分析赘生性细胞和赘瘤相关细胞的方法及其用途与流程
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年1月3日提交的美国专利申请序列号15/861,352的自提交日期的优先权，该申请是2017年9月6日提交的国际申请pct/us2017/050322的部分连续案，该国际申请要求2016年9月6日提交的美国临时专利申请序列号62/384037的自提交日期的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
发明背景
癌症仍然是全球死亡的主要原因之一，据估计全世界每年有1270万例病例使两性同等地受到影响。到2030年，预计这一数字将增至2100万。
免疫系统与肿瘤发展密切相关，在疾病进展至转移期间尤其起到决定性作用。免疫系统对癌症的影响并无严格抑制性，因为免疫性与癌细胞之间的复杂串扰也增强了肿瘤生长。免疫系统涉及到癌症进展中现在一般被视为癌症的标志。因此，免疫系统如何对癌症作出反应决定了最终的结果。即使在对象的免疫系统确实对癌症产生显著的初始反应的情况下，癌症仍然可能通过各种机制逃避免疫反应的破坏性因素，这些机制包括免疫检查点蛋白的表达以触发免疫抑制。导致逃避免疫攻击的其他机制包括选择对免疫效应物具抗性的肿瘤变体(即，“免疫编辑”)和在肿瘤内逐渐形成免疫抑制环境。
免疫疗法寻求合理地重定向对象的免疫系统以有效地靶向癌症和/或防止免疫逃避。
技术实现要素：
提供了用于分析赘生性细胞和/或赘瘤相关细胞的方法。该方法的方面涉及检测赘瘤细胞和/或赘瘤相关细胞的异质性、每个细胞的程序性死亡配体1(pd-l1)表达和/或增殖。所述方法的方面包括以细胞计数方式测定标记的细胞悬浮液来定量每个细胞的异质性、每个细胞的pd-l1表达、增殖和/或其他参数，以检测赘瘤样品中是否存在赘生性细胞。所提供的方法的方面还包括基于这种分析的结果治疗对象。另外，还提供了可用于实施主题方法的试剂盒。
附图说明
当结合附图阅读以下详细描述时可最透彻地理解本发明。要强调的是，按照惯例，附图的各种特征不成比例。相反，为清楚起见，各种特征的尺寸任意地放大或缩小。附图中包括以下图式。
图1描绘了使用如本文所描述的pd-l1标记和流式细胞计数分析的pd-l1阳性对照和阴性对照细胞的清晰细胞计数分离。
图2描绘了用掺入阴性对照样品中的各种百分比的pd-l1阳性细胞制备的混合样品中pd-l1阳性细胞检测的线性关系。
图3描绘了基于mesf珠粒的标准化的pd-l1荧光，其用于如本文所描述的实施方案中使用的每个细胞的pd-l1定量。
图4描绘了肿瘤和免疫细胞子组的定量pd-l1表达分析以及源自患者的样品中表达pd-l1的细胞的特异性检测的验证。
图5提供了表2。
图6描绘了根据本文所描述的实施方案测定的肺肿瘤组织免疫细胞浸润物的增殖。
图7描绘了根据本文所描述的实施方案测定的肿瘤组织中巨噬细胞的损失和非t细胞的增加。
图8描绘了根据本文所描述的实施方案测定的肿瘤组织中存在的淋巴细胞中与二倍体相比非整倍性的增加。
图9描绘了根据本文所述方法的实施方案测定的dna含量与pd-l1表达的关系。
图10描绘了肺肿瘤异质性与pd-l1表达的关系。
图11描述了循环肿瘤细胞(ctc)的存在和肿瘤增殖之间的相关性。
图12描述了循环肿瘤细胞(ctc)的存在和肿瘤非整倍性之间的相关性。
图13描绘了通过流式细胞计数法(左)和循环肿瘤细胞(ctc)细胞计数法(右)获得的pd-l1对比dna含量的数据。
具体实施方式
提供了用于分析赘生性细胞和/或赘瘤相关细胞的方法。该方法的方面涉及检测赘瘤细胞和/或赘瘤相关细胞的异质性、每个细胞的程序性死亡配体1(pd-l1)表达和/或增殖。所述方法的方面包括以细胞计数方式测定标记的细胞悬浮液来定量每个细胞的异质性、每个细胞的pd-l1表达、增殖和/或其他参数，以检测赘瘤样品中是否存在赘生性细胞。所提供的方法的方面还包括基于这种分析的结果治疗对象。另外，还提供了可用于实施主题方法的试剂盒。
在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因此它们当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图具有限制性，原因是本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。
在提供值的范围的情况下，应理解，在这个范围的上限和下限与在这个规定范围内的任何其他规定值或居中值之间的每个居中值涵盖于本发明内，除非上下文另外明确指示，否则精确到下限单位的十分之一。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内并且还涵盖于本发明内，除非其是规定范围内的任何明确排除的限值。在规定范围包括限值中的一者或两者的情况下，排除那些所包括的限值中的任一者或两者的范围也包括于本发明中。
本文以数值前面带有术语“约”给出了某些范围。术语“约”在本文中用于提供其后面的确切数字以及接近或近似该术语后面的数字的数字的字面支持。在确定一个数字是否接近或近似一个具体列举的数字时，接近或近似的未列举数字可以是在给出具体列举的数字的上下文中提供了具体列举数字的基本等同数字的数字。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本发明的实施或测试中还可以使用与本文所描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但现在描述具有代表性的说明性方法和材料。
该说明书中的所有公布和专利都以引用的方式并入本文中，就如同每个单独的公布或专利都被具体地和单独地指出通过引用结合于此，并且以引用的方式并入本文中，以公开和描述在引用所述公布时相关联的方法和/或材料。任何公布的引用都是在申请日之前的公开，且不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于该公布。此外，所提供的公布日期可能不同于可能需要独立确认的实际公布日期。
应当注意，除非上下文另外明确指示，否则如本文和所附权利要求书中不使用数量词和“所述”包括复数指示物。还应注意，权利要求可以被撰写为排除任何可选要素。这样，该陈述旨在作为在叙述权利要求要素时使用诸如“单独”、“仅”等专有术语或使用“否定”限制的前提基础。
本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的是，本文所描述和说明的个别实施方案中的每一者具有离散的组分和特征，在不偏离本发明的范围或精神的情况下这些组分和特征可以容易地与其他若干实施方案中的任一者的特征分离或组合。任何所陈述的方法可以按所陈述事件的顺序或按逻辑上可能的任何其他顺序进行。
尽管为了功能性解释以及语法流畅性，已经描述了或将要描述设备和方法，但是应当清楚地理解，除非根据35u.s.c.§112明确表述，否则权利要求不应当被解释为必须以任何方式受到“装置”或“步骤”限制构造的限制，而是应当符合在等同的司法原则下权利要求所提供定义的含义和等同形式的全部范围，如果权利要求是根据35u.s.c.§112明确提出的，则应根据35u.s.c.§112给予完全的法定等同。
方法
如上所述，提供了检测赘生性细胞和/或赘瘤相关细胞的方法。赘生性细胞包括赘瘤细胞或来源于赘瘤的细胞，如肿瘤的细胞。赘瘤相关细胞包括与赘瘤相关的非赘生性细胞，例如在空间上与赘瘤相关的细胞，例如免疫细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞。赘瘤细胞包括可能在空间上与赘瘤相关或不相关但来源于赘瘤的细胞，例如来源于赘瘤的转移性细胞和/或循环肿瘤细胞。在一些情况下，本公开的方法可以包括这种赘生性细胞和/或赘瘤相关细胞的直接和/或间接检测。
可以使用各种标准将细胞鉴别为赘生性细胞。例如，在某些情况下，基于对细胞本身或细胞周围组织的细胞和/或亚细胞形态的观察，细胞可被鉴别为赘生性或潜在赘生性。在一些情况下，细胞行为可以表明细胞为赘生性的，例如但不限于增殖、迁移等。在一些情况下，标志物，例如但不限于增殖标志物、细胞表面标志物、癌症标志物等，可用于鉴别细胞为赘生性的。在某些情况下，检测基因表达，例如癌症标志物的表达、突变基因的表达、过表达、低表达等，可以表明一个细胞是否是赘生性的。
相应地，根据各种标准，细胞可被鉴别为与赘瘤相关。在一些情况下，基于在空间上与赘瘤相关但不满足赘生性细胞的标准(即，细胞是非赘生性的)，细胞可被鉴别为与赘瘤相关。可根据各种标准将细胞鉴别为非赘生性的，该标准包括但不限于例如形态学(例如，正常形态学)、行为(例如，增殖正常)、标志物表达(例如，缺乏癌症标志物表达)等。在一些情况下，细胞可以基于在空间上与赘瘤相关(即，在赘瘤附近或之内)以及是非赘生性细胞类型，例如但不限于免疫细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞)、基质细胞等，而被鉴别为与赘瘤相关。
