诊断遗传性血管性水肿的方法与流程

本发明涉及鉴别诊断(differentialdiagnose)受试者的遗传性血管性水肿的方法，以及适用于鉴别诊断遗传性血管性水肿的试剂盒。遗传性血管性水肿是一种罕见的遗传性病症，其特征是反复出现血管外流体的积累，阻塞血液或淋巴液的正常流动，并导致手、脚、四肢、面部、肠道或气道中组织的快速肿胀。通常，这种肿胀并不会伴随瘙痒，尽管可能会伴随过敏反应。胃肠道肿胀导致痉挛。气道肿胀可能导致阻塞，这是潜在的非常严重的并发症。这些症状的发展是由于帮助维持流体通过非常小的血管(即毛细血管)的正常流动的某些蛋白质缺乏或功能不正常而导致的。在某些情况下，流体可能积聚在其他内部器官中。疾病的严重程度在受影响个体之间差异很大。遗传性血管性水肿有三种主要类型，即i型、ii型和iii型，其中i型是最常见的形式。i型和ii型遗传性血管性水肿均由serping1基因突变引起，该基因产生正常抑制补体系统的活化的c1抑制剂蛋白，而iii型则通常是由于因子xii基因突变引起的。遗传性血管性水肿是作为常染色体显性性状遗传的。突变基因可以从任一亲本遗传，或者可以是受影响个体中自发的新突变的结果。急性发作的患者的治疗包括施用血浆来源的c1酯酶抑制剂(cslbehring)，激肽释放酶抑制剂(dyaxcorporation)或缓激肽拮抗剂(shire)。长期预防患者的治疗包括施用c1酯酶抑制剂(如(viropharma))和或17-α-烷基化雄激素(如danazol，商品名为“danatrol”、“danocrine”、“danol”和“danoval”)遗传性血管性水肿可通过使用生色测定法或复合elisa法测量c1-inh水平来诊断。这样的实验室测试，即生色测定或复合elisa，是非特异性的、费时的并且需要高水平或资源，例如生物样品、时间和实验室材料。本发明的问题是提供鉴别诊断遗传性血管性水肿的方法和手段。这些和其他问题通过所附独立权利要求的主题解决。优选的实施方案可取自所附从属权利要求。更具体而言，在第一方面，通过鉴别诊断遗传性血管性水肿的方法解决了本发明的问题，其中所述方法包括确定来自受试者的样品中的c4蛋白、c1-inh蛋白和c1q蛋白的水平，其中样品是干燥的血斑样品，并且其中所述水平是通过质谱确定的。在第二方面，通过试剂盒解决了本发明的问题，该试剂盒适用于鉴别诊断遗传性血管性水肿的方法，优选根据第一方面的鉴别诊断遗传性血管性水肿的方法，其中该试剂盒包括选自包括以下各项的组的至少一个元件：一种生物标志物的相互作用配偶体、一种生物标志物、试剂盒的使用说明以及一个或更多个容器，其中生物标志物选自包括以下各项的组：c4蛋白、c4蛋白的片段肽、c1-inh蛋白、c1-inh蛋白的片段肽、c1q蛋白和c1q的片段肽。本发明人令人惊讶地鉴定出可用于差异地诊断遗传性血管性水肿的一组生物标志物。这样的生物标志物组包括(a)c4蛋白或c4片段肽、(b)c1-inh蛋白或c1-inh片段肽和(c)c1q蛋白或c1q片段肽。根据本发明的每个和任何方面，生物标志物选自包括以下各项的组：c4蛋白、衍生自c4蛋白的肽(在一个实施方案中为c4片段肽)、c1-inh蛋白、衍生自c1-inh蛋白的肽(在一个实施方案中为c1-inh片段肽)、c1q蛋白和衍生自c1q蛋白的肽(在一个实施方案中为c1q片段肽)。因此，在本发明中，在包括其任何方面和实施方案的本发明的各种方法的实施中，确定c4蛋白、c1-inh蛋白和/或c1q蛋白的水平。更具体地，在包括其任何方面和实施方案的本发明的各种方法的实施中，确定c4蛋白、c1-inh蛋白和c1q蛋白的水平，这在本发明的范围内。在本发明的每个和任何方面的实施方案中，衍生自c1q蛋白的肽是在酶消化c1q蛋白(优选通过胰蛋白酶消化c1q蛋白而消化c1q蛋白)时获得的或可获得的肽。在一个实施方案中，这样的肽不是化学转变(convert)、转化或衍生的。补体系统的亚组分c1q与免疫球蛋白复合物结合，从而导致c1r(酶)、c1s(原酶)和补体的其他8个组分的系列活化。c1q由3种不同的链组成，称为a，b和c。本文中对c1q或蛋白c1q的任何提及优选地是指亚组分c1q以及其每个和任何单独的链a，b和c，除非另有说明。c1q的链a的氨基酸序列如下：c1q的链b的氨基酸序列如下：c1q的链c的氨基酸序列如下：在本发明的每个和任何方面的实施方案中，衍生自c1q的片段肽是选自下表的一种。衍生自c1q的特别优选的肽是c1qb_[178-186]，其是通过高分辨率离子迁移质谱仪测量的分子量m/z为510.26的化合物，并且可以通过mrm-ms进行测量，其氨基酸顺序如下：gnlcvnlmr。该肽优选用作对照和/或用于区分hae和aae。衍生自c1q的另一种特别优选的肽是c1qb_[63-77]，其是通过高分辨率离子迁移质谱仪测量的分子量m/z为742.36或495.24的化合物，并且可以通过mrm-ms进行测量，其氨基酸序列如下：glpglagdhgefgek。该肽优选用作对照和/或用于区分hae和aae。根据本发明的每个和任何方面，在本发明的每个和任何方面的实施方案中，除了所述生物标志物，该方法还包括确定另一种生物标志物的存在和/或水平的步骤，其中另一种生物标志物是c1-inh蛋白、衍生自c1-inh的肽、c4蛋白和/或衍生自c4蛋白的肽。在本发明每个和任何方面的实施方案中，衍生自c1-inh蛋白的肽是在酶消化c1-inh蛋白(优选通过胰蛋白酶消化c1-inh蛋白而消化c1-inh蛋白)时获得的或可获得的肽。在一个实施方案中，这样的肽不是化学转变、转化或衍生的。在本发明每个和任何方面的实施方案中，衍生自c4蛋白的肽是在酶消化c4蛋白(优选通过胰蛋白酶消化c4蛋白而消化c4蛋白)时获得的或可获得的肽。在一个实施方案中，这样的肽不是化学转变、转化或衍生的。c1-inh的氨基酸序列如下：在本发明的每个和任何方面的实施方案中，衍生自c1-inh的片段肽是选自下表的一种。