牙周疾病诊断方法、用途和试剂盒与流程

本发明属于口腔护理领域，并且涉及牙周疾病的基于唾液的诊断。特别地，本发明涉及用于区分健康牙龈、牙龈炎、轻度牙周炎以及重度牙周炎的状态的试剂盒、用途和方法。

背景技术：

牙龈炎症或牙龈炎是一种主要由牙科细菌膜或牙菌斑附着到牙齿表面引起的非破坏性牙周疾病。如果不进行检测和治疗，可逆性牙龈炎通常会导致牙齿周围组织(即，牙周组织)发炎，这种情况被定义为牙周炎，这种情况是不可逆转的并且导致组织破坏和牙槽骨缺失，最终导致牙齿脱落。在牙龈疾病的进展期间，通常会有与其相关联的临床体征和症状，诸如牙龈肿胀、颜色由粉红色变为深红色、牙龈出血、口臭、以及牙龈变得越来越触痛或疼痛。

牙周炎是一种由口腔微生物引起的慢性多因素炎性疾病，其特征在于逐渐破坏硬组织(骨骼)和软组织(牙周膜)，最终导致牙齿活动和脱落。这与牙龈炎有所区别，牙龈炎是牙龈组织的可逆性感染和炎症。炎性牙周炎是最普遍的慢性人类疾病之一，并且是成年牙齿脱落的主要原因。除了牙周炎对口腔健康的重大负面影响之外，还有越来越多的证据表明，牙周炎具有全身性后果，并且是几种全身性疾病的风险因子，包括心脏病(例如，动脉粥样硬化、中风)、糖尿病、妊娠并发症、类风湿关节炎、以及呼吸道感染。

因此，从口腔健康和整体健康两者的角度出发，对牙周疾病进行早期准确的诊断很重要。

在一般的牙科实践中，牙周疾病的诊断仍然较差，导致治疗干预率相对较低以及还有大量未得到治疗的病例。当前诊断依赖于牙科专业人员对口腔组织状况(颜色、肿胀、探诊时出血程度、探诊牙周袋深度；以及口腔x射线造成的骨骼缺失)进行的不太精确的主观临床检查。这些传统方法很费时，并且所使用的技术中的一些技术(牙周袋深度、x射线)反映历史事件，诸如过去的疾病活动，而非当前的疾病活动或对其他疾病的易感性。因此，期望准确的更客观更快且更易于使用的诊断，优选地，该诊断还可以由非专业人员执行。因此，期望测量当前的疾病活动，还可能测量受试者对其他牙周疾病的易感性。

长期以来，唾液或口腔流体一直作为口腔和一般疾病的诊断流体，并且随着微型生物传感器(也称为芯片实验室)的出现，用于快速椅旁测试的护理点诊断获得了更大的科学和临床兴趣。尤其是对于牙周疾病的检测，与组织炎症和分解相关联的炎症生物标志物可能会由于邻近而容易在唾液中终止，这表明唾液具有用于牙周疾病检测的强大潜力。因此，实际上，该领域获得了极大的兴趣，并且已经出现了令人鼓舞的结果。例如，ramseier等人(jperiodontol.2009年3月；80(3)：436-46)标识了与牙周疾病相关的宿主来源的生物标志物和细菌来源的生物标志物。然而，尚未出现确切测试。

生物标志物表示支持临床表现的生物学指标，因此是诊断牙周疾病的临床预后的客观度量。最终，可以利用经验证的生物标志物来评估未来疾病的风险，以便在最早阶段标识疾病，标识对初始治疗的反应，以及允许实现预防策略。

开发唾液生物标志物的护理点测试的先前限制包括缺乏适用于椅旁应用的技术以及无法分析各个样品中的多种生物标志物。此外，文献中也没有充分解决要在这种测试中包括哪些多种生物标志物的选择，也没有在实际测试中实现。

而且，牙周炎本身可以在范围从疾病的轻度形式到重度形式的全部严重程度中表现出来。为了轻松评估状况的严重程度，牙医通常将患有牙周炎的患者分为两组，即，患有轻度牙周炎的患者以及患有重度牙周炎的患者。然而，进行这种评估的可用方法牵涉到劳动密集型过程，即，牙医不会对每个患者和/或每次拜访例行执行这种过程，而且消费者(自我诊断)也无法执行这种过程。

期望提供一种更简单的过程，特别是一种仅需要从患者获取少量唾液样品的过程，还可能是一种由患者本人获取少量唾液样品的过程。期望将这种样品录入体外诊断设备中，该设备允许基于测量对唾液样品进行分类，使得它可以返回患者被分类为具有健康口腔或患有牙龈炎、轻度牙周炎或重度牙周炎的可能性的指示。

技术实现要素：

为了更好地满足上述需求，在一个方面中，本发明涉及一种用于评估人类患者无牙周疾病、患有牙龈炎、患有轻度牙周炎、还是患有重度牙周炎的体外方法，该方法包括：在来自所述人类患者的唾液的样品中检测蛋白质的浓度，该蛋白质是基质金属蛋白酶9(mmp-9)和s100钙结合蛋白a8(s100a8)中的至少一项、α1-酸糖蛋白(a1agp)、以及丙酮酸激酶(pk)；确定至少一个测试值，该至少一个测试值反映针对所述蛋白质所确定的联合浓度；以及评估所述至少一个测试值是否指示所述患者没有牙周疾病、患有牙龈炎、患有轻度牙周炎、或患有重度牙周炎。

在另一方面中，本发明提出了一种蛋白质的用途，所述蛋白质是人类患者的唾液样品中的基质金属蛋白酶9(mmp-9)和s100钙结合蛋白a8(s100a8)中的至少一项、α1-酸糖蛋白(a1agp)和丙酮酸激酶(pk)，所述蛋白质作为用于评估患者无牙周疾病、患有牙龈炎、患有轻度牙周炎、还是患有重度牙周炎的生物标志物。可选地，患者的年龄也用作生物标志物。