本公开的方法可以包括检测赘瘤细胞和/或赘瘤相关细胞的异质性、每个细胞程序性死亡配体1(pd-l1)表达和/或增殖。在一些情况下，这些方法可以包括基于对从对象获得的样品的分析，对标记的细胞悬浮液进行细胞分析，以量化每个细胞的异质性、每个细胞的pd-l1表达、增殖和/或其他参数，从而检测样品和/或对象中是否存在赘生性细胞。
如上文所概述，实施方案针对检测表达高于预定阈值的程序性死亡配体1(pd-l1)的细胞的方法。可以在主题方法中检测pd-l1表达的细胞在各种情况下包括赘生性细胞和免疫细胞。因此，在一些情况下，在主题方法中检测的细胞例如赘生性细胞将具有超过预定阈值的每个细胞的pd-l1蛋白表达水平。
如本文所用的“每个细胞的pd-l1表达水平”或“每个细胞的pd-l1表达”意指细胞表面上存在的pd-l1分子的量。本公开的方法包括以细胞计数方式测定细胞样品以定量每个细胞的pd-l1表达，随后检测样品中具有超过预定阈值的每个细胞的pd-l1蛋白表达水平的一个或多于一个细胞。下文更详细描述的以细胞计数方式测定细胞样品的各种手段可以用于主题方法中。
表达pd-l1的细胞
如上文所概述，本公开提供了检测表达高于预定阈值的pd-l1的细胞的方法。可以基于pd-l1蛋白表达的水平或pd-l1编码转录物(即，mrna)表达的水平，在每个细胞的基础上定量pd-l1表达。在一些情况下，主题方法仅定量每个细胞的pd-l1蛋白表达并且不定量每个细胞的pd-l1转录物表达。在一些情况下，可以采用定量pd-l1蛋白水平与pd-l1转录水平的组合方法。
如下文更详细描述，本发明方法的实施方案可以包括以细胞计数方式测定细胞悬浮液以检测表达高于预定阈值的pd-l1的细胞。如本文所用的术语“以细胞计数方式测定”描述了在逐个细胞的基础上测量细胞参数，其中这种测量允许检测具有某个细胞参数或一组参数的个别细胞，或对共享某个细胞参数或一组参数的细胞群体进行计数。在主题方法中细胞学上测定的一个这样的参数是每个细胞的pd-l1表达。
pd-l1(也称为cd274)结合程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)，一种由pdcd1基因编码的蛋白质，所述基因编码在t细胞上表达的细胞表面受体。pd-1通过阻止t细胞的活化而起到免疫检查点的作用，这降低了自身免疫性并促进了自身耐受性。已经发现pd-l1在许多不同的癌细胞类型上表达。癌细胞上pd-l1的存在抑制t细胞活化，导致癌细胞免疫逃避。许多癌症疗法针对通过抑制pd-1/pd-l1相互作用来防止癌细胞免疫逃避。
本公开包括检测表达高于预定阈值的pd-l1的赘生性细胞。每个细胞的pd-l1表达水平高于预定阈值的赘生性细胞可能更加有可能有效地逃避宿主免疫系统。每个细胞的pd-l1表达水平高于预定阈值的赘生性细胞可能更加有可能受到针对破坏pd-1/pd-l1相互作用的疗法影响。在一些情况下，通过有效地定量赘生性细胞表面上的pd-l1表达并检测高于阈值水平表达pd-l1的赘生性细胞，可以预测靶向pd-1/pd-l1相互作用的疗法的有效性。
本公开包括鉴别对象中的赘瘤是否为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的方法。如本文所用的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性一般是指赘瘤对靶向pd-1与pd-l1之间的相互作用的治疗的反应性，包括例如通过使用针对pd-1和/或pd-l1的拮抗剂。因此，pd-l1表达水平高于预定阈值的细胞在一些情况下可以被称作抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性细胞。具有一个或多于一个抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性细胞的赘瘤在一些情况下可以被称作抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性赘瘤。可以预测或确定细胞或赘瘤对抗pd-1/pd-l1免疫疗法的反应性。举例来说，在一些情况下，检测表达高于预定阈值的pd-l1的细胞的存在的方法可以预测细胞所来源的赘瘤是抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的。在一些情况下，例如，表达高于预定阈值的pd-l1的细胞的存在肯定地鉴别细胞所来源的赘瘤是抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的。主题方法用于检测pd-l1表达水平高于预定阈值的细胞，所述细胞来源于各种不同赘瘤，在下文更详细地描述。
在本公开的方法中检测的细胞将具有高于预定阈值的pd-l1表达水平。因此，本公开的方法包括以细胞计数方式定量每个细胞的pd-l1表达水平，以鉴别表达高于预定阈值的pd-l1蛋白和/或pd-l1转录物的细胞。适用于本公开的pd-l1表达的预定阈值将根据各种因素而变化，所述因素包括例如测定的细胞类型(例如，细胞所来源的赘瘤的类型)、其他测量的细胞参数(例如，细胞周期参数、非整倍性参数等)以及是否检测到pd-l1蛋白或转录物。如下文更详细描述，以细胞计数方式确定pd-l1表达，其中pd-l1蛋白表达可以通过多种方案确定，包括但不限于使细胞与结合细胞表面上的pd-l1蛋白的标记的特异性结合成员接触。在一些情况下，以细胞计数方式确定pd-l1表达，其中pd-l1转录物表达可以通过多种方案确定，包括但不限于使细胞与结合细胞内的pd-l1转录物的标记的特异性结合成员接触。
在一些情况下，定量每个细胞的pd-l1表达可以包括将pd-l1特异性结合伴侣标记的细胞的pd-l1荧光校准至参考标准。根据情形而定，可以与测定的细胞平行地、连续地或同时以细胞计数方式测定参考标准。举例来说，在一些情况下，可以细胞计数方式测定参考标准以校准测定用于定量，然后可以使用校准过的细胞计数测定来测定标记细胞悬浮液样品。在一些情况下，可以将参考标准添加至(即，掺入)标记细胞悬浮液样品中，并且可以在细胞的细胞计数分析期间进行基于参考标准的校准用于定量标记的细胞的每个细胞表达。在一些情况下，可以在标记的细胞样品的每次运作之间或期间进行使用参考标准的校准。在一些情况下，可以在每个批次的运作之间或期间进行使用参考标准的校准。
用于将标记的细胞荧光校准至每个细胞的标志物表达的任何适宜的参考标准可以用于本文所描述的测定中，包括但不限于例如标准化的微球(即，珠粒)、标准化的对照细胞、标准化的荧光颗粒等。在一些情况下，可以使用光谱等效的微球标准，例如，等效可溶性荧光色素分子(mesf)珠粒或平均等效荧光色素(mefl)珠粒。适用于定量细胞计数法的微球标准将任意变化，一般包括用已知量的每个微球结合的荧光团标记的微球或具有用于结合荧光团标记的分子的已知价数的微球。用于定量细胞计数法的微球标准模拟荧光染料附着至靶细胞的细胞膜，并且允许校准细胞计数测定用于定量，所述测定包括例如流式细胞计数测定或细胞式细胞计数测定。
举例来说，在一些情况下，用于定量细胞计数法的微球标准将包括用不同量的荧光团标记的微球的两个或多于两个群体，包括例如2个群体、3个群体、4个群体、5个群体、6个群体等。所选择的荧光团一般将与所描述的方法的一个或多于一个标记的特异性结合成员中使用的荧光团相同或等效或相当。微球标准中适用的荧光团包括但不限于例如alexafluor488、alexafluor647、fitc、pe、cy5、apc等。在一些情况下，可以混合具有不同荧光团的两个或多于两个微球标准，例如，在主题方法中使用两个或多于两个不同标记的特异性结合成员的定量的情况下。在一些情况下，不混合具有不同荧光团的微球标准，并且可以采用结合有不同量的单一类型的荧光团的微球的不同群体。
微球标准可以直接偶联至荧光标记，或者在一些情况下，荧光标记的抗体可以结合至微球标准。在一些情况下，微球标准可以是非荧光的但“可标记的”。可标记的微球标准一般将具有已知的抗体结合能力，从而允许用已知量的使用者抗体将微球染色，所述抗体包括例如在本文所描述的方法中用作特异性结合成员的相同抗体。在一些情况下，可标记的微球标准可以与预标记的微球标准联合采用，从而允许确定方法中所采用的特定标记的特异性结合成员的荧光团与蛋白质(ftp)比率和/或进一步校准。用于可以在本文所描述的方法中使用的定量细胞计数法的各种不同的微球标准，包括例如荧光标记的微球标准和可标记的微球标准，包括但不限于例如从bangslaboratories,inc.(fishers,in)、bdbiosciences(sanjose,ca)等可商购的那些。
在一些实施方案中，标记的特异性结合成员的荧光和/或用所述荧光标记的细胞可以校准至微球标准(例如，通过评估用不同量的荧光团标记的微球的两个或多于两个群体的荧光)以建立标准曲线。在建立标准曲线之后或期间，可以测定标记的细胞悬浮液样品，并且可以确定每个细胞的pd-l1表达。可以将定量的每个细胞的pd-l1表达水平与预定阈值相比较，所述阈值包括例如基于每个细胞表达的pd-l1蛋白的分子数建立的阈值、基于背景荧光建立的阈值、基于pd-l1的背景表达(包括例如每个细胞的表达)建立的阈值等。