衍生自c1-inh的特别优选的片段肽是serping1_[242-249]和serping1_[391-400]，其中特别优选的是具有mrm跃迁(transition)455.74→696.33的serping1_[242-249]。c4的氨基酸序列如下：在本发明的每个和任何方面的实施方案中，衍生自c4的片段肽是选自下表的一种。衍生自c4的特别优选的片段肽是c4beta[571-579]、c4alpha[680-685]、c4alpha[786-791]、c4beta[294-297]，其中特别优选的是具有mrm跃迁466.26→243.13的c4beta[571-579]。结合本发明的每个和任何方面，c3蛋白和/或衍生自c3蛋白的肽可优选用作检测系统(优选用于确定生物标志物水平的分析技术)的适当发挥功能的内部对照。衍生自c3的肽是在酶消化c3蛋白(优选通过胰蛋白酶消化c3蛋白的c3蛋白消化)时获得的或可获得的肽。补体系统的成分c3在经典、替代和凝集素激活途径中起着重要的生物学作用，例如：(1)形成c3-和c5-转化酶，二者对于系统的完全激活都是必不可少的；(2)产生增强微生物的吞噬作用的调理素；(3)由片段c3a和c5a介导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱粒；(4)溶解和清除结合c3b的免疫复合物；(5)片段c3d和c3dg的佐剂功能；(6)清除凋亡细胞。遗传性血管性水肿患者通常具有正常的c3水平。c3的氨基酸序列如下：在本发明的每个和任何方面的实施方案中，衍生自c3的片段肽是选自下表的一种。衍生自c3的特别优选的肽是c3beta_[489-497]，其是如通过高分辨率离子迁移质谱仪、mrm跃迁604.8→327.22所测量的分子量m/z为608.81的化合物，并且可以通过mrm-ms进行测量，其氨基酸序列如下：yytylimnk。c3的另一个优选片段肽是具有mrm跃迁824.74→798.44的c3calpha1_[814-834]_cys_cam：816。衍生自c3的另一种特别优选的肽是c3calpha_[814-834]cys_cam816，其是如通过高分辨率离子迁移质谱仪所测量的分子量m/z为495.25的化合物，并且可以通过mrm-ms进行测量，其氨基酸序列如下：gicvadpfevtvmqdffidlr。“cam”是指半胱氨酸碘乙酰胺(carbamidomethyl)，是将c3切割成肽后游离sh-基团烷基化的结果。如本文中优选使用的，片段肽是通过消化，优选通过蛋白水解酶完全消化蛋白而产生的蛋白质的肽。将会认识到，不是使用胰蛋白酶分别从蛋白c1q、c1-inh、c4和c3产生肽，而是可以使用另一种蛋白水解酶，优选地，蛋白水解酶是蛋白酶或肽酶，其在完全消化蛋白时提供肽的混合物，其中该肽的每个种类仅出现一次。这确保了蛋白与通过使用蛋白酶对蛋白进行完全消化而获得的每种和任何肽之间的化学计量比为1:1。在另一实施方案中，消化反应或蛋白酶选自包含以下各项的组：arg-c、asp-n、asp-n(n端glu)、bnps或ncs/脲、胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-10、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-5、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、糜蛋白酶、糜蛋白酶(低特异性)、梭菌蛋白酶、cnbr、cnbr(甲基-cys)、cnbr(具有酸)、肠激酶、因子xa、甲酸、glu-c(amac缓冲液)、glu-c(phos缓冲液)、粒酶b、hrv3c蛋白酶、羟胺、亚碘酰基苯甲酸、lys-c、lys-n、lys-n(cys修饰的)、轻度酸水解、nbs(长时间暴露)、nbs(短期暴露)、ntcb、胰弹性蛋白酶、胃蛋白酶a、胃蛋白酶a(低特异性)、脯氨酰内肽酶、蛋白酶k、tev蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、凝血酶。本领域技术人员将进一步认识到，尽管原则上所有蛋白质衍生的肽都适用于本发明任何方面的任何方法，但是根据用于检测生物标志物的技术，可以优选使用不同的肽。因此，在本发明每个任何方面的实施方案中，生物标志物是衍生自蛋白c1q、c1-inh和c4中的任何的肽，其特别适合于通过质谱法进行检测，特别是在通过质谱法进行检测的情况下。同样相应地，在本发明每个任何方面的实施方案中，生物标志物是衍生自蛋白c1q、c1-inh和c4中的任何的肽，可针对其产生抗体或功能性核酸，所述抗体和功能性核酸提供对所述蛋白的高度特异性和/或高度选择性的检测和/或定量，特别是在通过使用这种抗体或功能性核酸作为所述肽的相互作用配偶体的测定法进行检测的情况下。术语“遗传性血管性水肿”(hae)，在本文中也称为“疾病”，是一种罕见的遗传性疾病，其特征是反复出现血管外流体的积累，阻塞血液或淋巴液的正常流动，并导致手、脚、眼睑、嘴唇、四肢、面部、肠道、气道和生殖器中组织的快速肿胀。通常，这种肿胀并不会伴随瘙痒，尽管可能会伴随过敏反应。胃肠道肿胀导致痉挛。气道肿胀可能导致阻塞，这是潜在的非常严重的并发症。这些症状的发展是由于帮助维持流体通过非常小的血管(毛细血管)的正常流动的某些蛋白质缺乏或功能不正常的结果。在某些情况下，液体可能积聚在其他内部器官中。疾病的严重程度在受影响个体之间差异很大。水肿也可能发生在呼吸道和消化道的粘膜中，这在遗传性血管性水肿患者中比患有在其他形式(即获得性或创伤性)的血管性水肿的患者中更为常见。患有这种病症的人通常会有硬和疼痛而不是发红和瘙痒(痒)的肿胀区域。很少出现皮疹(荨麻疹)。遗传性血管性水肿的症状可能会复发，并且可能变得更加严重。受伤、剧烈疼痛、手术、牙科手术、病毒性疾病和/或压力会触发或恶化复发症状。与消化系统(胃肠道)的肿胀有关的症状包括恶心、呕吐、急性腹痛和/或其他阻塞迹象。