loocv)的逻辑回归评估了各种生物标记组合的性能，得到了本文所解释的优选生物标记组合。

在统计中，接受者操作特征曲线或roc曲线是一个图形图，它说明了二进制分类器系统随着其判别阈值变化时的性能。通过在各种阈值设置下对比绘制真阳性率(tpr)与假阳性率(fpr)而建立曲线。真阳性率也称为机器学习中的敏感性、查全率或检测可能性。假阳性率也称为误检或错误报警可能性，并且可以计算为(1-特异性)。因此，roc曲线是作为误检的函数的敏感性。通常，如果已知用于检测和错误报警二者的可能性分布，则可以通过在y-轴上绘制检测可能性的累积分布函数(从-∞到判别阈值的可能性分布下的区域)，相对地在x-轴上绘制错误报警可能性的累积分布函数来生成roc曲线。测试的准确性取决于测试以何种程度将被测试组分为有和没有相关疾病的人。精度由roc曲线下的面积测量。面积为1代表完美的测试；面积为0.5表示毫无意义的测试。对诊断测试的准确性进行分类的指南是传统的学术评分系统：

-0.90-1＝优(a)

-0.80-0.90＝良(b)

-0.70-0.80＝中(c)

-0.60-0.70＝差(d)

-0.50-0.60＝不及格(f)

基于前述，在上述临床研究的结果中，高于0.75的rocauc值根据本发明被认为是代表提供诊断测试的期望准确性。

下面的表1指示了使用要求保护的群组生物标记获得的用于检测牙周炎的>0.8的接受者操作者特征曲线下面积值。

该表中给出的生物标记蛋白质是flcκ、flcλ、比率κ/λ、和κ+λ、以及差κ–λ。

在该表中，可以看出在rocauc方面最大的结果0.847是通过由比率κ/λ、和κ+λ以及年龄组成的生物标记群组获得的。与此接近的结果，即0.835，是通过flcκ、flcλ、比率κ/λ以及年龄获得的。也通过flcλ、比率κ/λ和年龄获得了0.835。对于多个其它的标记也报告了高于0.8的得分数，这些标记包括仅有flcλ。

表1

这个表示出了flc生物标记群组(可选地加上作为标记的年龄)在借助逻辑回归将牙周炎和非牙周炎分类方面的表现。

在标记κ和λ之后，考虑了额外的预测因素κ+λ、κ-λ、κ/λ。在该表中没有示出冗余的群组。术语“冗余”在这里反映的事实是：包括例如κ+λ和κ-λ作为预测因素的群组——在逻辑回归中——给出了和包括κ和λ作为预测因素的对应群组相同的结果。

用斜体指明的群组由于较低的相对表现不是优选的。所有的其他群组示出了带有>0.75的aucloocv的可接受的表现(对于大多数群组aucloocv>0.8)。

虽然已经在附图中和前面的描述中详细地图示和描述了本发明，但是这种图示和描述应被认为是说明性的或示例性的而非限制性的；本发明不限于所公开的实施例。例如，可以在不同的单元中提供用于不同生物标记的检测试剂。或者，方便地，本发明的试剂盒可包括固定的一组用于在全部实施例中使用的蛋白质生物标记(即，游离型轻链κ蛋白质和/或游离型轻链λ蛋白质)的检测试剂，和包括用于其他生物标记的检测试剂的可选的灵活模块。

本领域技术人员在实施要求保护的发明时，通过研究附图、公开内容、和所附权利要求，可理解并实现对所公开实施例的其他变型。在权利要求中，词语“包括”不排除其他的元件或步骤，而不定冠词“一”或“一个”不排除多个。仅仅本发明的某些特征被记载在互不相同的从属权利要求中这个事实不说明不能有利地使用这些特征的组合。权利要求中的任何附图标记都不应被理解为限制范围。

总之，发明人由此公开了用于评估人类患者是否患有牙周炎的体外方法。该方法基于洞察力来确定生物标记蛋白质。因此，在来自患者的唾液样本中，测量游离型轻链κ蛋白质和/或游离型轻链λ蛋白质的浓度。基于测量的浓度，确定反映所述蛋白质的浓度或联合浓度的值。将这个值与以相同方式反映与牙周炎相关的浓度或联合浓度的阈值比较。该比较允许评估测试值是否指示所述患者中存在牙周炎。由此，通常，反映在所述阈值所反映的浓度或联合浓度之下的浓度或联合浓度的测试值指示在所述患者中不存在牙周炎，而反映所述阈值所反映的浓度或联合浓度或在其之上的浓度或联合浓度的测试值指示在所述患者中的牙周炎。