在一些情况下，每个细胞的pd-l1表达的预定阈值可以表示为每个细胞的pd-l1蛋白的分子数，包括但不限于例如每个细胞10个分子的阈值、每个细胞20个分子的阈值、每个细胞30个分子的阈值、每个细胞40个分子的阈值、每个细胞50个分子的阈值、每个细胞60个分子的阈值、每个细胞70个分子的阈值、每个细胞80个分子的阈值、每个细胞90个分子的阈值、每个细胞100个分子的阈值、每个细胞200个分子的阈值、每个细胞300个分子的阈值、每个细胞400个分子的阈值、每个细胞500个分子的阈值、每个细胞600个分子的阈值、每个细胞700个分子的阈值、每个细胞800个分子的阈值、每个细胞900个分子的阈值、每个细胞1000个分子的阈值、每个细胞1100个分子的阈值、每个细胞1200个分子的阈值、每个细胞1300个分子的阈值、每个细胞1400个分子的阈值、每个细胞1500个分子的阈值、每个细胞1600个分子的阈值、每个细胞1700个分子的阈值、每个细胞1800个分子的阈值、每个细胞1900个分子的阈值、每个细胞2000个分子的阈值等。
因此，在一些情况下，如果细胞被鉴别为在细胞表面上表达的每个细胞的pd-l1蛋白分子数高于上文所列的预定阈值中的一者或多者，那么细胞被检测为表达高于预定阈值的pd-l1。
在一些情况下，本文所描述的方法检测具有高于预定阈值的pd-l1表达水平的单个细胞。在一些情况下，具有高于预定阈值的pd-l1表达水平的单个检测细胞的存在被认为是显著的。在一些情况下，本文所描述的方法可以包括对于检测细胞来说具有高于预定阈值的pd-l1表达水平的细胞的阈值被认为是显著的(即，具有高于预定阈值的pd-l1表达水平的细胞群体的最小规模被认为是显著的)。根据情形而定，高于阈值表达pd-l1的细胞的检测群体的规模将变化，并且可以为一个细胞至数百万个细胞，包括但不限于例如一个细胞，一个细胞或多于一个、10个细胞或多于10个、100个细胞或多于100个、1000个细胞或多于1000个、10000个细胞或多于10000个、100000个细胞或多于100000个。
在一些情况下，表达高于预定阈值的pd-l1的细胞的检测群体的规模可以用相对术语表示。举例来说，群体的规模可以表示为样品中所有细胞的百分比、所分析的所有细胞的百分比、样品内特定类型的所有细胞的百分比、所分析的特定类型的所有细胞的百分比等。在一些情况下，检测群体的规模可以超过细胞悬浮液样品中的赘生性细胞的0.01％或多于0.01％，包括但不限于例如0.1％或多于0.1％、1％或多于1％、10％或多于10％等。
在一些情况下，为了将细胞(例如，赘瘤细胞)归类为表达pd-l1或可能为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的或检测为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的，那么检测为表达高于预定阈值的pd-l1的细胞群体的规模必须超过预定阈值。如上文所描述，检测群体的规模的阈值，例如，对于被认为表达pd-l1的赘瘤来说，将基于许多因素而变化并且在一些情况下可以是一个细胞。在一些情况下，检测群体的规模的阈值，例如，对于被认为表达pd-l1的赘瘤来说，群体必须超过一个细胞以上，包括两个细胞或更多个，包括但不限于例如样品中的赘生性细胞的0.01％或多于0.01％、样品中的赘生性细胞的0.1％或多于0.1％、样品中的赘生性细胞的1％或多于1％等。
细胞计数测定
如上文所概述，本公开的方法包括以细胞计数方式测定标记的细胞悬浮液。以细胞计数方式测定标记的细胞悬浮液的各种方法可以用于本文所述的方法中，包括但不限于例如使用流式细胞计数器以流式细胞计数方式测定、例如通过使用细胞式细胞计数器以细胞式细胞计数方式测定标记的细胞悬浮液等。可以针对每个细胞的pd-l1表达来测定标记的细胞悬浮液样品。在一些情况下，以细胞计数方式测定的额外细胞参数也可以用于检测本公开的赘生性细胞。因此，可以采用以细胞计数方式测定标记的细胞悬浮液的各种方法来测量各种细胞参数。
在一些实施方案中，以细胞计数方式测定细胞样品可以使用流式细胞计数法进行。流式细胞计数法是使用多参数数据来鉴别和区分流体介质中的不同颗粒(例如，细胞)类型，即，在标记(波长、强度)、大小等方面彼此不同的颗粒的方法。在以流式细胞计数方式分析样品时，首先将样品的等分试样引入流式细胞计数器的流动路径中。当在流动路径中时，样品中的细胞基本上一次一个地穿过一个或多于一个传感区，其中每个细胞单独地和个别地暴露于单一波长的光源(或在一些情况下两个或多于两个不同光源)，并且根据需要，为每个细胞单独地记录细胞参数的测量值，例如光散射参数和/或标志物参数，例如荧光发射。根据需要，实时分析为每个细胞记录的数据或将其储存于数据储存和分析工具(例如计算机)中供以后分析。
在基于流式细胞计数法的方法中，细胞在悬浮液中基本上一次一个地在流动路径中穿过一个或多于一个传感区，其中在每个区中每个细胞被能量源照射。能量源可以包括发射单一波长的光的发光器，例如由激光(例如，he/ne或氩)或汞弧灯或具有适当滤光器的led提供的光。举例来说，488nm的光可以用作具有单个传感区的流式细胞计数器中的发射波长。对于发射两个不同波长的光的流式细胞计数器来说，可以采用发射光的额外波长，其中所关注的特定波长包括但不限于：405nm、535nm、561nm、635nm、642nm等。在结合至多肽的标记的特异性结合成员由能量源激发之后，激发的标记发射荧光，并且当穿过一个或多于一个传感区时，可以由一个或多于一个荧光检测器检测每个细胞上多肽的定量水平。
在流式细胞计数法中，除了检测从荧光标志物标记的细胞发射的荧光以外，还使用检测器，例如光收集器，例如光电倍增管(或“pmt”)、雪崩光电二极管(apd)等，以记录当细胞穿过传感区并且被能量源照射时穿过每个细胞的光(一般称作前向光散射)、与穿过传感区的细胞的流动方向正交反射的光(一般称作正交或侧向光散射)。所获得的每种类型的数据，例如，前向光散射(或fsc)、正交光散射(ssc)和荧光发射(fl1、fl2等)，包含每个细胞(或每个“事件”)的单独参数。
流式细胞计数器还可以包括一个或多于一个电检测器。在某些实施方案中，可以采用电检测器来检测由穿过横跨颗粒/细胞的路径中的孔隙传播的电场的颗粒或细胞引起的干扰。具有电检测器的这类流式细胞计数器将含有对应的电能发射源，所述电能发射源横跨引导细胞所穿过的流动路径或孔隙传播电场。任何适宜的电场和/或场与适当检测器的组合可以用于检测和/或测量穿过场的颗粒(或细胞)，所述场包括但不限于例如直流电场、交流电场、射频场等。
流式细胞计数器还包括数据采集、分析和记录工具，例如计算机，其中多个数据通道在每个细胞穿过传感区时为每个细胞记录来自每个检测器的数据。分析系统的目的在于对细胞进行归类和计数，其中每个细胞自身呈现为一组数字化参数值，并且整体上累积样品的数据。
可以基于针对整个群体所收集的数据通过“门控”来分析所关注的特定细胞亚群。为了选择适当的门，绘制数据以便获得亚群的适当分离，例如，通过调整仪器的配置，包括例如激发参数、收集参数、补偿参数等。在一些情况下，通过在二维点图上绘制前向光散射(fsc)对比侧向(即，正交)光散射(ssc)来完成这个程序。流式细胞计数器操作员然后选择所需的细胞亚群(即，在门内的那些细胞)并排除不在门内的细胞。在需要时，操作员可以通过在计算机屏幕上使用光标在所需亚群周围画一条线来选择门。然后通过绘制仅在门内的那些细胞的其他参数(例如荧光)来进一步分析这些细胞。
可以采用能够获得荧光数据的任何流式细胞计数器，例如，如上文所描述。适用的流式细胞计数器包括利用使细胞基本上一次一个地流过传感区的各种不同工具，包括例如流动池、微流体芯片等。所关注的流式细胞计数器系统的非限制性实例是可获自以下商业供应商的那些，包括但不限于例如becton-dickenson(franklinlakes,nj)、lifetechnologies(grandisland,ny)、aceabiosciences(sandiego,ca)、beckman-coulter,inc.(indianapolis,in)、bio-radlaboratories,inc.(hercules,ca)、cytonome,inc.(boston,ma)、amniscorporation(seattle,wa)、emdmillipore(billerica,ma)、sonybiotechnology,inc.(sanjose,ca)、stratedigmcorporation(sanjose,ca)、unionbiometrica,inc.(holliston,ma)、cytekdevelopment(fremont,ca)、propellabs,inc.(fortcollins,co)、orflowtechnologies(ketchum,id)、handyeminc.(québec,canada)、sysmexcorporation(kobe,japan)、partecjapan,inc.(tsuchiura,japan)、baybioscience(kobe,japan)、furukawaelectricco.ltd.(tokyo,japan)、on-chipbiotechnologiesco.,ltd(tokyo,japan)、apogeeflowsystemsltd.(hertfordshire,unitedkingdom)等。