在又一方面中，本发明在于一种系统，该系统评估人类患者无牙周疾病、患有牙龈炎、患有轻度牙周炎、还是患有重度牙周炎，该系统包括：

-检测部件，能够并且适于在人类患者的唾液样品中检测蛋白质，所述蛋白质是基质金属蛋白酶9(mmp-9)和s100钙结合蛋白a8(s100a8)中的至少一项、α1-酸糖蛋白(a1agp)和丙酮酸激酶(pk)；以及

-处理器，能够并且适于从所述蛋白质的所确定的浓度来确定患者无牙周疾病、患有牙龈炎、患有轻度牙周炎、还是患有重度牙周炎的指示。

该系统可选地包含到接口(特别是图形用户接口)的数据连接，该接口能够呈现信息，优选地还能够输入信息，所述接口是系统的一部分或远程接口。

可选地，使得前述项中的一项或多项(特别是处理器)能够“在云中”运行，即，不是在固定的机器上运行，而是借助于基于互联网的应用来运行。

在再一方面中，本发明提供了一种试剂盒，用于在人类患者的唾液样品中检测针对牙周疾病的至少三个生物标志物，所述试剂盒包含一种或多种(通常为三种)检测试剂，该检测试剂用于检测基质金属蛋白酶9(mmp-9)和s100钙结合蛋白a8(s100a8)中的至少一项、α1-酸糖蛋白(a1agp)、丙酮酸激酶(pk)。通常，使用三种或更多种检测试剂，每种检测试剂结合不同的生物标志物。在一个实施例中，第一检测试剂能够结合a1agp，第二检测试剂能够结合pk，并且第三检测试剂能够结合s100a8和mmp-9之一。

在再又一方面中，本发明提供了一种体外方法，用于确定在从第一时间点t1到第二时间点t2的时间间隔内人类患者的牙周疾病状态的改变，该方法包括：在t1时从所述患者获得的至少一个唾液样品和在t2时从所述患者获得的至少一个唾液样品中，检测蛋白质的浓度，所述蛋白质是s100a8和mmp-9中的至少一项、a1agp、pk；以及比较所述浓度，从而所述浓度中的任一个、两个或三个浓度的差异反映状态的改变。通常，所述浓度中的三个浓度的差异反映状态的改变。

在另一方面中，本发明提供了一种诊断人类患者无牙周疾病、患有牙龈炎、患有轻度牙周炎、还是患有重度牙周炎的方法，该方法包括：在人类患者的唾液样品中检测蛋白质，所述蛋白质是基质金属蛋白酶9(mmp-9)和s100钙结合蛋白a8(s100a8)中的至少一项、α1-酸糖蛋白(a1agp)和丙酮酸激酶(pk)；以及基于所述样品中的所述蛋白质的浓度，评估患者是否患有牙龈炎、轻度牙周炎或重度牙周炎。可选地，该方面的方法包括另一步骤：治疗患者的牙周炎。

在再另一方面，本发明提供了一种在患有牙龈炎、轻度牙周炎或重度牙周炎的人类患者中检测蛋白质的方法，所述蛋白质是基质金属蛋白酶9(mmp-9)和s100钙结合蛋白a8(s100a8)中的至少一项、α1-酸糖蛋白(a1agp)和丙酮酸激酶(pk)，该方法包括：

(a)从人类患者获取唾液样品；以及

(b)通过使样品与用于结合所述蛋白质的一种或多种检测试剂接触，并且检测每种蛋白质与一种或多种检测试剂之间的结合，来检测样品中是否存在基质金属蛋白酶9(mmp-9)和s100钙结合蛋白a8(s100a8)中的至少一项、α1-酸糖蛋白(a1agp)和丙酮酸激酶(pk)。通常，第一检测试剂能够结合a1agp，第二检测试剂能够结合pk，并且第三检测试剂能够结合mmp-9和s100a8之一。

附图说明

图1示意性地表示用于如本公开中所描述的方法的系统。

图2是用于牙周疾病的各个阶段的分类方案的示例。

图3是用于牙周健康分类的决策树方法的示例。

具体实施方式

在一般意义上，本发明基于明智的见解，即，在人类患者的唾液样品中，少有的三种蛋白质可以用作生物标志物，用于将患者的牙周疾病状态分为以下四类之一：第一类是没有牙周疾病；第二类是牙龈炎；第三类是轻度牙周炎或中度牙周炎(除非另有说明，否则术语“轻度牙周炎”在此前后均应包括中度牙周炎，而不包括重度牙周炎)；以及第四类是重度牙周炎。

在下文中，将第三类统称为轻度牙周炎。

因此，本发明可以区分：健康口腔，其无需治疗牙周疾病；牙龈炎，其允许在发展到牙周炎之前及时进行干预以逆转其影响；轻度牙周炎，其指示需要治疗；或重度牙周炎，其指示急需明显治疗。

生物标志物蛋白质是基质金属蛋白酶9(mmp-9)和s100钙结合蛋白a8(s100a8)中的一项或两项、α1-酸糖蛋白(a1agp)、以及丙酮酸激酶(pk)。可选地，可以包括受试者的年龄来作为附加标志物。

α1-酸糖蛋白(a1agp)是主要由肝脏合成的血浆α-球蛋白糖蛋白。它有时也被称为血清类粘蛋白。它用作血液中的转运蛋白，充当碱性亲脂性化合物和电中性亲脂性化合物的载体。它还应当认为调节血细胞与内皮细胞之间的相互作用。

丙酮酸激酶催化糖酵解的最后一步。丙酮酸激酶有四种组织特异性同工酶，每种组织特异性同工酶具有不同组织所需的特定动力学特性。

s100钙结合蛋白a8是钙结合蛋白和锌结合蛋白，它在调节炎症过程和免疫反应中发挥重要作用。它可以诱导中性粒细胞趋化性和粘附。

mmp是负责降解诸如胶原蛋白、蛋白聚糖、层粘连蛋白、弹性蛋白和纤连蛋白之类的细胞外基质成分的酶家族。在生理条件和病理条件下，它们在牙周韧带(pdl)重塑中都发挥着重要作用。mmp-9(也称为92kdaiv型胶原酶、92kda明胶酶、或明胶酶b(gelb))是一种基质素，属于参与降解细胞外基质的锌金属蛋白酶家族的一类酶。