咽部(咽)或喉部(喉)的水肿会导致疼痛、难以吞咽(吞咽困难)、难以发声(发声困难)、喧噪呼吸(喘鸣)和潜在的威胁生命的窒息。遗传性血管性水肿有三种形式，即i型遗传性血管性水肿、ii型遗传性血管性水肿和iii型遗传性血管性水肿。所述病症最常见的形式是i型遗传性血管性水肿，是缺乏一种称为补体成分c1酯酶抑制剂的蛋白的结果。在占85％患者的i型遗传性血管性水肿中，c1酯酶抑制剂的血清水平低于正常水平的35％。在ii型中，该水平是正常的或升高的，但该蛋白是无功能的。这两种类型在临床上是无法区分的。iii型遗传性血管性水肿是由染色体5q上编码凝血因子xii(f12；610619)的基因的突变引起的。遗传性血管性水肿是作为常染色体显性性状遗传的。遗传性血管性水肿的遗传缺陷是染色体11q上c1酯酶抑制剂基因(c1nh，serping1)的杂合突变。i型遗传性血管性水肿患者似乎由于终止密码子而具有c1酯酶抑制剂基因缺失或截短的转录本，而ii型遗传性血管性水肿患者具有单碱基置换。这两种形式在临床上是无法区分的。与遗传性血管性水肿有关的c1酯酶抑制剂基因中的突变以及在遗传性血管性水肿的诊断中测试的c1酯酶抑制剂基因的突变是本领域技术人员已知的，并且可以使用常规方法从科学论文中检索到。与遗传性血管性水肿有关的c1酯酶抑制剂蛋白的突变以及在遗传性血管性水肿的诊断中测试的c1酯酶抑制剂蛋白的突变是本领域技术人员已知的，并且可以使用常规方法从科学论文中检索到。c1酯酶抑制剂基因中已知的dna变化是c.550g>a，c.671t>a，c.551_685del，外显子1和2的c.-191_51del/del，c.1081c>t，c.106_107del和c.1397g>a。在本发明的每个和任何方面的实施方案中，遗传性血管性水肿是i型遗传性血管性水肿。如本文所用，术语“样品”优选是指有限量的受试者的材料，其中所述受试者的材料是受试者和/或受试者的身体的一部分或已经从受试者和/或受试者的身体获取。优选地，所述材料选自包括以下各项的组：诸如受试者的血液、血液制品、尿液、唾液、脑脊髓液和淋巴液的体液，以及粪便或作为受试者和/或受试者的身体的一部分的任何种类的组织和或细胞材料。本领域技术人员将认识到，所述样品中本发明生物标志物的存在和/或水平旨在类似于并代表较大数量的受试者的材料中生物标志物的存在和/或水平。更准确地且作为说明性的非限制性实例，在例如来自受试者的几毫升血液的样品中确定的本发明生物标志物的水平也代表受试者身体的血液中所述生物标志物的水平。此外，在本发明的每个和任何方面的方法的实施方案中，来自受试者的样品包括例如加工、固定和/或保存的形式的所述受试者的材料，使得所述样品适合用于本发明的每个和任何方面的方法中，由此这样的处理、固定和/或保存优选地不产生(至少不是无意地)在患者血液中不存在的生物标志物。样品中的受试者材料因此可以例如用适合于本发明的每个和任何方面的方法的溶剂(例如甲醇和/或水)稀释，可以例如在过滤卡上干燥，可以在干燥之后例如用适合于本发明方法的溶剂(例如甲醇和/或水)溶解，或者可以加入一种物质，其中所述物质防止血液凝固，例如edta或肝素。优选与本发明的每个和任何方面结合使用的样品用于此类方法的样品是从主要来源例如全血制备的。其他样品包括但不限于血清样品和血浆样品。在本发明的每个和任何方面的实施方案中，主要样品是全血，在一个实施方案中，所述全血被处理使得其被收集在干的血液过滤卡上；优选地，在直径为3mm的所述干的血液过滤卡的斑点上收集大约3μl的全血。本领域技术人员将认识到，因此收集的确切体积可以根据特定患者的血细胞比容而变化。在本发明的每个和任何方面的任何实施方案中，其中样品是血液或干血斑或其他液体或组织，并且其中生物标志物是衍生自c4蛋白、c1q蛋白和/或c1-inh蛋白的肽，样品可以按以下方式处理：-提取血液成分；-使提取物与还原剂(优选为二硫苏糖醇(ddt))原位反应，以还原蛋白中的二硫键，并与烷基化剂(优选为碘乙酰胺(iaa))以使游离的-sh基团烷基化；-优选通过使用蛋白酶，更优选通过使用蛋白酶胰蛋白酶将混合物消化成肽；和-通过质谱法，优选lc-质谱分析法，更优选在内标的存在下，分析包含蛋白的肽片段的混合物。在本发明方法的每个和任何方面的实施方案中，其中向一样品或该样品中添加内标，可以在胰蛋白酶消化步骤之前或之后向样品中添加内标，即在从受试者取得样品后立即将内标加入样品中，或者可以将内标加入经hplc的上清液中，以及在这些时间点之间加入。确定如何以及何时将内标添加到样品中以实现对生物标志物水平的准确检测和确定是本领域技术人员的技能，其中根据本发明，优选地将内标添加到包含生物标志物的样品中。本领域技术人员将认识到，通过将内标(本文中也称为is)添加到将进行根据本发明的这种方法的样品中，即样品的加标(spiking)，样品中is的浓度是已知的，并且，例如通过测定例如hplc-质谱色谱图中内标的峰下面积(即峰面积)，可以建立峰面积与物质(例如is)和/或本发明的生物标志物的浓度之间的关系，并因此提供一种用于确定样品中生物标志物的水平的手段。本领域技术人员将进一步认识到各种分子可以用作is。然而，与分子例如生物标志物相比具有相似化学结构的is是优选的。在优选的实施方案中，可以将是is的分子与本发明的生物标志物区分开。后者特别适用于本发明的每个和任何方面的那些实施方案，其中生物标志物是肽衍生的c4蛋白、c1-inh蛋白和/或c1q蛋白。在本发明每个和任何方面的进一步优选的实施方案中，选择is，使得在自然界中在理想情况下不存在或罕见的分子带有重同位素(例如c13，n15形式的生物标志物)，包括修饰的氨基酸，例如d-氨基酸或+或–氨基酸或右旋肽。在本发明的每个和任何方面的优选实施方案中，亮氨酸-脑啡肽(enkephaline)用作内标，其在自然界中不存在。在本发明各个方面的实施方案中，其中将内标添加到来自受试者的样品中，优选地，添加is以使得在添加到样品之前将is溶解在溶剂(例如水)中。根据本发明，包括其任何方面和实施方案，检测生物标志物。