在一些实施方案中，以细胞计数方式测定细胞样品可以使用细胞式细胞计数器进行。如本文所用的术语“细胞式细胞计数器”(也称作“成像细胞计数器”或“自动成像细胞计数器”)一般是指能够使沉积在成像容器上或成像容器中的细胞成像以收集关于样品的所有或大多数细胞的数据的自动或半自动细胞成像装置。在细胞式细胞计数法中，可以根据多种不同方法进行成像。在一些情况下，细胞式细胞计数器可以收集成像容器上或成像容器中存在的细胞在低放大率(例如，5x、10x等)下的宽场图像，以鉴别细胞的位置和/或针对特定参数(例如，大小、形状、颜色、荧光等)筛选细胞。在鉴别细胞的位置之后，细胞式细胞计数器可以继续例如以有针对性的方式收集所有或一部分鉴别的细胞的更高放大率(例如，20x、40x、60x、100x等)图像。
在其他情况下，细胞式细胞计数器可以通过扫描成像容器使成像容器上或成像容器中存在的细胞成像。可以在低放大率或高放大率下进行扫描。在一些情况下，在高放大率下进行扫描以捕获所有或大多数细胞的图像。在一些情况下，在低放大率下进行扫描以鉴别在成像容器上或成像容器中细胞的位置。在鉴别细胞的位置之后，细胞式细胞计数器可以继续例如以有针对性的方式收集所有或一部分鉴别的细胞的更高放大率图像，或者可以在高放大率下重新扫描定位的细胞。
细胞式细胞计数器系统中使用的成像容器将变化。在一些情况下，常用的实验室成像装置，例如显微镜载玻片，可以充当细胞式细胞计数器系统中的成像容器。在一些情况下，细胞式细胞计数器成像容器可以专门设计用于特定的细胞式细胞计数器。适用的成像容器包括但不限于例如载玻片(例如，显微镜载玻片)、皿(例如，玻璃底成像皿)、板(例如，多孔成像板)等。成像容器一般将在容器的至少一部分中具有对于显微镜检查可修正的光学特性，例如光学透明度。成像容器可能具有或可能不具有个别的隔室。举例来说，用作成像容器的显微镜载玻片一般不具有个别的隔室，并且沉积在载玻片上的细胞可以围绕载玻片的表面散布。或者，用作成像容器的多孔成像板确实具有个别的隔室(即，孔)，一个或多于一个细胞可以沉积至所述隔室中。
细胞式细胞计数器包括成像组件，例如自动显微镜。细胞式细胞计数器的成像组件可以包括各种放大倍率(例如，5x、10x、20x、40x、60x、100x等)的一个或多于一个物镜，用于收集从成像的物体(例如，细胞)透射、反射或发射的光。由物镜收集的光一般将在被引导至图像捕获装置之前穿过一个或多于一个二向色镜、滤光器或透镜进行处理。
适合的图像捕获装置可以包括能够捕获数字图像的一个或多于一个数字相机(包括彩色和单色相机)以及储存数字图像和/或将图像传输至附加的图像处理电路或附加的储存装置供以后传输至图像处理电路的工具。适合的数字彩色相机将变化，并且一般将包括任何数字相机(例如，具有一个或多于一个ccd或cmos传感器)。适合的数字相机包括但不限于例如定制的数字相机、消费级数字彩色相机(例如，转换为供显微镜使用的消费级数字彩色相机)以及可购自各种制造商的那些数字显微镜彩色相机，包括但不限于例如dino-eye、dino-lite、jenoptikprogres、kopa、leica、motic、olympus、omano、optixcam、pixellink、zeiss等。
细胞式细胞计数器还包括数据采集、分析和记录工具，例如计算机，其中一个或多于一个数据通道为成像容器的每个细胞或大多数细胞记录来自一个或多于一个图像捕获装置的数据。分析系统的目的在于对细胞进行归类和计数，其中每个细胞自身呈现为一组数字化参数值，并且整体上累积样品的数据。在一些情况下，细胞式细胞计数器记录每个细胞的图像，并且可以连接至使用者界面，在此这类图像可以由装置的使用者查看。
用于检测表达特定多肽的细胞的基于细胞式细胞计数器的方法可以包括使样品的细胞与荧光标记的特异性结合成员接触，并通过使用细胞式细胞计数器成像来检测荧光标记的细胞。如本文别处更详细描述，可以细胞计数方式定量每个标记细胞的荧光以鉴别每个细胞的特定多肽表达，例如，以检测细胞是否表达高于预定阈值的多肽。
可以采用能够获得荧光数据的任何细胞式细胞计数器，例如，如上文所描述。适用的细胞式细胞计数器包括利用自动细胞式细胞计数成像的各种不同工具来分析样品的所有或大多数细胞的那些细胞计数器。所关注的细胞式细胞计数器系统的非限制性实例是可获自以下商业供应商的那些，包括但不限于例如nexcelombiosciencellc(lawrence,ma)、moleculardevices,llc(sunnyvale,ca)、thorlabsinc.(newton,newjersey)、ttplabtechltd.(unitedkingdom)等。
本公开的方法包括以细胞计数方式定量每个细胞的特定多肽表达水平，以鉴别表达高于预定阈值的多肽的细胞。本公开的方法可以包括以细胞计数方式定量每个细胞的pd-l1表达，以鉴别表达高于预定阈值的pd-l1的一个或多于一个细胞。然而，除了pd-l1之外的其他标志物的水平也可以在本文所描述的方法中评估，包括例如细胞周期相关表达产物(例如，细胞周期相关rna、细胞周期相关多肽等)、免疫相关表达产物(例如，免疫相关rna、免疫相关多肽等)、dna含量等。具有例如高于或低于预定阈值的生物标志物水平或不具有这类其他标志物的细胞的检测可以用于鉴别适用于本文所描述的方法的其他细胞参数。
预定阈值可以用于基于如上文所描述的细胞的特定多肽表达或其他细胞参数来鉴别细胞，所述参数包括但不限于例如细胞周期标志物、非整倍性标志物等。
适用于本公开的多肽表达的预定阈值将根据所检测的多肽和特定情形而变化。在一些情况下，每个细胞的多肽表达的预定阈值可以表示为每个细胞的多肽分子数，包括但不限于例如每个细胞10个分子的阈值、每个细胞20个分子的阈值、每个细胞30个分子的阈值、每个细胞40个分子的阈值、每个细胞50个分子的阈值、每个细胞60个分子的阈值、每个细胞70个分子的阈值、每个细胞80个分子的阈值、每个细胞90个分子的阈值、每个细胞100个分子的阈值、每个细胞200个分子的阈值、每个细胞300个分子的阈值、每个细胞400个分子的阈值、每个细胞500个分子的阈值、每个细胞600个分子的阈值，每个细胞700个分子的阈值、每个细胞800个分子的阈值、每个细胞900个分子的阈值、每个细胞1000个分子的阈值、每个细胞1100个分子的阈值、每个细胞1200个分子的阈值、每个细胞1300个分子的阈值、每个细胞1400个分子的阈值、每个细胞1500个分子的阈值、每个细胞1600个分子的阈值、每个细胞1700个分子的阈值、每个细胞1800个分子的阈值、每个细胞1900个分子的阈值、每个细胞2000个分子的阈值等。
在其他情况下，预定阈值可以是标志物的相对水平。标志物的相对水平可以通过多种手段确定，包括例如通过作出两个单独的细胞群体中标志物的表达水平的比较来确定，所述细胞群体已知其主题标志物的水平不同。举例来说，已知具有高水平的标志物x的第一细胞群体例如在细胞计数器上测量并且与已知具有低水平的标志物x的第二细胞群体相比较，并且这个比较用于确定阈值水平，所述阈值水平可以用于将细胞分类为具有低水平或高水平的标志物x。
可以通过作出细胞群体内标志物水平的比较来确定标志物的相对水平，所述细胞群体为例如未知水平的标志物x的细胞群体或疑似含有具有不同水平的标志物x的细胞亚群的细胞群体。举例来说，在至少足够数量的细胞的细胞计数器上测量标志物x的水平，使得可以例如在直方图上绘制测量值，并且基于个别细胞的标志物x水平来揭示两个或多于两个细胞亚群之间的分离。因此，细胞计数器操作员然后可以确定亚群之间的阈值水平，所述阈值水平可以用于将细胞分类为属于特定亚群，例如，具有低水平的标志物x的亚群或具有高水平的标志物x的亚群。
在一些情况下，阈值可以基于细胞计数器的检测限。举例来说，如果细胞具有任何可检测水平的特定标志物，那么可以将细胞群体的细胞鉴别为具有特定标志物(即，对于特定标志物是阳性的)。同样地，如果细胞不具有可检测水平的特定标志物，那么可以将细胞群体的细胞鉴别为不具有特定标志物(即，对于特定标志物是阴性的)。因此，细胞计数器的检测水平可以用于根据需要确定标志物阈值。
在一些情况下，阈值可以基于先前确定的标志物水平，例如，来自先前进行的对照实验或先前获取的参考表达水平。举例来说，在先前分析的样品中确定的标志物水平可以用于确定标志物阈值水平。在一些情况下，可以使用从健康对象获得的细胞预期的标志物水平来确定正常标志物水平，以使得可以确定代表正常标志物范围的标志物阈值。在这类情况下，在正常标志物范围之外，即，高于或低于正常标志物范围的标志物表达被认为高于或低于特定标志物阈值。在一些情况下，使用这类先前确定的标志物水平或先前确定的阈值水平允许在不存在对照或参考细胞样品的情况下分析细胞和鉴别细胞亚群。