上文所提及的四种蛋白质在本领域中是已知的。技术人员知道它们的结构以及在诸如唾液样品之类的含水样品中检测它们的方法。在下文中，将上述蛋白质生物标志物统称为“本发明的生物标志物组”。在一个实施例中，本发明的生物标志物组可以由本发明中所标识的四种蛋白质生物标志物组成，即，a1agp、pk、mmp-9、以及s100a8。优选地，本发明的生物标志物组由本发明中所标识的蛋白质生物标志物中的不超过三种蛋白质生物标志物组成，即，a1agp、pk、以及mmp-9；或a1agp、pk、以及s100a8。除了本发明的生物标志物组外，诸如人口统计数据(例如，年龄、性别)之类的其他生物标志物和/或数据也可以被包括在用于确定牙周炎类型的数据集合中。其他生物标志物包括以下蛋白质中的一种或多种蛋白质：基质金属蛋白酶8(mmp-8)、白介素-1β、游离轻链κ、游离轻链λ、血红蛋白β、血红蛋白δ、以及肝细胞生长因子(hgf)。

优选扩展生物标志物组如下：

a1agp+pk+mmp-9+mmp-8

a1agp+pk+mmp-9+il-1β

a1agp+pk+mmp-9+游离轻链κ

a1agp+pk+mmp-9+游离轻链λ

a1agp+pk+mmp-9+血红蛋白β

a1agp+pk+mmp-9+血红蛋白δ

a1agp+pk+s100a8+mmp-8

a1agp+pk+s100a8+肝细胞生长因子

a1agp+pk+s100a8+il-1β

当可选地包括其他生物标志物时，生物标志物的总数目(即，本发明的生物标志物组加上其他生物标志物)通常为4、5或6。

然而，本发明的理想优点在于，可以通过使用优选的生物标志物组“mmp-9或s100a8之一、a1agp以及pk”来优选地测量不超过四个生物标志物并且更优选地仅测量三个生物标志物来确定患者的牙周疾病的分类。特别地，该确定不需要牵涉到其他数据的使用，这有利地提供了简单直接的诊断测试。

根据需要，该方法仅需要从受试者获取少量唾液样品，例如，水滴般大小。样品的大小的范围通常为0.1μl至2ml，诸如1ml至2ml，由此较小的量(例如，0.1μl至100μl)可以用于体外设备处理，并且由此可以获取较大的样品，诸如高达20ml，诸如7.5ml至17ml。

该样品进入体外诊断设备中，该体外诊断设备测量所牵涉的至少三种蛋白质的浓度，并且返回诊断结果，从而基于没有牙周疾病、患有牙龈炎、患有轻度牙周炎或患有重度牙周炎的可能性，对受试者进行分类。

本发明的易用性使得可以定期(例如，作为定期牙齿检查的一部分或甚至居家)对大多数牙齿患者或发展为牙周疾病的风险高的患者进行测试。这尤其可以检测到牙龈炎的存在，或在其进行到重度牙周炎之前检测到轻度牙周炎的存在，从而使得能够更及时地采取口腔护理措施以防止牙周炎发展或进展。或者，例如，对于已知处于牙周炎高风险并且首次进行测试的患者，该方法可以标识牙周炎是轻度还是重度。此外，该方法可以在治疗先前被诊断为重度牙周炎的患者之后应用，以便检查牙周炎是否已经改善从而变为轻度。同样，该方法可以在对先前被诊断为轻度牙周炎的患者进行治疗之后应用，以便检查牙周疾病是否已经改善从而变为牙龈炎。评估患者是否“健康”(即，没有牙周疾病(牙龈炎、轻度牙周炎和重度牙周炎))的能力有助于例如确认患者当前的口腔护理程序是否令人满意。特别地，该方法也适用于自我诊断，由此可以由患者本人获取样品并且将其录入到设备中的步骤。

当实施本发明时，通常可能已知患者患有牙周疾病。当实施本发明以确定牙周炎是轻度还是重度时，通常可能已知患者患有牙周炎。因此，在某些实施例中，该方法用于评估已知患有牙周炎的人类患者是患有轻度牙周炎还是重度牙周炎。

本发明的方法通常包括：通过使用一种或多种检测试剂来检测构成本发明的生物标志物组的上述至少三种蛋白质以及可选的其他生物标志物蛋白质。

根据本发明测试的“唾液”可以是未稀释的唾液，该唾液可以通过口吐或擦拭来获得；或者可以是稀释的唾液，该唾液可以通过用流体冲洗口腔来获得。稀释的唾液可以通过以下方法获得：患者用无菌水(例如，5ml或10ml)或其他合适的流体冲洗或清洗口腔几秒钟，然后吐入容器中。稀释的唾液有时可以称为口腔冲洗流体。

“检测”意指测量、定量、计分或测定生物标志物蛋白质的浓度。评价包括生物标志物蛋白质的生物化合物的方法在本领域中是已知的。应当认识到，检测蛋白质生物标志物的方法包括直接测量和间接测量。本领域技术人员能够选择测定特定生物标志物蛋白质的适当方法。

相对于蛋白质生物标志物的术语“浓度”要被赋予其一般含义，即，一定体积中蛋白质的丰度。蛋白质浓度通常以每体积质量进行测量，最通常为mg/ml或μg/ml，但有时低至pg/ml。备选度量为摩尔浓度(或摩尔浓度)，mol/l或“m”。浓度可以通过检测已知、确定或预先确定的体积的样品中蛋白质的量来确定。

确定浓度的备选方法是要确定样品中蛋白质生物标志物的绝对量，或确定样品中生物标志物的质量分数，例如，相对于样品中所有其他蛋白质总数的生物标志物量。

“检测试剂”是与感兴趣蛋白质生物标志物特异性地(或选择性地)结合、与该感兴趣蛋白质生物标志物相互作用或检测该感兴趣蛋白质生物标志物的试剂或化合物。这样的检测试剂可以包括但不限于优先结合蛋白质生物标志物的抗体、多克隆抗体、或单克隆抗体。