如本文中优选使用的，术语“检测”是指包括检测样品中物质的存在或不存在和/或确定所述物质的类型的方法。在一个实施方案中，该物质是生物标志物、对照和/或内标。可以通过本领域已知的方法和本文进一步描述的方法来完成检测。这些方法包括但不限于质谱分析、生物芯片阵列、功能性核酸和/免疫测定。优选地，借助于质谱分析来检测和/或定量生物标志物。在更优选的实施方案中，质谱分析选自包括以下各项的组：seldims、maldims、esims、desims和离子迁移ms。在一个实施方案中，质谱分析使用选自包括以下各项的组的分析仪：tof、qtof、离子阱、三重四极杆、轨道阱、ft-icr、离子迁移及其任意组合。在本发明的实施方案中，包括其任何方面和实施方案，生物标志物的水平通过hplc分离之后的质谱分析来确定。在本发明的每个和任何方面的另一个实施方案中，生物标志物通过相互作用配偶体来检测。这样的相互作用配偶体是选自包括抗体、抗促成素(anticaline)和功能性核酸的组中的一种。产生与生物标志物结合的抗体在本领域技术人员的技能范围内。抗体可以如本领域技术人员已知的和例如由harlow,e.,和lane,d.,”antibodies:alaboratorymanual,”coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny,(1988)所描述的那样产生。生成与生物标志物结合的抗促成素在本领域技术人员的技能范围内。抗促成素的产生例如描述于德国专利申请de19742706中。在一个实施方案中，功能性核酸是适配体。产生适配体是在本领域技术人员的技能范围内。适配体是单链或双链的d-核酸，其与靶分子特异性相互作用。适配体的产生例如在欧洲专利ep0533838中描述。在一个实施方案中，功能性核酸是镜像异构体(spiegelmer)。产生镜像异构体是在本领域技术人员的技能范围内。镜像异构体是单链或双链的l-核酸，其与靶分子特异性相互作用。适配体的产生例如在国际专利申请wo98/08856中描述。本领域技术人员将理解，上述用于检测生物标志物的技术和方法可以等同地用于定量生物标志物。在本发明的实施方案中，包括其任何方面和实施方案，本文优选使用的“水平”或“生物标志物的水平”是指优选在受试者样品中的浓度或生物标志物的浓度。所述水平可以是绝对水平，例如以ng/ml表示(在每ml样品中化合物和生物标志物的ng)。该水平可以是相对水平。在一个实施方案中，这样的相对水平是生物标志物与内标的比率。在本发明的实施方案中，包括其任何方面和实施方案，如下确定所述水平，优选在切割蛋白c4、c1q和/或c1-inh肽片段之后，更优选在将肽的游离sh-基团烷基化之后。在实施例部分更详细描述的分析设置中，将内标添加到待分析的样品中。在这样的分析过程中，获得将样品中检测到的各种化合物指示为单独峰的色谱图。各种化合物尤其包括c4蛋白、c1q和/或c1-inh蛋白的片段以及内标。为了从这样的色谱图和其中指示的峰确定一个或多个片段肽的浓度或水平，确定了对应于一个或多个片段肽的峰的峰面积和对应于内标的峰的峰面积。基于一个或多个片段肽的峰面积和内标的峰面积，可以确定片段肽与内标的比率。在存在已知浓度的内标的情况下，使用不同浓度的一个或多个片段肽的标准曲线，获得一个或多个片段肽的浓度。在本发明的实施方案中，包括其任何方面和实施方案，将生物标志物的水平与在另一样品(例如来自同一患者、来自另一患者、来自对照和/或来自相同或不同的时间点)中确定的本发明的相同或另一生物标志物的水平，和/或对照水平和/或is水平进行比较。如本文所用的与此相关的“比较”或“与……相比”优选地是指一个或多个生物标志物的水平或比率的两个或更多个值的数学比较。因此，如果将至少两个这样的值或比率相互比较，那么所述值之一是较高、较低还是相同的则将是立即显而易见的。在一个实施方案中，可以使用绝对水平来执行这种比较。在替代实施方案中，可以使用相对水平来进行这种比较。在本发明的实施方案中，包括其任何方面和实施方案，还可以在对照中确定生物标志物的水平。如本文所用，对照优选是来自受试者的样品，其中所述受试者的遗传性血管性水肿状态是已知的。在一个实施方案中，对照是健康患者的样品。在进一步的实施方案中，在确定包含所述添加的生物标志物的健康患者的所述样品中的所述生物标志物的水平之前，优选在本发明的方法的实施中，将一定量的所述生物标志物添加至健康患者的所述样品中。在进一步的实施方案中，对照是来自至少一个具有已知遗传性血管性水肿状态的受试者(例如对照患者)的样品，并且在又进一步优选的实施方案中，还包括关于在所述疾病中受影响的基因(包含c1酯酶抑制剂蛋白)的突变的遗传状态，即包含具有纯合和/或复合杂合突变的受试者，该受试者作为突变的携带者。在进一步优选的实施方案中，对照是来自未接受疾病治疗的受试者的样品。在又进一步优选的实施方案中，对照是来自单个受试者的样品或来自不同受试者的样品库和/或在不同时间点取自一个或多个受试者的样品。在本发明的实施方案中，包括其任何方面和实施方案，如果该受试者没有遭受与该疾病相关的症状，则该受试者被认为是关于该疾病的健康受试者。更具体地，在本发明的实施方案中，包括其任何方面和实施方案，如果没有c1酯酶抑制剂基因的功能部分的突变(其导致相应蛋白或其活性降低或缺陷，导致与遗传性血管性水肿有关的症状)，则认为该受试者对于遗传性血管性水肿而言是健康的。关于本发明，包括其任何方面和实施方案，“患者”是显示疾病的至少一种症状的受试者。更优选地，患者是表现出c1酯酶抑制剂基因的一个纯合突变或多个杂合突变(其导致相应蛋白和/或蛋白活性的降低或缺乏，导致与遗传性血管性水肿相关的症状)的受试者。此外，与此相关的“携带者”是表现出c1酯酶抑制剂基因的一个杂合突变的受试者，其导致或不导致相应蛋白和/或蛋白活性的降低或缺乏，通常或优选地不导致与遗传性血管性水肿相关的症状。在本发明的实施方案中，包括其任何方面和实施方案，将生物标志物的水平与临界比较(该术语与术语临界值或临界水平同义使用)。