如上文所提到，本公开的方法可以包括测定细胞周期参数。适用的细胞周期参数包括但不限于例如增殖、细胞周期时相(g1、g2、m、g2-m、s、g0、g1后期等)，等等。细胞周期参数可以在每个细胞的基础上评估，包括例如鉴别细胞是否是增殖性的、鉴别细胞的细胞周期时相等。在主题方法中可以采用确定细胞的细胞周期参数的任何便利的手段。在一些情况下，方法不仅可以定量特定细胞类型，而且可以确定定量的细胞类型是否是增殖性的，包括例如在定量的细胞类型内增殖性细胞的数量或百分比。在一些情况下，方法不仅可以定量免疫细胞类型，而且可以确定定量的免疫细胞类型是否是增殖性的，包括例如在定量的免疫细胞类型内增殖性免疫细胞的数量或百分比。在一些情况下，方法可以确定增殖性肿瘤浸润淋巴细胞是否存在和/或其量。在一些情况下，方法可以确定增殖性cd4+细胞是否存在和/或其量。在一些情况下，方法可以确定增殖性cd8+细胞是否存在和/或其量。在一些情况下，方法可以确定cd4/cd8细胞的比率以及增殖性cd4和/或cd8细胞是否是增殖性的和/或其量。
在一些情况下，测定细胞的细胞周期可以包括确定细胞的dna含量(即，每个细胞的dna含量)。可以采用各种方法通过确定每个细胞的dna含量来测定细胞的细胞周期。在一些情况下，可以采用dna标记试剂(例如，含有固有荧光的核酸染料或染色剂)来标记细胞的dna，并且可以基于测量标记的强度来定量dna的量。取决于方法中所采用的细胞计数方法，dna含量可以用于以各种方式评估细胞周期。在一个实施方案中，例如，不管所采用的细胞计数法的类型(例如，流式细胞计数法、细胞式细胞计数法等)如何，可以在细胞计数器上分析用dna标记试剂标记的细胞的荧光强度并且绘制在直方图上。从直方图可以确定每个细胞的dna含量的相对量，从而允许鉴别每个细胞的细胞周期时相。在一些情况下，这种直方图可以代表细胞计数细胞周期谱，也称作细胞计数dna谱。
在一些情况下，测定细胞的细胞周期可以包括测定表达的细胞周期标志物(也称作细胞周期生物标志物)。如本文所用，表达的细胞周期标志物是指在细胞周期的一个或多于一个特定时相期间特异性表达或不存在的那些细胞标志物(例如，细胞表面标志物和细胞内标志物)。因此，对表达的细胞周期标志物具有特异性的标记的结合成员包括结合细胞的细胞周期机构的组分的那些特异性结合成员。在一些情况下，细胞周期生物标志物可以适用于确定细胞的细胞周期时相或确定细胞是否是增殖性的。适用于本文所描述的方法的细胞周期生物标志物将根据特定测定和/或待检测的特定细胞类型和/或细胞群体而变化。在一些情况下，可以用于本文所描述的方法中的细胞周期生物标志物包括但不限于例如ki67、细胞周期蛋白d1、细胞周期蛋白e、磷酸化组蛋白h3等。
可以各种方式检测表达的细胞周期标志物。举例来说，可以在蛋白质水平上检测表达的细胞周期生物标志物，例如，通过使用对细胞周期生物标志物蛋白具有特异性的标记的特异性结合成员。在一些情况下，可以在rna水平上检测表达的细胞周期生物标志物，例如，通过使用对细胞周期生物标志物rna具有特异性的标记的特异性结合成员。
如上文所提到，本公开的方法可以包括测定非整倍性。在主题方法中可以采用以细胞计数方式测量非整倍性的任何便利的方法。在一些情况下，基于测量的细胞dna含量可以将细胞鉴别为非整倍体，其中非整倍体细胞一般将具有异常高水平的dna含量，表示细胞基因组的全部或一部分的重复。可以采用与上文关于细胞周期评估所描述的用于评估dna含量的那些方法类似的方法来检测非整倍性。在一些情况下，相对dna含量大于或等于正常细胞的阈值dna含量值可以指示细胞是非整倍体，其中阈值可以大于或等于(≥)正常细胞的dna含量的1.05倍，包括但不限于例如≥正常细胞的dna含量的1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.10倍、≥1.11倍、≥1.12倍和≥1.13倍。
在一些情况下，可以采用染色体特异性探针或基因特异性探针来评估非整倍性。举例来说，使用基因特异性或染色体特异性探针的荧光原位杂交(fish)可以用于确定细胞的整体倍性或检测特定基因或染色体的重复。举例来说，在二倍体生物体中，针对特定基因或特定染色体的超过两个探针的存在可以指示主题细胞是非整倍体。
出于各种目的，可以在主题方法中采用倍性评估(例如，评估细胞的倍性，包括例如细胞是否是非整倍体、二倍体等)。举例来说，在一些情况下，可以采用倍性评估来确定群体的细胞是非整倍体还是二倍体，包括例如确定赘生性细胞是非整倍体还是二倍体、免疫细胞是非整倍体还是二倍体等。在一些情况下，倍性评估可以告知样品和/或对象的其他特征，例如，通过检测的细胞的倍性状态与对象中可能存在的其他细胞类型之间的关系。举例来说，在一些情况下，某些非整倍体细胞的鉴别可以指示和/或预测对象中除了检测的非整倍体细胞类型之外的赘生性细胞类型的存在，例如，对象的肿瘤组织中非整倍体免疫细胞的存在可以指示对象中循环肿瘤细胞的存在。在一些情况下，肺肿瘤组织中非整倍体免疫细胞的存在可以指示对象中循环肿瘤细胞的存在。
细胞参数的评估可以用于主题方法中，以检测具有通过测量所描述的参数而检测的一种或多于一种特征的细胞。举例来说，在一些情况下，可以确定检测的细胞是非整倍体细胞，例如，基于细胞的一个或多于一个评估的非整倍性参数。在一些情况下，可以确定检测的细胞是增殖性细胞，例如，基于细胞的一个或多于一个评估的细胞周期参数。可以检测到细胞具有通过测量所描述的参数而检测的特征的组合。举例来说，可以确定细胞是增殖性的并且是非整倍体。另外，当检测特定细胞时也可以使用特征的不存在，包括例如在细胞不是增殖性的情况下、细胞不是非整倍体的情况下等等。在一些情况下，检测的细胞可以具有一种特征并且缺乏另一种特征，例如，在细胞是增殖性的但不是非整倍体的情况下、细胞是非整倍体但不是增殖性的情况下等等。本文所描述的参数的任何组合可以用于本公开的方法。
作为一个实例，所确定的参数的有用组合可以包括与倍性状态相结合的每个细胞的pd-l1表达，包括例如其中检测到的细胞或细胞群包括高于预定阈值的每个细胞的pd-l1表达和非整倍体倍性状态。有用的组合还可以包括每个细胞的pd-l1表达与dna含量或细胞周期测定结果的组合。在一些情况下，可以使用异质性指标，其中这种指标是指示肿瘤细胞异质性的参数的组合。有用的异质性指标可以包括但不限于，例如，细胞周期和/或dna含量参数的组合，与例如细胞复杂性的测定结果(例如，侧向散射、ssc)和/或pd-l1表达测定结果相结合。在某些情况下，异质性指标将包括或组成为细胞周期或dna含量测定结果、侧向散射测量结果和pdl1定量结果的组合，包括其预定阈值。
在一些情况下，本公开的方法还可以包括确定主题细胞是否是免疫细胞。可以采用各种方法来确定主题细胞是否是免疫细胞，包括例如通过检测一个或多于一个免疫细胞标志物的存在或不存在，例如通过使细胞与对免疫细胞标志物具有特异性的标记的特异性结合成员接触。
举例来说，在一些情况下，可以基于表达高于预定阈值的pd-l1并且不用添加至细胞悬浮液中的免疫细胞特异性结合成员标记来检测非免疫赘瘤细胞。因此，在一些情况下，方法还可以包括确定所鉴别的细胞不是免疫细胞，例如通过使细胞悬浮液与一个或多于一个标记的免疫细胞特异性结合成员接触。
因此，在一些情况下，细胞和/或细胞群体可以被鉴别为对于特定免疫细胞标志物是阴性的或具有低于预定阈值的免疫细胞标志物的表达水平，这指示细胞实际上不是免疫细胞或特定类型的免疫细胞。适用的免疫细胞标志物，例如用于鉴别表达pd-l1的细胞不是免疫细胞的免疫细胞标志物，包括但不限于例如cd114、cd117、cd11a、cd11b、cd14、cd15、cd16、cd182、cd19、cd20、cd22、cd24、cd25、cd3、cd30、cd31、cd34、cd38、cd4、cd45、cd56、cd61、cd8、cd91、foxp3等。因此，在一些情况下，检测的赘瘤细胞可以进一步表征为缺乏一个或多于一个免疫细胞标志物的表达或具有低于预定阈值的表达，例如，使用针对免疫细胞标志物，包括例如上文所列的那些的抗体来检测。
在一些情况下，可以在本文所描述的方法中针对免疫细胞标志物的组合，包括但不限于例如此处所描述的标志物的任何组合的表达来测定细胞。举例来说，在一些情况下，可以针对cd8和cd45的表达来测定表达pd-l1的细胞，并且当检测的细胞对于cd8和cd45是阴性的或表达低于预定阈值的cd8和cd45(指示细胞不是免疫细胞)时，可以将所述细胞鉴别为不是免疫细胞。
在一些情况下，可以基于表达高于预定阈值的pd-l1并且用添加至细胞悬浮液中的免疫细胞特异性结合成员标记来检测细胞。因此，在一些情况下，方法还可以包括确定所鉴别的细胞是免疫细胞，例如，通过使细胞悬浮液与一个或多于一个标记的免疫细胞特异性结合成员接触。
因此，在一些情况下，细胞和/或细胞群体可以被鉴别为对于特定免疫细胞标志物是阳性的或具有高于预定阈值的免疫细胞标志物的表达水平，这指示细胞实际上是免疫细胞或特定类型的免疫细胞。适用的免疫细胞标志物，例如用于鉴别表达pd-l1的细胞是免疫细胞的免疫细胞标志物，包括但不限于例如cd114、cd117、cd11a、cd11b、cd14、cd15、cd16、cd182、cd19、cd20、cd22、cd24、cd25、cd3、cd30、cd31、cd34、cd38、cd4、cd45、cd56、cd61、cd8、cd91、foxp3等。因此，在一些情况下，检测的细胞可以进一步表征为具有一个或多于一个免疫细胞标志物的表达或具有高于预定阈值的表达，例如，使用针对免疫细胞标志物，包括例如上文所列的那些的抗体来检测。