术语“牙周疾病”是指牙龈炎和牙周炎(轻度和重度)。没有牙周疾病的患者被认为是健康的。

当涉及检测试剂时，短语“特异性地(或选择性地)结合”或“与……特异性地(或选择性地)免疫反应”是指一种结合反应，其决定了蛋白质生物标志物在蛋白质和其他生物制剂的蛋白质异质群体中的存在。因此，在指定的免疫测定条件下，指定检测试剂(例如，抗体)与特定蛋白质的结合至少是背景的两倍，并且基本上不与样品中存在的其他蛋白质大量结合。这种条件下的特异性结合可能需要选择针对特定蛋白质具有特异性的抗体。多种免疫测定形式可以用于选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规使用固相elisa免疫测定法(酶联免疫吸附测定法)来选择与蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(参见例如，harlow&lane,antibodies,alaboratorymanual(1988),foradescriptionofimmunoassayformatsandconditionsthatcanbeusedtodeterminespecificimmunoreactivity)。通常，特异性或选择性反应至少是背景信号或噪声的两倍，更通常是背景的10到100倍。

“抗体”是指基本上由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体，其特异性结合并且识别表位(例如，抗原)。识别的免疫球蛋白基因包括κ和λ轻链恒定区基因，α、γ、δ、ε和μ重链恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。抗体例如作为完整的免疫球蛋白存在或作为使用各种肽酶进行消化所产生的若干个特征明确的片段存在。这包括例如fab'片段和f(ab)'2片段。如本文中所使用的，术语“抗体”还包括通过修饰整个抗体所产生的抗体片段或使用重组dna方法从头合成的抗体片段。它还包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或单链抗体。抗体的“fc”部分是指免疫球蛋白重链的包括一个或多个重链恒定区结构域ch1、ch2和ch3，但不包括重链可变区的部分。抗体可以是双特异性抗体，例如，具有与第一抗原特异性结合的第一可变区和与第二不同抗原特异性结合的第二可变区的抗体。使用至少一种双特异性抗体可以减少所需的检测试剂的数目。

诊断方法在敏感性和特异性上不同。诊断测定的“敏感性”是指测试阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。测定法未检测到的患病个体为“假阴性”。没有患病并且在测定中测试为阴性的受试者被称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”为1减去假阳性率，其中“假阳性”率被定义为测试为阳性的没有疾病的患者的比例。特异性还可以称为真阴性率。

可以通过任何方式在样品中检测本发明的一个或多个生物标志物蛋白质。用于生物标志物检测的优选方法是基于抗体的测定、蛋白质阵列测定、基于质谱(ms)的测定、以及基于(近)红外光谱的测定。例如，免疫测定法包括但不限于使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定法、elisa、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、荧光免疫测定法等之类的技术的竞争性测定系统和非竞争性测定系统。这样的测定法是例行的并且在本领域中是众所周知的。下文对示例性免疫测定法进行简要描述(但不旨在作为限制)。

免疫沉淀方案通常包括：在补充有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，edta、pmsf、抑肽酶、钒酸钠)的诸如ripa缓冲液之类的裂解缓冲液(1％np-40或tritonx-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％sds、0.15mnacl、ph为7.2的0.01m磷酸钠、1％trasylol)中裂解细胞群体；向细胞裂解物加入感兴趣抗体；在4℃下孵育一段时间(例如，1-4小时)；向细胞裂解物加入蛋白质a和/或蛋白质g琼脂糖凝胶珠；在4℃下孵育约一个小时或更长时间；在裂解缓冲液中洗涤珠；并且在sds/样品缓冲液中重新悬浮珠。抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如蛋白质印迹分析来评估。本领域技术人员应当了解可以被修改以增加抗体与抗原的结合并且减小背景的参数(例如，用琼脂糖凝胶珠预先清除细胞裂解物)。

蛋白质印迹分析通常包括：制备蛋白质样品；在聚丙烯酰胺凝胶中电泳蛋白质样品(例如，依据抗原的分子量，8％-20％sds-page)；将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到诸如硝酸纤维素、pvdf或尼龙之类的膜；在阻断溶液(例如，含3％bsa的pbs、或脱脂牛奶)中阻断该膜；在洗涤缓冲液(例如，pbs-tween20)中洗涤膜；使用在阻断缓冲液中稀释的一次抗体(感兴趣抗体)阻断膜；在洗涤缓冲液中洗涤膜；使用在阻断缓冲液中稀释的偶联到酶促底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如，32p或125i)的二次抗体(其识别一次抗体，例如，抗人抗体)阻断膜；在洗涤缓冲液中洗涤膜；并且检测抗原的存在。本领域技术人员应当了解可以被修改以增加检测到的信号并且减少背景噪声的参数。

elisa通常包括：制备抗原(即，感兴趣生物标志物蛋白质或其片段)；使用抗原包被96孔微量滴定板的孔；向该孔加入与诸如酶促底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)之类的可检测化合物缀合的感兴趣抗体并且孵育一段时间；并且检测抗原的存在。在elisa中，感兴趣抗体不必与可检测化合物缀合；相反，可以向该孔加入与可检测化合物缀合的第二抗体(其识别感兴趣抗体)。进一步地，代替使用抗原包被孔，抗体可以包被到孔。在这种情况下，在向经包被的孔加入感兴趣抗原之后，可以加入与可检测化合物缀合的第二抗体。本领域技术人员应当理解可以被修改以增加检测到的信号的参数以及本领域已知的elisa的其他变体。

由于使用了多种标志物，所以可以基于这些生物标志物的联合浓度来确定阈值。该阈值确定患者是被分类为没有牙周疾病、患有牙龈炎、患有轻度牙周炎、还是被分类为患有重度牙周炎。本发明反映这样的见解，即，基于如上所述的生物标志物的组合的测量，可以以足够的准确性检测从健康一直到重度牙周炎的牙周健康的所有阶段。