如本文优选使用的术语“临界值”是可以是绝对水平或相对水平的水平(或浓度)，其指示人是否正在患有疾病和/或处于患有疾病的风险中。取决于生物标志物，如果分别检测和确定的生物标志物的水平低于临界值或分别检测和确定的生物标志物的水平高于临界值，则认为受试者患有该疾病或处于患有该疾病的风险中。如本文中优选使用的，临界值设定为健康受试者群体的平均值±2x标准偏差。在鉴别诊断遗传性血管性水肿的方法中使用的一些片段肽的临界值如下。肽临界c4beta_[571-579]500ng/mlserping1_[242-249]835ng/mlc1q-beta_[178-186]800ng/mlc4alpha_[680-685]260ng/mlc4alpha_[786-791]100ng/mlc4beta_[294-297]201ng/mlc4gamma_[1638-1641]920ng/mlserping1_[391-400]392ng/mlc1q-beta_[63-77]1690ng/ml本领域技术人员将理解，基于上述临界值，可以基于上述片段肽和所述其他片段肽的分子量计算任何其他片段肽的对应临界值。对于c4蛋白、c1-inh蛋白和c1q蛋白以及形成它们的单个多肽中的任何一种的临界值也同样适用。以这种方式计算的临界值在本文中也称为相应的临界值，由此，优选地，针对指定的片段肽参考上述临界值中的一个或更多个。如本文中优选使用的，物质(诸如对照生物标志物)的“检测限”是通过确定该物质的水平的方法确定的该物质的水平，其中小于或低于所述检测限的水平不能通过所述方法确定。因此，立即清楚地知道，如本文使用的“临界值”和“检测限”虽然都反映了物质(例如本发明的生物标志物)的一定水平，但优选地不一定相同。同样，将立即理解的是，将优选选择临界值，使得该方法的选择性和灵敏度尽可能高。与此相反，检测限代表本发明生物标志物的绝对水平，其反映了可以用确定所述生物标志物水平的方法检测的生物标志物的最低水平。因此，立即清楚的是，检测限取决于确定物质水平的方法以及将通过该方法确定其水平的物质。本领域技术人员将立即理解，高的检测限，例如高于理想的临界值，可能会导致该方法的灵敏度降低，因为通过测试预测为阳性的真实阳性百分比还取决于是否可以针对所述真实阳性确定生物标志物的水平。换句话说，如果检测限高于理想的临界值，则不能将生物标志物的水平略高于临界值的真阳性与生物标志物的水平低于临界值的真阴性相区别，因为对于生物标志物的水平略高于临界值的真阳性和生物标志物的水平低于临界值的阴性，无法确定生物标志物的水平。因此，立即清楚的是，低检测限是有利的。优选地，本文所用的“理想临界值”是具有最高选择性和灵敏度的临界值。在一个实施方案中，作为本发明的第一方面的主题的诊断疾病的方法包括从中获取了样本的受试者是其样本在之前经受所述方法的受试者，这在本发明的范围内。在一个优选的实施方案中，所述两个样品之间的时间差为2周，1个月，2个月或3个月；优选地，所述两个样品之间的时间差是一个月。据此，第一方面的方法(包括其任何实施方案)，包括确定来自受试者的样品中的生物标志物的水平，以及作为进一步的步骤，确定来自该受试者的第二样品中的生物标志物的水平，其中第二样品已在所述时间差之后从受试者中获取。在一个实施方案中，作为本发明的第一方面的主题的诊断疾病的方法，其使用取自受试者的样品，所述受试者是在采集样本的时间点之前已经对其进行了治疗或在采集样本的时间点对其进行了治疗的受试者，这在本发明的范围内。在一个实施方案中，作为本发明的第一方面的主题的诊断疾病的方法，其使用取自受试者的样品，所述受试者是在采集样本的时间点之前未对其进行治疗或在采集样本时的时间点未对其进行治疗的受试者，这在本发明的范围内。在第二方面，本发明涉及一种试剂盒，其中所述试剂盒包含选自以下组中的至少一种元件，所述组包含：一种或所述生物标志物的相互作用配偶体，一种或所述生物标志物，该试剂盒的使用说明和一个或更多个容器。在一个实施方案中，试剂盒用于根据本发明的第一方面的方法中。在优选的实施方案中，试剂盒包含一种或所述生物标志物的相互作用配偶体，优选为c4、c1q和c1-ihn各自的一个片段肽的相互作用配偶体或c4、c1q和c1-ihn各自的相互作用部分，以及使用说明，以及任选的一个或更多个容器。在另一个优选的实施方案中，试剂盒包含一种或所述生物标志物，优选c4、c1q和c1-ihn各自的一个片段肽的相互作用配偶体或c4、c1q和c1-ihn各自的相互作用部分，以及使用说明，以及任选的一个或更多个容器。在第二方面的实施方案中，相互作用配偶体是选自包括抗体、抗促成素(anticaline)、适配体和镜像异构体(spiegelmer)的组中的一种，其中抗体、抗促成素、适配体和镜像异构体中的任何一种都能够结合一种或所述生物标志物，优选地，所述结合使得在生物标志物和相互作用对象之间形成复合物，该复合物允许分别对复合物或生物标志物进行检测和定量，优选在复合物溶解后。如本文所用，术语“处于发展疾病的风险中”优选是指受试者很可能会患有所述疾病和/或将发展所述疾病或与所述疾病相关的症状，特别是如果不进行治疗的话。与此相关，必须承认遗传性血管性水肿是遗传性病症，因此具有所述疾病或具有已知是引起所述疾病的突变的亲属特别是父母的患病，指示了受试者(例如两个遗传性血管性水肿患者或两个遗传性血管性水肿携带者的孩子)处于发展上述疾病的风险中。此外将认识到，疾病的进展与症状的发生以及所述症状的严重性有关。因此，当前没有症状的人仍可能处于发展该疾病的风险中，例如，原因在于尽管存在(已知导致疾病的)基因的遗传突变，但是没有症状或没有严重的症状出现。然而，将立即理解本发明的方法和生物标志物，特别是如果根据本发明的所述生物标志物的水平降低或增加(取决于生物标志物)，则可以诊断出该受试者处于发展疾病的风险中，无论症状的存在与否。因此，根据本发明的方法允许确定受试者是否处于患有该疾病的风险中。基于受试者是否处于患有疾病的风险中而应用、维持、减少、升高或不应用治疗也在本发明的范围内。