在一些情况下，可以在本文所描述的方法中针对免疫细胞标志物的组合，包括但不限于例如此处所描述的标志物的任何组合的表达来测定细胞。举例来说，在一些情况下，可以针对cd8和cd45的表达来测定表达pd-l1的细胞，并且当检测的细胞对于cd8和cd45是阳性的或高于一个或多于一个预定阈值表达cd8和cd45(指示细胞是免疫细胞)时，可以将所述细胞鉴别为免疫细胞。
在一些情况下，本文所描述的方法还可以包括测定循环肿瘤细胞(ctc)的一个或多于一个标志物，例如，以确定检测的表达pd-l1的细胞是否是ctc。如本文所用的术语“ctc”一般是指从肿瘤(例如，肿瘤边缘)脱落并且已经被血流或淋巴系统扫走，由此导致ctc在体内循环的那些赘生性细胞。ctc标志物包括例如用于鉴别血流中的ctc的那些标志物，包括但不限于例如上皮细胞黏附分子(epcam)、细胞角蛋白8、细胞角蛋白18和细胞角蛋白19。在一些情况下，ctc可以进一步表征为对于一个或多于一个免疫细胞标志物是阴性的，包括但不限于例如本文所描述的那些免疫细胞标志物中的一者或多者。举例来说，在一些情况下，检测的ctc对于cd45是阴性的。
在一些情况下，可以基于一个或多于一个癌抗原和/或一个或多于一个癌相关抗原的表达来进一步鉴别和/或表征ctc。癌抗原的非限制性实例包括但不限于例如cd19、cd20、cd38、cd30、her2/neu、erbb2、ca125、muc-1、前列腺特异性膜抗原(psma)、cd44表面黏附分子、间皮素、癌胚抗原(cea)、表皮生长因子受体(egfr)、egfrviii、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)、mage-a1、il-13r-a2、gd2等。癌相关抗原还包括例如4-1bb、5t4、腺癌抗原、甲胎蛋白、baff、b淋巴瘤细胞、c242抗原、ca-125、碳酸酐酶9(ca-ix)、c-met、ccr4、cd152、cd19、cd20、cd200、cd22、cd221、cd23(ige受体)、cd28、cd30(tnfrsf8)、cd33、cd4、cd40、cd44v6、cd51、cd52、cd56、cd74、cd80、cea、cnto888、ctla-4、drs、egfr、epcam、cd3、fap、纤连蛋白外结构域b、叶酸受体1、gd2、gd3神经节苷脂、糖蛋白75、gpnmb、her2/neu、hgf、人分散因子受体激酶、igf-1受体、igf-i、igg1、l1-cam、il-13、il-6、胰岛素样生长因子i受体、整合素α5β1、整合素αvβ3、morab-009、ms4a1、muc1、黏蛋白canag、n-羟乙酰神经氨酸、npc-1c、pdgf-rα、pdl192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、rankl、ron、ror1、sch900105、sdc1、slamf7、tag-72、肌腱蛋白c、tgfβ2、tgf-β、trail-r1、trail-r2、肿瘤抗原ctaa16.88、vegf-a、vegfr-1、vegfr2和波形蛋白。
在一些情况下，本公开的方法包括检测表达高于预定阈值的pd-l1的细胞并进一步分析细胞，例如，基于检测上文所描述的ctc标志物中的一者或多者，以确定细胞是否是ctc。在一些情况下，从样品(例如，对象的血液样品)收集ctc或ctc群体并且根据本文所描述的方法测定ctc或ctc群体，例如，以确定ctc或群体的ctc是否表达高于预定阈值的pd-l1。
在一些情况下，本公开的方法可以基于一个或多于一个细胞分析参数间接检测和/或预测ctc的存在。例如，在一些情况下，基于样品细胞的测量的倍性状态，包括例如样品赘生性细胞的测量的倍性状态，可以间接检测或预测ctc的存在或不存在。在一些情况下，基于样品细胞的测量的增殖状态，包括例如样品赘生性细胞的测量的增殖状态，可以间接检测或预测ctc的存在或不存在。该方法可以包括将被分析的样品指定为包含一个或多于一个ctc的步骤，以使得其作为包含ctc的样品被标记或鉴别。根据所使用的样品，在一些情况下，本公开的方法可以将样品鉴别为包含ctc的样品，或者将来自包含其的对象的对象鉴别为包含ctc的对象。例如，在一些情况下，该方法可以包括将从中获得分析样品的对象指定为具有一个或多于一个ctc的步骤，以使得该对象被标记或鉴别为包含ctc的对象。
在这些方法中，可以确定或不确定ctc的实际存在和/或数量。相应地，用于间接检测ctc的样品可能包括也可能不包括ctc。例如，当直接从不含ctc或预期不含ctc的组织中获得分析样品时，该分析可以例如基于样品细胞的一个或多于一个细胞分析参数来鉴别具有ctc的对象，而样品中实际上不存在ctc。作为一个实例，可以从非血液组织(例如，非血液肿瘤)获得样品，并且可以基于非血液组织细胞的血细胞分析参数，将对象鉴别为例如在其血液系统中含有ctc。在一些实施方案中，当直接从可能含有ctc的组织获得分析样品时，该分析可以例如基于样品细胞的一个或多于一个细胞分析参数将对象和/或样品鉴别为具有ctc，而不直接检测样品中的ctc。作为一个实例，可以从血液组织(例如，血液)获得样品，并且可以基于除ctc之外的血液组织细胞的细胞分析参数，将对象和/或血液样品鉴别为含有ctc，或者将对象鉴别为含有ctc，例如在对象的血液系统中。
因此，本公开的方法可以包括将分析样品指定、标记或鉴别为包含一个或多于一个细胞群的一个或多于一个步骤，即，将样品指定、标记或鉴别为包含ctc的样品。本公开的方法还可以包括指定、标记或鉴别从中获得分析样品的对象包含一个或多于一个细胞群的一个或多于一个步骤，即，指定、标记或鉴别对象为包含ctc的对象。这些步骤可用于多种目的，包括例如提供关于以下方面的有用信息：可应用于对象的治疗类型、可应用于对象的治疗持续时间、是否需要进行后续分析和/或何时进行后续分析、是否需要进一步测试样品(例如直接分析ctc)等。例如，在一些情况下，一种方法可以间接检测或预测对象中ctc的存在和/或患病率(例如，通过将从对象获得的样品指定为含有ctc的样品)，如通过分析来自对象的样品所确定的，而不直接检测和/或以其他方式测量样品或对象或从对象收集的单独样品中的ctc。按照这种方法，在某些情况下，对象和/或样品可以被标记为含有ctc，并且可以鉴别和/或执行进一步的适当程序，例如进一步的测试和/或处理。
本公开的方法包括检测表达高于预定阈值的pd-l1的细胞。在一些情况下，本发明方法可以包括检测表达高于预定阈值的pd-l1的多个细胞。举例来说，在一些情况下，可以确定表达高于预定阈值的pd-l1的细胞群体的规模。可以细胞计数方式测量表达高于预定阈值的pd-l1的细胞群体的规模的定量。举例来说，在一些情况下，流式细胞计数器可以用于对表达高于预定阈值的pd-l1的细胞的数量进行计数。在一些情况下，细胞式细胞计数器可以用于对表达高于预定阈值的pd-l1的细胞的数量进行计数。通过对细胞的数量进行计数，可以确定pd-l1表达群体的规模。
样品
如上文所概述，本公开的方法包括检测赘瘤样品中是否存在表达高于预定阈值的pd-l1的赘生性细胞。本文所描述的方法可应用于各种赘瘤样品，其中赘瘤样品可以包括任何赘生性(即，异常生长)组织或细胞群体或细胞的样品。可以通过多种手段确定异常组织生长，包括例如通过将对象组织的生长与适当的正常或健康组织的生长相比较。赘瘤包括良性赘瘤、原位赘瘤、恶性赘瘤和不确定或未知性状的赘瘤。恶性赘瘤包括癌症，因此主题方法可以包括检测癌症样品中是否存在表达高于预定阈值的pd-l1的癌细胞。