该见解支持了本发明的另一方面，该方面是蛋白质的用途，该蛋白质是mmp-9和s100a8中的至少一种、a1agp、以及pk，该蛋白质作为人类患者的唾液样品中的生物标志物，作为评估患者无牙周疾病、患有牙龈炎、患有轻度牙周炎、还是患有重度牙周炎的生物标志物。

这种用途可以在如前文和下文所基本上描述的方法中来实现。

本发明的方法包括：确定至少一个测试值，该至少一个测试值反映针对所述蛋白质所测量的联合浓度。联合浓度值可以是通过输入所确定的浓度并且对这些值进行算术运算而获得的任何值。例如，这可以是浓度的简单相加。它还可以包括：将每个浓度乘以反映这些浓度的所需权重的因子，然后将结果相加。它还可以包括：将浓度彼此相乘，或者乘法、除法、减法、求幂和加法的任意组合。它还可以包括：将浓度上升到某个幂次。可选地，测试值反映与受试者的年龄相结合针对所述蛋白质而确定的联合浓度。在某些实施例中，测试值可以针对以下各项中的一项、两项或三项而被生成：(i)牙周炎对健康或牙龈炎的概率、(ii)牙龈炎对健康的概率、以及(iii)重度牙周炎对轻度牙周炎的概率。

所得到的联合浓度值可以与一个或多个阈值进行比较，该一个或多个阈值以相同方式反映与牙周炎的存在、重度牙周炎的存在、或牙龈炎的存在相关联的联合浓度。该比较允许评估测试值是否指示接受唾液测试的患者中存在健康口腔、牙龈炎、轻度牙周炎或重度牙周炎。

阈值可以是例如联合浓度值，该阈值是在针对与重度牙周炎的存在相关联的参考样品中(即，诊断为重度牙周炎的患者中)相同蛋白质而确定的浓度的基础上以相同方式获得的。通常，由此反映相同或更高联合浓度的值指示受测患者中存在重度牙周炎。类似地，反映受测牙周炎患者的唾液中较低的联合浓度的值指示牙周炎为轻度或中度(即，非重度)。然而，应当理解，还可以计算阈值(例如，通过使用负乘数)，使得指示重度牙周炎的测试值将低于阈值，而指示轻度牙周炎的测试值将高于阈值。

阈值还可以基于测量样品集合中本生物标志物蛋白质的浓度来确定，该样品集合包括已知诊断为牙龈炎、牙周炎(可选地，仅轻度/中度)和重度牙周炎的患者。由此，可以对测量的浓度值进行统计分析，其可能包括机器学习方法，从而以期望的灵敏度和特异性来区分被分类为健康人、患有牙龈炎的患者、患有轻度牙周炎或中度牙周炎的患者以及患有重度牙周炎的患者。由此，可以获得一个或多个期望阈值。基于该阈值，可以对待测样品进行相同的浓度测量，然后，以与获得一个或多个阈值相同的方式处理浓度值，从而确定可以与阈值比较的联合浓度值，因此可以将受测样品分类为患有轻度牙周炎或重度牙周炎。

在一个有趣的实施例中，以如下得分的形式获得联合浓度值。指派给每个测量一个数值(蛋白质浓度值，例如，ng/ml)，并且这些值以线性组合或非线性组合使用以计算0与1之间的得分。在如上文所提及的受试者集合的基础上确定阈值的情况下，通常使用将联合浓度作为输入的s型函数来计算0与1之间的得分(如进一步所示出的)。例如，基于蛋白质浓度，可以计算三个得分(0与1之间)：

·sp：这可以视为牙周炎‘对’健康/牙龈炎的概率

·sg：这可以视为牙龈炎‘对’健康的概率

·sap：这可以视为重度牙周炎‘对’轻度牙周炎的概率

然后，四个疾病阶段的概率(0与1之间)可以计算如下：

·健康(h)：(1-sp)·(1-sg)

·牙龈炎(g)：(1-sp)·sg

·轻度牙周炎(mp)：sp·(1-sap)

·重度牙周炎(ap)：sp·(sap)

阈值可以基于期望敏感性和特异性来选择。本领域技术人员应当理解，上文所列出的概率应当视为理想化的简化，并且不同估计可以用于把概率依赖性考虑在内的实践中。

可替代地，可以采用类似决策树的方法，其中首先对健康或牙龈炎对牙周炎进行分类：当sp≥tp且tp为阈值时，患者被分类为患有牙周炎。随后，进一步完善。当sap≥tap且以tap为阈值时，被分类为牙周炎的患者进一步被分类为患有重度牙周炎。否则被分类为轻度牙周炎。当sg≥tg且tg为阈值时，被分类为健康或牙龈炎的患者进一步被分类为患有牙龈炎，否则该患者被分类为健康。可以根据相应分类步骤的灵敏度和特异性的期望调整来选择阈值tp、tap、tg。图3中对这种决策树方法进行了描绘。

本领域公认的临床定义基于以下各项：

牙龈指数(gi)

基于以尺度额定为0到4的lobene改良牙龈指数(mgi)记录全口牙龈指数，其中：

0＝无炎症；

1＝轻度炎症；颜色略有改变，但整个边缘或乳头状牙龈单位的任何部分都没有纹理改变，

2＝轻度炎症；但牵涉到整个边缘或乳头状单位，

3＝中度炎症；边缘或乳头状单位的光亮、发红、水肿和/或肥大，

4＝严重炎症；边缘或乳头状牙龈单位明显发红、水肿和/或肥大、自发性出血、充血或溃疡。

探诊深度(pd)

探诊深度使用手动unc-15牙周探针记录，精确至毫米。探诊深度是从探针尖端(假设位于牙周袋的底部)到游离龈缘的距离。

牙龈退缩(rec)

牙龈退缩使用手动unc-15牙周探针记录，精确至毫米。牙龈退缩是指从游离龈缘到釉质牙骨质界的距离。牙龈退缩被指示为正数，而牙龈过度生长被指示为负数。

临床附着丧失(cal)