如本文所用，术语在受试者中“确定遗传性血管性水肿状态”优选是指受试者的生物标志物谱的分类，其选自包含以下各项的组：鉴定或检测受试者中遗传性血管性水肿的存在与否，预测受试者中遗传性血管性水肿的发作或发展遗传性血管性水肿的风险，确定受试者的遗传性血管性水肿的病程，确定受试者是否患有遗传性血管性水肿的早期状态或遗传性血管性水肿的晚期或进展性状态，或确定受试者中生物标志物的水平是否随时间显著变化。如本文所用，术语“管理受试者治疗”或“受试者管理”优选是指在确定遗传性血管性水肿状态之后临床医生或医师的行为。例如，如果根据本发明的方法的结果是不确定的，或者有理由需要确认状态，则医师可以制定新的测试，例如测试受影响的蛋白质的功能和/或对c1酯酶抑制剂基因进行测序。备选地，如果状态指示对遗传性血管性水肿的治疗是适当的，则医师可以安排受试者接受遗传性血管性水肿的治疗。同样，如果状态为阴性或结果表明治疗成功，则可能无需进一步管理。然而，本领域技术人员将立即认识到，除了基因疗法之外，还可以应用任何合适和/或有效的疗法，包括本文公开的疗法。此外，本发明的实施方案是管理受试者治疗包括滴定作为遗传性血管性水肿的治疗而应用的药物剂量，例如c1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂或缓激肽拮抗剂的量，其被应用或施用给患者和/或受试者。在本发明方法的一些实施方案中，其中来自受试者的样品中存在的生物标志物的水平是在几个时间点确定的，或者将其与生物标志物的其他水平、临界值和/或对照中所述生物标志物的水平和/或两种生物标志物水平的比率的另一个值相比较，技术人员将应用或不应用治疗，或修改已应用的治疗以治疗或不治疗，或继续治疗遗传性血管性水肿。在本发明的实施方式中，除非有相反的指示，否则术语“处于发展疾病的风险中”和“处于患有疾病的风险中”在本文中可互换使用。现在通过以下附图和实施例进一步举例说明本发明，从这些附图和实施例可以得到进一步的特征、实施方案和优点。更具体地，图1至图9是表明所指示肽水平的箱线图；y轴显示了如实施例部分所述从过滤卡上的干血斑确定的以ng/ml为单位的所述指示肽的对数水平；x轴描述的是如实施例部分所述已分组的受试者的组。箱线图分别通过箱底部和顶部表示每组受试者的第25百分位和第75百分位；箱中间附近的带代表每个组的第50百分位数(即中位数)；须线(whisker)代表数据平均值上下的一个标准偏差；须线之间未包括的任何数据均用小圆圈或星形显示为异常值。水平线表示以ng/ml表示的指示肽的临界水平。图1是蛋白c4β的肽片段c4beta_[571-579]的箱线图，示出了500ng/ml的临界值。这样的临界值可以区分健康对照和患有1型hae和2型hae的患者。图2是蛋白质c1-inh的肽片段serping1_[242-249]的箱线图，示出了835ng/ml的临界值。这样的临界值可以区分健康对照者和患有1型hae的患者。图3是蛋白质c1qβ的肽片段c1qbeta_[178-186]的箱线图，示出了800ng/ml的临界值。该肽片段可以用作对照。图4是蛋白质c4α的肽片段c4alpha_[680-685]的箱线图，示出了260ng/ml的临界值。这样的临界值可以区分健康对照和患有1型hae或2型hae的患者。图5是蛋白质c4α的肽片段c4alpha_[786-791]的箱线图，示出了100ng/ml的临界值。这样的临界值可以区分健康对照和患有1型hae或2型hae的患者。图6是蛋白质c4β的肽片段c4beta_[294-297]的箱线图，示出了201ng/ml的临界值。这样的临界值可以区分健康对照和患有1型hae或2型hae的患者。图7是蛋白质c4γ的肽片段c4gamma_[1638-1641]的箱线图，示出了920ng/ml的临界值。这样的临界值可以区分健康对照和患有1型hae或2型hae的患者。图8是蛋白质c1-inh的肽片段serping1_[391-400]的箱线图，示出了392ng/ml的临界值。这样的临界值可以区分健康对照和患有1型hae的患者。图9是蛋白质c1qβ的肽片段c1q-beta_[63-77]的箱线图，示出了1690ng/ml的临界值。该肽片段可以用作对照。实施例在以下描述的实施例中，将过滤卡上的干血斑(缩写dbs)用作来自受试者的样品。实施例1：基于c3、c1q、c4和c1-inh断裂成肽的hae诊断方法及其质谱为了量化干血斑(dbs)提取物中c3、c1q、c4和c1-inh的含量/水平，使用了所描述的方案。提取血液成分后，将dbs提取物与二硫苏糖醇(ddt)原位反应以还原蛋白中的二硫键，并与碘乙酰胺(iaa)烷基化游离的–sh基团。然后用胰蛋白酶完全消化反应混合物。将含有待分析蛋白的肽片段的胰蛋白酶混合物注入lc/im-高分辨率质谱。对于所有的蛋白质，可以在血液基质中鉴定出没有处理后(post-transactional)修饰的肽(见表1“在对dbs提取物进行完全胰蛋白酶消化后获得的胰蛋白酶混合物中鉴定出的c3、c1q、c4和c1-inh肽，选择的肽具有+h加合物”)。对于所有肽，均获得了碎片光谱，并基于实验的碎片图谱，跃迁用于多反应监测质谱。接下来可以通过lc/mrm-ms测量胰蛋白酶肽。以下是使用lc/mrm-ms检测和定量的来自c3、c1q、c4和c1-inh的胰蛋白酶肽的实施例。设备为了检测供体生物样品中待定量蛋白的胰蛋白酶肽，使用了以下设备：设备型号提供商dbs打孔机(puncher)1296-071delfiaperkinelmer吸液管单通道和多通道eppendorf涡旋振荡器mixeruzusiovtx-300llmsco.ltd超声发生器sw12hsonoswiss培养器titramax1000heidolph离心机benchtopeppendorfuplcacuityiclasswatersim-qtofvionwaterstqtqs-microwaters数据挖掘工具progenesisnonlinear试剂为了检测来自受试者的样品中待定量蛋白的肽，使用了以下试剂。