本文所描述的方法可用于检测多种不同赘瘤样品中是否存在表达高于预定阈值的pd-l1的赘生性细胞，所述赘瘤样品包括例如从各种癌症获得的样品，包括但不限于例如急性成淋巴细胞白血病(all)、急性髓系白血病(aml)、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症(例如，卡波西肉瘤(kaposisarcoma)、淋巴瘤等)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌(肝外)、膀胱癌、骨癌(例如，尤文肉瘤(ewingsarcoma)、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤等)、脑干胶质瘤、脑肿瘤(例如，星形细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤等)、乳癌(例如，女性乳癌、男性乳癌、儿童期乳癌等)、支气管肿瘤，伯基特淋巴瘤(burkittlymphoma)、类癌肿瘤(例如，儿童期、胃肠等)、原发灶不明癌、心脏肿瘤、中枢神经系统(例如，非典型畸胎样/横纹肌样瘤、胚胎肿瘤、生殖细胞肿瘤、淋巴瘤等)、子宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓细胞白血病(cml)、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、导管(例如，胆管、肝外等)、原位管癌(dcis)、胚胎肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、成感觉神经细胞瘤、尤文肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(例如，眼内黑色素瘤、成视网膜细胞瘤等)、骨纤维组织细胞瘤(例如，恶性、骨肉瘤等)、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(gist)、生殖细胞肿瘤(例如，颅外、性腺外、卵巢、睾丸等)、妊娠滋养细胞疾病、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增多症(例如，朗格汉斯细胞(langerhanscell)等)、霍奇金淋巴瘤(hodgkinlymphoma)、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞肿瘤(例如，胰腺神经内分泌肿瘤等)、卡波西肉瘤、肾癌(例如，肾细胞、威尔姆氏肿瘤(wilmstumor)、儿童期肾肿瘤等)、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、白血病(例如，急性成淋巴细胞(all)、急性髓系(aml)、慢性淋巴细胞(cll)、慢性髓细胞(cml)、毛细胞等)、唇和口腔癌、肝癌(原发性)、原位小叶癌(lcis)、肺癌(例如，非小细胞、小细胞等)、淋巴瘤(例如艾滋病相关、伯基特、皮肤t细胞、霍奇金、非霍奇金、原发性中枢神经系统(cns)等)、巨球蛋白血症(例如，瓦尔登斯特伦
适用于本文所描述的方法的样品可以是从原发性肿瘤(例如，从活检或手术切除)或非肿瘤组织获得的样品。可以出于各种原因评估非肿瘤组织，包括但不限于为了癌症监测。举例来说，在一些情况下，可以测定非肿瘤组织以检测表达高于预定阈值的pd-l1的赘瘤细胞，由此鉴别赘瘤的存在。可以评估固体与流体非肿瘤样品。可以评估的适用的固体组织包括但不限于例如与现有癌症相邻的组织(例如，皮肤组织、肺组织、乳房组织等)、淋巴结组织等。可以评估的适用的流体样品基本上包括任何体液样品，包括但不限于例如血液样品、淋巴液样品等。
可以评估的癌症和肿瘤组织同样包括固体和液体样品。举例来说，在造血癌症的情况下，可以评估血液样品或骨髓样品。在一些情况下，根据本文所描述的方法评估的样品是实体肿瘤样品。实体肿瘤样品可以从多种不同的癌症获得，包括例如上文所列的那些癌症中的任一者。在一些情况下，实体肿瘤样品可以是上皮组织癌或上皮癌。
上皮癌包括癌瘤。癌瘤的非限制性实例包括腺泡癌、腺泡细胞癌、腺泡状癌、腺囊癌、腺样囊性癌、腺鳞癌、附件癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、成釉细胞癌、大汗腺癌、基底细胞癌、细支气管肺泡癌、支气管癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、透明细胞癌、胶样癌、筛状癌、原位管癌、胚胎癌、铠甲状癌、子宫内膜样癌、表皮样癌、癌前混合肿瘤、癌前多形性腺瘤、甲状腺滤泡癌、肝细胞癌、原位癌、管内癌、何氏细胞癌(hürthlecellcarcinoma)、炎性乳癌、大细胞癌、浸润性小叶癌、小叶癌、原位小叶癌(lcis)、髓样癌、脑膜癌、梅克尔细胞癌、黏液瘤、黏液表皮样癌、鼻咽癌、非小细胞癌、非小细胞肺癌(nsclc)、燕麦细胞癌、乳头状癌、肾细胞癌、硬癌、皮脂腺癌、单纯癌、印戒细胞癌、小细胞癌、小细胞肺癌、梭形细胞癌、鳞状细胞癌、终末导管癌、移行细胞癌、小管癌、疣状癌等。
在一些情况下，本文所描述的方法可用于检测上皮肿瘤样品中是否存在表达高于预定阈值的pd-l1的赘生性细胞，所述上皮肿瘤样品包括例如上皮肺癌肿瘤、上皮乳癌肿瘤等。在一些情况下，本文所描述的方法可用于检测非小细胞肺癌(nsclc)肿瘤中是否存在表达高于预定阈值的pd-l1的赘生性细胞。在一些情况下，上皮肿瘤是鳞状细胞癌、腺癌或腺鳞癌，并且检测的细胞包括鳞状细胞癌细胞、腺癌细胞或腺鳞癌细胞。
在一些情况下，可以对先前已被鉴别为pd-l1阳性的赘瘤样品进行本文所描述的方法。在一些情况下，可以对一般被认为或预期表达pd-l1的赘瘤样品进行本文所描述的方法。先前已经显示表达pd-l1的肿瘤包括但不限于例如肾细胞癌(rcc)、黑色素瘤、卵巢癌、nsclc等。在一些情况下，赘瘤样品可能先前已由免疫组织化学(ihc)鉴别为pd-l1阳性。pd-l1ihc作为疗法的伴随诊断在确定哪些患者将对疗法有反应方面已经存在问题。关于pd-l1ihc的问题包括评价者的主观性，处理可变性，半定量截断的差异，肿瘤细胞染色、免疫细胞染色、基质细胞染色的可变性等。在一些情况下，本文所描述的方法可以用于验证先前pd-l1ihc测定的结果。在一些情况下，本文所描述的方法可以用于代替pd-l1ihc测定，因为本公开的方法不会受到与pd-l1ihc相关的问题困扰。
可以使用任何便利的样品收集方法获得含有赘瘤细胞的赘瘤样品，包括但不限于用于获得固体组织活检体和活检抽吸物的那些活检方法。在一些情况下，可以作为出于除了获得样品之外的目的而进行的单独医疗程序，包括但不限于手术程序的一部分来获得含有赘生性细胞的样品。在其他情况下，含有赘生性细胞的样品可以独立地获得，例如，不作为单独医疗程序的一部分。样品收集方法将变化，并且将取决于例如收集是否作为额外医疗程序的一部分进行、有待获得的样品的特定类型、获得样品的主要目的和/或样品有待处理和/或分析的方法。
可以通过任何便利的手段收集本公开的方法中使用的样品。在一些情况下，从活检制备赘瘤样品。取决于癌症的类型和/或所进行的活检的类型，可以从固体组织活检或液体活检来制备样品。
在一些情况下，可以从手术活检来制备样品。用于手术活检的任何便利和适当的技术可以用于收集有待根据本文所描述的方法评估的样品，包括但不限于例如切除活检、切取活检、导丝定位活检等。在一些情况下，可以作为手术程序的一部分获得手术活检，所述手术程序具有除了获得样品之外的主要目的，例如，包括但不限于肿瘤切除、乳房切除术、淋巴结手术、腋窝淋巴结清扫、前哨淋巴结手术等。
在一些情况下，可以通过针活检来获得样品。用于针活检的任何便利和适当的技术可以用于收集有待根据本文所描述的方法分析的样品，包括但不限于例如细针抽吸(fna)、芯针活检、立体定位核芯活检、真空辅助活检等。
fna活检可以对可触知与不可触知的病灶进行，并且涉及将小规格针(例如，在18至25规格)引入病块或可疑区域中并提取细胞材料。fna是否与共同成像一起进行可以变化，并且将取决于各种因素，包括病灶是否可触知。在fna与共同成像一起进行的情况下，这种技术可以被称作图像引导的fna，并且可以包括但不限于放射成像技术，例如超声、计算机断层扫描(ct)、荧光检查、乳房造影、mri等。适用于收集如本文所描述的样品的fna技术和其变型将变化，并且特定技术的选择将取决于各种因素，包括但不限于例如对象的特征、特定检测病灶的特征、分析程序等。这类fna技术的变型包括但不限于例如开口针(即，“法国技术”)、负压技术、成像引导的fna等。因此，特定fna技术可能包括或可能不包括负吸力。举例来说，在法国技术fna中，在病灶内短而快速的冲程促使细胞逐出并且允许经由毛细管作用在针内有效收集而不需要负吸力。在一些情况下，例如，当有过量流体(例如，囊性病灶的流体)时，在通过fna收集样品中可以采用去除柱塞的注射器。在一些情况下，可以利用负压将样品吸入注射器中。在一些情况下，可以使用注射器支架或抽吸枪或抽吸手柄。
芯针活检可以对可触知与不可触知的病灶进行，并且涉及将中空芯针引入病块或可疑区域中并提取细胞材料。芯针活检是否与共同成像一起进行可以变化，并且将取决于各种因素，包括病灶是否可触知。在芯针活检与共同成像一起进行的情况下，这种技术可以被称作图像引导的芯针活检或立体定位芯针活检，并且可以包括但不限于放射成像技术，例如超声、计算机断层扫描(ct)、荧光检查、乳房造影、mri等。这类芯针活检技术的变型包括但不限于例如真空辅助的核芯活检、成像引导的核芯活检等。因此，特定芯针活检技术可能包括或可能不包括在插入核芯活检针之前在皮肤中制造的缺口。举例来说，在真空辅助的核芯活检中，制造小切口并且使中空探针穿过切口并引导至病灶部位，然后通过真空压力将一筒组织牵引至探针中。一般来说，芯针活检获得比所描述的fna技术更多的组织。
在一些情况下，术语“针活检”一般可以指可以在没有麻醉的情况下进行或者可能仅需要局部麻醉并且不被认为是手术程序的任何活检。在一些情况下，这类活检可以利用除“针”以外的装置，例如但不限于可以用于获得钻取活检，例如皮肤钻取活检的那些装置。这类装置包括但不限于例如用于收集皮肤钻取活检体的那些装置。