临床附着丧失计算为每个部位的探诊深度+退缩之和。

探诊出血(bop)

探诊后，在探诊时评估每个部位的出血，如果在探诊的30秒内发生出血，则为该部位指派1分，否则指派0分。

所得到的受试者组(患者组)定义如下：

-健康组(h)：所有部位的pd≤3mm(但最后站立臼齿的远端处允许多达4个4mm的牙周袋)，无具有邻间附着丧失的部位，≤10％部位中gi≥2.0，％bop得分≤10％；

-牙龈炎组(g)：>30％部位中gi≥3.0，无具有邻间附着丧失的部位，无pd>4mm的部位，％bop得分>10％；

-中度牙周炎组(mp)：≥8颗牙齿时，邻间pd为5-7mm(相当于cal约为2-4mm)，％bop得分>30％；

-重度牙周炎组(ap)：≥12颗牙齿时，邻间pd≥7mm(相当于cal约≥5mm)，％bop得分>30％。

在一个实施例中，本发明的方法利用如图1中所示意性表示的系统。该系统可以是具有集成在其中的各种设备部件(单元)的单个装置。该系统还可以具有其各种部件或这些部件中的一些部件作为单独装置。图1所示的部件是测量设备(a)、图形用户接口(b)、以及计算机处理单元(c)。

如上文所提及的，本发明的系统包括到接口的数据连接，接口本身可以是系统的一部分或者可以是远程接口。后者是指使用不同装置(优选地，诸如智能手机或平板电脑之类的手持装置)提供实际接口的概率。在这种情况下，数据连接优选地包括无线数据传送，诸如通过wi-fi或蓝牙，或通过其他技术或标准。

测量设备(a)被配置为接收唾液样品，例如，通过将唾液滴放在药筒(a1)上，该药筒可以插入到设备(a)中。该设备可以是能够根据同一唾液样品来确定至少下述蛋白质的浓度的现有设备，该蛋白质是s100a8和mmp-9中至少一项、蛋白质a1agp、pk。

测量设备(a)应当能够接收唾液样品，例如，将唾液滴放在药筒(a1)上，然后该药筒插入到设备(a)中。该设备可以是能够根据同一唾液样品确定至少蛋白质s100a8和mmp-9之一、以及蛋白质a1agp、pk的浓度的现有设备。

处理单元(c)从部分(a)接收蛋白质浓度的数值。单元(c)设有软件(通常，嵌入式软件)，该软件允许单元(c)对疾病阶段进行分类。例如，分类可以如图2所示。基于蛋白质浓度，可以计算三个得分(0与1之间)：

·sp：这可以视为牙周炎‘对’健康/牙龈炎的概率

·sg：这可以视为牙龈炎‘对’健康的概率

·sap：这可以视为重度牙周炎‘对’轻度牙周炎的概率

然后，四个疾病阶段的概率(0与1之间)可以计算如下(注意，如上所述，不同估计可以用于把概率依赖性考虑在内的实践)：

·健康(h)：(1-sp)·(1-sg)

·牙龈炎(g)：(1-sp)·sg

·轻度牙周炎(mp)：sp·(1-sap)

·重度牙周炎(ap)：sp·(sap)

单元(c)可以直接将这些概率输出到单元(b)，例如，健康为0.8的概率可能指示确定性为80％的健康。可替代地，单元(c)可以将疾病状态的指示(i)输出到gui(b)，所指示的疾病状态可能是具有最高概率的疾病状态。

在另一实施例中，该软件还可以包括用于阈值(tp，tg，tap)的数值。然后，比如，如果计算的得分sp超过tp，则认为该受试者患有牙周炎(因此，对于sp≥tp，sp:＝1；对于sp<tp，sp:＝0)。然后，基于sap，进一步改善轻度牙周炎和重度牙周炎。比如，如果sap≥0.5，则指示‘重度牙周炎’；或可替代地，如果sap超过tap阈值，则指示‘重度牙周炎’。使用特定阈值允许将疾病状态的分类的敏感性和特异性调节到期望水平。比如，为牙周炎应用较低阈值tp会以较低特异性(更多假阳性)为代价增加用于检测牙周炎(较少假阴性)的敏感性。

指示的确定性还可以通过定义一个或多个范围r1-r2或一个或多个(一般)阈值t来实现。比如，如果r1<sp<r2，则可以认为牙周炎的分类尚无定论，因此不进行进一步分类。指示(i)将显示为‘尚无定论’。或者，如果计算的健康、牙龈炎、轻度牙周炎和重度牙周炎的概率均未超过阈值t，则指示(i)将显示为‘尚无定论’。

得分的特定计算可以例如借助于使用以下公式的s型函数来实现：

其中n是使用的蛋白质/生物标志物的数目。c0、c1等是系数(数值)，并且b1、b2等是相应的蛋白质浓度。

系数可以通过三个分类步骤(分别为h/g对p、h对g、mp对ap)的训练过程来确定：

·选择分别患有牙周炎、牙龈炎、重度牙周炎(如牙医通过当前标准确定)的np，ng，nap受试者以及分别没有牙周炎、具有健康牙龈、以及患有轻度牙周炎的nnp，nh，nap受试者。

注意，对于作为一项研究的一部分的受试者，我们得出np＝nmp+nap，nnp＝nh+ng。

·从每个受试者中获取唾液样品，并且如上所述确定生物标志物组合的蛋白质浓度。

·将牙周炎、牙龈炎、重度牙周炎的得分sp，sg，sap分别定义为1，并且将没有牙周炎、健康牙龈或轻度牙周炎的得分sp，sg，sap分别定义为0。

·将s型函数拟合为得分和蛋白质浓度值。

其他回归或机器学习方法(线性回归、神经网络、支持向量机)可以用于训练基于蛋白质浓度来预测口腔健康状态的分类器，其中牙周炎患者、牙龈炎患者和重度牙周炎患者的得分sp，sg，sap分别较高，而没有牙周炎、健康和轻度牙周炎对照组的得分sp，sg，sap分别较低。