在一定程度上，数值取决于温度(例如ph值)，这些数值是在25℃的温度下确定的。内标储备液的制备内标(is1)储备溶液用作内标，通过将3mg亮氨酸-脑啡肽(英国waters提供)溶解在水中至400μg/ml的浓度来制备。样品和溶液的储存对照样品和研究样品(干血斑)保存在室温下。内标工作溶液在室温下保存直至使用。用于分析的样品制备从带有干血斑的过滤卡上切出一个直径为3.2mm的冲片(punch)，并经受以下方案：首先，为了提取，将100μl1mnh4hco3添加到冲片上，在60℃下，将材料超声处理10分钟，在37℃下，在振荡器上(700rpm)温育30分钟。其次，向溶液中添加125μl1mdtt，并将反应混合物在37℃下在振荡器上(700rpm)温育3小时。第三，添加375μl1miaa，并将溶液在黑暗中在振荡器上(700rpm)温育1.5小时。第四，添加10μl0.5μg/μl胰蛋白酶，将溶液在黑暗条件下在振荡器(700rpm)上温育3至16小时。将由此获得的包含血液提取物的消化物的溶液转移至ptfe(聚四氟乙烯)过滤板(acropreptm，pall，德国)上，然后通过3500rpm的离心转移至96孔板。之后，添加已知浓度为20至400ng/ml的100μl内标。方法本领域技术人员将认识到，使用质谱分析来检测来自受试者的样品中待分析蛋白的片段肽的方法也可以采用其他胰蛋白酶肽，特定的跃迁和特定的片段，其允许特异性地检测和/或定量来自受试者的所述样品中的hae相关肽片段及其异构体。如下所述，使用watersacquityiclassuplc(waters,uk)偶联vion质谱仪(waters,uk)对来自dbs提取物的待分析蛋白的肽片段进行lc/im-qtof-ms分析。1.色谱运行是在kinetexevoc18柱(phenomenex，德国)上进行的。将10μl提取物注入柱中，并使用从0％a(50mm甲酸水溶液)到100％b(50mm甲酸的乙腈:甲醇的体积比为1:1溶液)的线性梯度洗脱提取物中的化合物。2.将内标以200ng/ml的浓度连续注入水中，并且使用信号将整个批次的样品信号标准化。im-qtofms分析使用以下参数在阳离子模式下进行：-分析仪模式：灵敏度-ms模式：高清mse-毛细管电压：1.2kv-源温度：150℃-去溶剂温度：600℃-去溶剂气体；1000l/h-进样椎气体(conegag)：50l/h-低碰撞能量：6ev-高碰撞能量阶梯(highcollisionenergyramp)：20-40ev-扫描质量：50-1000m/z-扫描时间：0.5s使用watersacquityiclassuplc(waters,uk)偶联tq-s微型质谱仪(waters,uk)对dbs提取物中的待分析蛋白的肽片段进行lc-msm-ms分析。对于实施例，使用以下参数定量肽片段：1.色谱运行是在kinetexevoc18柱(phenomenex，德国)上进行的。将10μl提取物注入柱中，并使用从0％a(50mm甲酸水溶液)到100％b(50mm甲酸的乙腈:甲醇的体积比为1:1溶液)的线性梯度洗脱化合物。2.对于内标，监测mrm跃迁556.24→119.97。对于每种肽，如实施例2所示使用特异性跃迁。使用以下参数以阳离子模式进行mrm-ms分析：-毛细管电压：1.2kv-锥电压：20v-源温度：150℃-去溶剂温度：600℃-去溶剂气体：1000l/h-进样椎气体：50l/h-碰撞能量：20v-碰撞池入口：30ev-碰撞池出口：30ev。实施例2：定量健康供体的干血斑中蛋白质c1q、c4、c1-inh和c3的肽片段使用实施例1中概述的方法，蛋白质c1q、c4、c1-inh和c3的不同肽片段是使用来自总共270名健康受试者的dbs定量的。对于补体c1q，可以量化以下胰蛋白酶肽，其中括号中的数字表示肽的第一个氨基酸和最后一个氨基酸在c1q氨基酸序列中的位置(序列以n末端位于左侧，c末端位于右侧表示)。这些肽如表1所示：表1：所有的补体c1q胰蛋白酶肽均可用于区分健康受试者和遗传性血管性水肿患者。所述肽中的两个，即具有mrm跃迁510.26→254.58的c1q-b_[178-186]和具有mrm跃迁495.25→774.5的c1q-b_[63-77]用作代表性实例(参见实施例3)。对于补体c3，可以量化以下胰蛋白酶肽，其中括号中的数字表示肽的第一个氨基酸和最后一个氨基酸在c3氨基酸序列中的位置(序列以n端位于左侧，且c端位于右侧表示)。这些肽如表2所示：表2：所有的补体c3胰蛋白酶肽均可在测定中使用。所述肽中的两个，即具有mrm跃迁604.8→327.22的c3beta_[489-497]和具有mrm跃迁824.74→798.44的c3calpha1_[814-834]_cys_cam：816用作说明性实例(参见实施例3)。对于补体c4，可以量化以下胰蛋白酶肽，其中括号中的数字表示肽的第一个氨基酸和最后一个氨基酸在c4氨基酸序列中的位置(序列以n端位于左侧，c端位于右侧表示)。这些肽如表3所示。表3：所有的补体c4胰蛋白酶肽均可用于区分健康受试者和遗传性血管性水肿患者。对于所述肽，即具有mrm跃迁375.2→536.28的c4alpha_[680-685]，具有mrm跃迁359.69→490.26的c4alpha_[786-791]，具有mrm跃迁285.66→322.19的c4beta_[294-297]，具有mrm跃迁466.26→243.13的c4beta_[571-579]和具有mrm跃迁232.64→322.19]的c4gamma_[1638-1641]用作代表性实例(请参见实施例3)。对于补体c1-inh(也称为serping1)，可以量化以下胰蛋白酶肽，其中括号中的数字表示肽的第一个氨基酸和最后一个氨基酸在c1-inh氨基酸序列中的位置(序列以n端位于左侧，c端位于右侧表示)。这些肽如表4所示。