特别地，这种手术已经使用对具有健康口腔状况、患有牙龈炎、患有轻度牙周炎或患有重度牙周炎的受试者(牙科专家经由当前标准(例如，美国牙周病学会标准)通过临床评估确定)进行的临床研究得以应用。借助于逻辑回归与留一法交叉验证(loocv)评估各种生物标志物组合的性能，从而得到本发明的优选生物标志物组合。

参照前述系统，在另一方面中，本发明还提供一种系统，该系统用于评估人类患者无牙周疾病，患有牙龈炎，患有轻度牙周炎，还是患有重度牙周炎，该系统包括：

-检测部件，其能够并且适于检测人类患者的唾液样品中的蛋白质mmp-9和s100a8中的至少一项、a1agp、以及pk。如上文所解释的，这种部件是已知的，并且对于技术人员而言是容易获得的。通常，提供一种用于在其中接收受试者的口腔样品的容器，该容器设有检测部件；

-处理器，其能够并且适于从所述蛋白质的确定的浓度中确定没有牙周疾病，患有牙龈炎，患有轻度牙周炎或患有重度牙周炎的患者的指示。

可选地，该系统包括能够呈现信息的用户接口(或到远程接口的数据连接)，特别是图形用户接口(gui)。gui是一种用户接口，其允许用户通过图形图标和诸如辅助符号之类的可视指示符，而非基于文本的用户接口、键入的命令标签或文本导航(这种接口类型均没有排除在本发明之外)与电子设备交互。gui是众所周知的，并且通常用于手持式移动设备中，诸如mp3播放器、便携式媒体播放器、游戏设备、智能手机、以及较小家用控件、办公用控件和工业用控件。如上所述，可选地，还可以选择接口，以便能够输入信息，诸如受试者的年龄、性别、bmi(身体质量指数)。

本发明还单独地或作为前述系统的一部分提供了一种试剂盒，其用于检测人类患者的唾液样品中用于指示牙周疾病的至少三种生物标志物，所述试剂盒包含一种或多种检测试剂，该一种或多种检测试剂用于检测s100a8和mmp-9中的一项或两项、a1agp、pk。通常，试剂盒包含三种检测试剂，每种检测试剂针对不同的生物标志物，其中第一检测试剂能够结合a1agp，第二检测试剂能够结合pk，并且第三检测试剂能够结合s100a8和mmp-9中的一项或两项。如上文参考本发明的方法所讨论的，试剂盒可以包括更多的检测试剂，诸如特别用于mmp-8、白介素-1β、血红蛋白β、血红蛋白δ、肝细胞生长因子、游离轻链κ或游离轻链λ、和/或用于其他蛋白质。在一个优选实施例中，试剂盒中可用的检测试剂由检测试剂组成，该检测试剂用于选择构成本发明的3-生物标志物组的三种蛋白质，如上文所述。

优选地，所述试剂盒包括固体支持物，诸如碎屑(chip)、微量滴定板、或包括所述检测试剂的珠或树脂。在一些实施例中，试剂盒包括质谱探针，诸如proteinchip^tm。

试剂盒还可以提供对未结合的检测试剂或所述生物标志物具有特异性的洗涤溶液和/或检测试剂(夹心型测定法)。

在一个有趣的方面中，本发明的生物标志物组的识别应用于随时间监测人类患者的牙周疾病的状态。因而，本发明还提供了一种体外方法，用于确定患有牙周炎的人类患者在从第一时间点t1到第二时间点t2的时间间隔内的牙周疾病状态的改变，该方法包括：在t1时从所述患者获得的至少一个唾液样品和在t2时从所述患者获得的至少一个唾液样品中，检测以下蛋白质的浓度：s100a8和mmp-9中的一项或两项、a1agp、以及pk；并且比较浓度，由此优选地至少两个并且更优选地所有三个浓度的差异反映状态的改变。这种差异可以视为浓度差异，从而允许无需首先生成0与1之间的数字或任何其他分类即可进行直接比较。应当理解，在两个时间点接收的测量的处理方式还可以与如上所述确定患者状态时所进行的测量的处理方式相同。

本发明还提供了一种诊断人类患者无牙周疾病，患有牙龈炎，患有轻度牙周炎，还是患有重度牙周炎的方法，该方法包括：在患者的唾液中检测蛋白质s100a8和mmp-9中的一项或两项、a1agp、pk的存在。基于所述样品中的蛋白质的浓度，评估患者中健康口腔、牙龈炎、轻度牙周炎或重度牙周炎的存在。可选地，该方面的方法还包括以下步骤：治疗患者的牙周疾病。该可选的治疗步骤可以包括：施用已知治疗剂或牙科手术、或治疗剂与牙科手术的组合。已知的治疗剂包括：施用含抗微生物剂的试剂，诸如漱口剂、碎屑、凝胶或微球。用于治疗牙龈炎和牙周炎的典型抗微生物剂是洗必泰(chlorhexidine)。其他治疗剂包括抗生素，通常是口服抗生素；以及酶抑制剂，诸如强力霉素。已知的非外科治疗手术包括刮牙和牙根整平(srp)。已知的外科手术包括减少外科手术牙周袋、皮瓣外科手术、牙龈移植或骨骼移植。

本发明还提供了一种在患有牙龈炎、轻度牙周炎、或重度牙周炎的患者中检测s100a8和mmp-9中的一项或两项、a1agp、pk、的方法，该方法包括：

(a)从人类患者获取唾液样品；以及

(b)通过使唾液样品与能够结合a1agp的第一检测试剂、能够结合pk的第二检测试剂以及能够结合s100a8和mmp-9之一的第三检测试剂接触，并且检测每种蛋白质与检测试剂之间的结合，来检测唾液样品中是否存在s100a8和mmp-9中的一项或两项、a1agp、以及pk。

参考以下非限制性示例，对本发明进行进一步说明。

示例

在一项对153名受试者进行的临床研究中，其中39名受试者具有健康牙龈(h)，35名受试者被诊断为牙龈炎(g)，41名受试者被诊断为轻度牙周炎(mp)，以及38名受试者被诊断为重度牙周炎(ap)。获得了接受者操作特征区域曲线下的面积(receiver-operator-characteristicarea-under-thecurve)值。所获得的rocauc值>0.9，用于检测牙周炎；值>0.75，用于随后区分健康与牙龈炎以及区分轻度牙周炎与重度牙周炎。

在统计学上，接受者操作特征曲线或roc曲线是一个图解曲线，其图示了二元分类器系统在判别阈值发生变化时的性能。该曲线通过绘制各种阈值设置下的真阳性率(tpr)与假阳性率(fpr)来生成。真阳性率也称为机器学习中的灵敏度、召回或检测概率。假阳性率也称为附带后果(fall-out)或错误警报概率，并且可以计算为(1-特异性)。因此，roc曲线是作为附带后果的函数的灵敏度。一般而言，如果已知用于检测和错误警报两者的概率分布，则roc曲线可以通过在y轴上绘制检测概率的累积分布函数(从-∞到判别阈值的概率分布下的面积)与在x轴上绘制假警报概率的累积分布函数来生成。测试的准确性取决于测试将正在被测试的组分为有或没有相关疾病的人群的程度。通过roc曲线下的面积对准确性进行测量。面积1表示完美测试；面积0.5表示毫无价值的测试。传统学术评分系统是对诊断测试的准确性进行分类的指南：

0.90-1＝优秀(a)

0.80-0.90＝良好(b)

0.70-0.80＝一般(c)

0.60-0.70＝较差(d)

0.50-0.60＝失败(f)

借助于逻辑回归与留一法交叉验证(loocv)来评估各种生物标志物组合，从而得到本发明的生物标志物组合。可以看出，对于所有三个分类(健康/牙龈炎对牙周炎、健康对牙龈炎、以及轻度牙周炎对重度牙周炎)，本发明的蛋白质生物标志物组合的auc均大于0.75。

基于上述内容，在上述临床研究的结果中，认为rocauc值大于0.75表示用于提供根据本发明的诊断测试所需的准确性。

下表1总结了所有确定的生物标志物和生物标志物组中表示rocauc值大于0.75的数据。

表中所呈现的生物标志物蛋白质包括α1-酸糖蛋白(a1agp)和丙酮酸激酶(pk)，基质金属蛋白酶9(mmp-9)和s100钙结合蛋白a8(s100a8)，以及mmp-8、白介素-1β、血红蛋白β、血红蛋白δ、肝细胞生长因子、游离轻链κ和游离轻链λ。

现已发现，应用尽可能少的标志物的rocauc高于0.75的最佳结果取决于选择由基质金属蛋白酶9(mmp-9)和s100钙结合蛋白a8(s100a8)中的一项或两项、alpha-1-酸糖蛋白(a1agp)、以及丙酮酸激酶(pk)组成，或者如所示出的添加有其他标志物的生物标志物组。

表1

发现这14个组最多具有4种蛋白质生物标志物，以便为所有分类(即，h/g对p、h对g、以及mp对ap)提供aucloocv>0.75。

考虑了14种蛋白质标志物：

mmp8

白介素1β

mmp9

肝细胞生长因子

自由轻链(flc)κ

自由轻链(flc)λ

a1agp

血红蛋白β

血红蛋白δ

角质蛋白4

抑制蛋白

丙酮酸激酶

s100a8

s100a9

更进一步地，基于领域知识，在逻辑回归中，考虑了附加预测因子κ+λ、κ-λ、κ/λ。

通过14种蛋白质标志物，再加上可选的年龄作为标志物，存在2940种可能组，其至多具有4种蛋白质标志物(不把仅具有年龄的组考虑在内)。当考虑上述3个额外预测因子时，存在4204种非冗余可能组，其至多具有4种蛋白质标志物(不把仅具有年龄的组考虑在内)。本文中的非冗余意指不把包括例如作为预测因子的κ+λ和κ-λ的组考虑在内，因为在逻辑回归中，其给出的结果与包括κ和λ在内的对应组的结果相同。考虑到14种蛋白质标志物、年龄、以及所提及的其他3个预测因子，不对蛋白质标志物的数目进行约束就会得出98302种非冗余可能组(不把仅具有年龄的组考虑在内)。

虽然已经在附图和前面的描述中对本发明进行了详细说明和描述，但是这种说明和描述要被认为是说明性或示例性的而非限制性的；本发明不限于所公开的实施例。例如，可以以不同单位提供用于不同生物标志物的检测试剂。或者，方便地，本发明的试剂盒可以包括用于所有实施例中的用于蛋白质生物标志物的固定检测试剂集合，即，mmp-9和il-1β；以及包括用于其他生物标志物中的任一生物标志物的检测试剂的灵活模块，即，mmp-8或mmp-3。

通过研究附图、公开内容和所附权利要求，本领域技术人员在实践所要求保护的发明时可以理解和实现所公开的实施例的其他变型。在权利要求中，单词“包括”不排除其他元件或步骤，并且不定冠词“一”或“一个”不排除多个。在互不相同的从属权利要求中叙述本发明的某些特征这一纯粹事实并不指示不能有利地使用这些特征的组合。权利要求中的任何附图标记都不应被解释为限制范围。

总之，我们在此公开了一种体外方法，该方法用于评估人类患者是具有健康的牙周组织，患有牙龈炎，患有轻度牙周炎、还是患有重度牙周炎。该方法基于确定仅选择三种生物标志物蛋白质的见解。因而，在来自患者的唾液样品中，测量了蛋白质mmp-9和s100a8中的至少一种、a1agp、pk的浓度。基于所测量的浓度，确定反映所述蛋白质的联合浓度的值。该值通常用于计算患牙龈炎、牙周炎或重度牙周炎的概率，并且与以相同方式反映与牙龈炎、牙周炎或重度牙周炎相关联的联合浓度的相应阈值进行比较。该比较允许评估测试值是否指示所述患者中健康、牙龈炎、轻度牙周炎或重度牙周炎的存在。