表4：所有补体c1-inh胰蛋白酶肽均可用于区分健康受试者和遗传性血管性水肿患者。两种肽，即具有mrm跃迁455.74→696.33的serping1_[242-249]和具有mrm跃迁593.35→455.79]的serping1[391-400]用作代表性实例(参见实施例3)。实施例3：定量dbs提取物中蛋白c3、c1q、c4和c1-inh的胰蛋白酶肽片段，所述dbs提取物来自健康受试者和在serping1基因中具有已知致病变异的遗传性血管性水肿患者。hae患者被送至参与中心的所有1/2型遗传性血管性水肿疾病患者或强烈假定他们患有1/2型遗传性血管性水肿疾病的患者均被纳入研究。在本研究中考虑的所有患者中，均使用诸如下一代测序、sanger测序和/或多重连接依赖性探针扩增等的技术确认了serping1突变。蛋白质c4使用实施例1中概述的方法，在来自总共270名健康受试者的dbs中，对蛋白c4的肽片段c4alpha_[680-685]，c4alpha_[786-791]、c4beta_[294-297]、c4beta_[571-579]和c4gamma_[1638-1641]的含量进行了定量。类似地，在来自总共135名先前经遗传诊断的遗传性血管性水肿患者的dbs中，对蛋白c4的肽片段c4alpha_[680-685]、c4alpha_[786-791]、c4beta_[294-297]、c4beta_[571-579]和c4gamma_[1638-1641]的含量进行了定量。对于该测定，纯的合成肽被获得并用于获得标准曲线，该标准曲线用于定量源自血液样品的肽。标准曲线的线性反映在下表5中的r2值中。表5：如下表6所示，与健康受试者相比，遗传性血管性水肿患者中蛋白c4的肽c4alpha[680-685]、c4alpha_[786-791]、c4beta_[294-297]、c4beta_[571-579]和c4gamma_[1638-1641]在统计学上显著减少(p<0,0001)。各种肽的值以ng/ml为单位。表6：蛋白质c1-inh使用实施例1中概述的方法，在来自总共270名健康受试者的dbs中，对蛋白c1-inh的肽片段serping1_[242-249]和serping1_[391-400]的含量进行了定量。类似地，在来自总共135名先前经遗传诊断的遗传性血管性水肿患者的dbs中，对蛋白c1-inh的肽片段serping_[242-249]和serping1_[391-400]的含量进行了定量。对于该测定，纯的合成肽被获得并用于获得标准曲线，该标准曲线用于定量源自血液样品的肽。标准曲线的线性反映在下表7中的r2值中：表7：如下表8所示，与健康受试者相比，1型遗传性血管性水肿患者中的蛋白c1-ihn的serping_[242-249]和serping1_[391-400]在统计学上显著降低(p<0,0001)。各种肽的值以ng/ml为单位。表8：对于研究中包括的所有样品，可以将1型hae患者与健康对照(非hae)区分开。蛋白质c1q使用实施例1中概述的方法，在来自总共270名健康受试者的dbs中，对蛋白c1q的肽片段c1q-b_[178-186]和c1q-b_[63-77]的含量进行了定量。类似地，在来自总共135名先前经遗传诊断的遗传性血管性水肿患者的dbs中，对蛋白c1q的肽片段c1q-b_[178-186]和c1q-b_[63-77]的含量进行了定量。对于该测定，纯的合成肽被获得并用于获得标准曲线，该标准曲线用于定量源自血液样品的肽。标准曲线的线性反映在下表9中的r2值中。表9：如下表10所示，与健康受试者相比，在1型遗传性血管性水肿患者中，蛋白c1q的肽片段c1q-b_[178-186]和c1q-b_[63-77]没有在统计学上显著减少。各种肽的值以ng/ml为单位。表10：蛋白质c3使用实施例1中概述的方法，在来自总共270名健康受试者的dbs中，对蛋白c3的肽片段c3beta_[250-258]的含量进行了定量。类似地样，在来自总共135名先前经遗传诊断的遗传性血管性水肿患者的dbs中，对蛋白c3的肽片段c3beta_[250-258]的含量进行了定量。对于该测定，纯的合成肽被获得并用于获得标准曲线，该标准曲线用于定量源自血液样品的肽。标准曲线的线性反映在下表11中的r2值中。表11：如下表12所示，与健康受试者相比，在1型遗传性血管性水肿患者中，蛋白c1q的c3β_[250-258]在统计学上不显著降低。各种肽的值以ng/ml为单位。表12：实施例4：确定dbs提取物中生物标志物临界水平，所述dbs提取物来自健康受试者和在serping1基因中具有已知致病变异的遗传性血管性水肿患者。基于实施例3的数据和结果，并使用合成肽作为serping_[242-249]、c4alpha_[680-685]、c4alpha_[786-791]、c4beta_[294-297]、c4beta_[571-579]、c1q-beta_[178-186]、c4gamma_[1638-1641]、serping1_[391-400]和c1q-beta_[63-77]的校准标准，根据经验确定每种肽的临界水平。肽临界值c4beta_[571-579]500ng/mlserping1_[242-249]835ng/mlc1q-beta_[178-186]800ng/mlc4alpha_[680-685]260ng/mlc4alpha_[786-791]100ng/mlc4beta_[294-297]201ng/mlc4gamma_[1638-1641]920ng/mlserping1_[391-400]392ng/mlc1q-beta_[63-77]1690ng/ml结果示于图1至9中。对于研究中包括的所有样品，可以将hae患者与健康对照(非hae，nc)区分开。在说明书、权利要求书、序列表和/或附图中公开的本发明的特征可以单独地以及它们的任何组合都是用于以其各种形式实现本发明的材料。当前第1页12