根据所采用的特定活检方法并且取决于特定对象和/或对象的特定病灶的具体情况，可以进行一次活检或多次活检。举例来说，在一些情况下，可以进行单个活检，例如单个fna活检或单个芯针活检，以充分地对特定对象或特定对象的病灶进行取样。在其他情况下，可以进行多个活检，例如多个fna活检或多个芯针活检，用于从对象或对象的病灶收集单个样品或多个样品。在收集多个活检体的情况下，活检的实际数量将根据特定对象和/或对象的特定病灶而变化，并且因此可以为2个至10个或多于10个活检，包括但不限于例如2个活检、3个活检、4个活检、5个活检、6个活检、7个活检、8个活检、9个活检、10个活检等。可以同时收集多个活检体，或可以经过预定的时间段，例如作为监测方案的一部分收集。
根据本文所描述的方法收集的赘瘤样品可以是固体、半固体或液体样品。举例来说，在一些情况下，根据所利用的收集技术的性质，例如，促使细胞解离或抽吸的技术，所收集的样品在收集时可以是液体样品。在其他情况下，根据所利用的收集技术的性质，例如，手术收集或核芯样品收集，所收集的样品在收集时可以是固体或半固体样品。在所收集的样品是固体或半固体样品的实施方案中，可以在收集后使样品的细胞解离以形成液体样品。使固体和半固体组织样品解离的方法包括但不限于机械解离、化学解离、酶促解离和其组合。
在一些情况下，可以对实体肿瘤样品进行机械均化。任何便利的机械均化方法可以用于制备用于下游步骤的固体组织样品，包括但不限于使用可商购的均化装置进行的均化，所述均化装置包括例如可获自incelldx(menlopark,ca)的那些，例如与incellprep(incelldx,inc)试剂盒一起提供的那些；可获自claremontbiosolutions(upland,ca)的那些，包括例如微量均化器(claremontbiosolutions)、微量破坏器(claremontbiosolutions)等。机械均化可以在任何适合的溶液中进行，包括例如缓冲液。在一些情况下，机械均化可以与化学或酶促均化组合。在一些情况下，在均化期间添加固定试剂。在一些情况下，在均化之后，包括紧接在均化之后添加固定试剂。在均化之后可以添加的下文更详细描述的固定试剂包括但不限于例如incellprep(incelldx,inc)。在一些情况下，固定溶液可以是组合固定/透化试剂。
在一些情况下，用于制备标记的细胞悬浮液样品的固定剂提供了以细胞计数方式分离表达pd-l1的细胞与不表达pd-l1的细胞的能力，包括但不限于例如有效地以细胞计数方式分离每个细胞的pd-l1表达水平高于预定阈值的细胞与每个细胞的pd-l1表达水平低于预定阈值的那些细胞。
在收集或制备(例如，解离或均化)样品后，可以根据需要固定和/或透化所得液体细胞悬浮液的细胞。因此，所述方法的方面可以包括通过使样品与适合的固定试剂接触来固定悬浮液的细胞。所关注的固定试剂是在期望的时间点固定细胞的那些。可以采用任何便利的固定试剂，其中适合的固定试剂包括但不限于温和交联剂。在一些情况下，温和交联剂可以是基于甲醛的固定剂，包括但不限于例如甲醛、多聚甲醛、甲醛/丙酮、incellfp(incelldx,inc)等。在一些情况下，可以采用基于醇的固定剂，包括但不限于例如甲醇/丙酮、乙醇等。在一些情况下，可以使用最终浓度为约1％至2％的基于甲醛的固定剂。
在一些情况下，通过使细胞与透化试剂接触来透化样品中的细胞。所关注的透化试剂是允许标记的生物标志物探针(例如，如下文更详细描述)进入细胞内环境的试剂。可以采用任何便利的透化试剂，其中适合的试剂包括但不限于：温和洗涤剂，例如tritonx-100、np-40、皂素等；甲醇等。
以细胞计数方式测定本公开的方法中使用的样品。因此，在一些情况下，可以处理赘瘤样品以产生适合于细胞计数测定的细胞悬浮液。用以产生适合于细胞计数测定的样品的处理可以包括例如上文所描述的任何个别的步骤或步骤的组合，包括例如均化、解离、固定、透化等。所需处理的量将取决于各种因素，包括样品的来源，其中固体组织样品一般将需要比液体样品更多的处理。举例来说，液体样品(例如，造血样品)的处理可能不需要均化或解离，因此根据需要可能仅需要固定和/或透化。
细胞悬浮液样品的细胞一般将用一个或多于一个标记的特异性结合成员标记。举例来说，本公开的方法一般将包括使细胞悬浮液样品与对pd-l1具有特异性的标记的特异性结合成员接触。其他特异性结合成员和其他标记试剂可以在主题方法中用于标记如本文所描述的细胞或群体细胞的各个方面，包括但不限于例如标志物(例如，免疫细胞标志物)、细胞核等。这类试剂在下文更详细地描述。
接触，例如使细胞悬浮液的细胞与特异性结合成员接触，可以通过任何便利和适当的手段进行。在一些情况下，通过将特异性结合成员的等分试样添加至细胞悬浮液中，可以使细胞悬浮液的细胞与特异性结合成员接触。可以根据需要孵育和/或后固定接触的细胞悬浮液。
试剂
如上文所概述，本发明方法包括检测表达高于预定阈值的每个细胞的pd-l1水平的细胞，因此包括适用于实施所述方法的各种试剂。举例来说，本发明方法一般包括通过使细胞与标记的特异性结合成员试剂接触来检测表达高于预定阈值的pd-l1的细胞，以允许进行细胞计数测定。
为了有效地以细胞计数方式定量每个细胞的特定多肽水平，可能需要从标记的特异性结合成员测量的荧光量与由特异性结合成员结合的多肽数量之间的直接相关性。在一些情况下，由标记的特异性结合成员发射的荧光量与由标记的特异性结合成员结合的多肽数量线性相关。一般来说但非排他地，标记的特异性结合成员将结合靶多肽的一个分子。因此，在一些情况下，从结合至细胞表面上的多肽的多个标记的特异性结合成员检测的荧光量与由细胞表达的多肽数量之间可能存在一对一的相关性。因此，在以细胞计数方式定量每个细胞的多肽表达的情况下，所使用的标记的特异性结合成员可以全部均匀地具有相同量的附着标记，使得每个特异性结合成员发射基本上相同量的荧光。举例来说，标记的特异性结合成员可以具有单个附着标记或单个荧光部分。或者，标记的特异性结合成员可以具有多个附着标记(例如，2个附着标记、3个附着标记、4个附着标记等)或多个荧光部分(例如，2个部分、3个部分、4个部分等)，条件是这多个对于标记的特异性结合成员的每个分子是相同的。
所关注的特异性结合剂包括抗体结合剂、蛋白质、肽、半抗原、核酸等。如本文所用的术语“抗体结合剂”包括足以结合至所关注的分析物的多克隆或单克隆抗体或片段。抗体片段可以是例如单体fab片段、单体fab'片段或二聚f(ab)'2片段。在术语“抗体结合剂”的范围内还有通过抗体工程改造产生的分子，例如，单链抗体分子(scfv)或通过替换重链和轻链的恒定区以产生嵌合抗体或替换恒定区与可变区的框架部分以产生人源化抗体而从单克隆抗体产生的人源化或嵌合抗体。所关注的核酸结合剂是特异性地结合或特异性地杂交至细胞中的生物标志物核酸的核酸。这些核酸的长度可以变化，只要所述长度足以使寡核苷酸充当特异性结合剂即可，并且在一些情况下，为13nt至100nt，例如14nt至50nt，例如15nt至25nt，包括但不限于例如15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt和25nt。根据需要，构成这些核酸结合剂的寡核苷酸可以是dna或rna，或其合成类似物。
如上文所描述，本文所描述的特异性结合成员一般将被可检测地标记(即，具有附着的可检测标记、由可检测标记结合等)。因此，除了特异性地结合或特异性地杂交至所关注的生物标志物的特异性结合域以外，特异性结合剂还可以包括可检测标记或可以由可检测标记结合或附着至可检测标记。所关注的可检测标记是荧光染料。荧光染料(荧光团)可以选自适合用于成像应用(例如，荧光显微镜检查)和细胞计数应用的许多染料中的任一者。大量染料可购自多种来源，例如，molecularprobes(eugene,or)和exciton(dayton,oh)。所关注的荧光团的实例包括但不限于4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸基二苯乙烯-2,2'-二磺酸；吖啶和衍生物，例如，吖啶、吖啶橙、吖啶黄、吖啶红和吖啶异硫氰酸酯；5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(edans)；4-氨基-n-[3-乙烯基磺酰基]苯基]萘二甲酰亚胺-3,5-二磺酸盐(荧光黄vs)；n-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；亮黄；香豆素和衍生物，例如，香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(amc，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；花青和衍生物，例如，焰红染料(cyanosine)、cy3、cy5、cy5.5和cy7；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)；5',5"-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素；二乙氨基香豆素；二乙烯三胺五乙酸盐；4,4'-二异硫氰酸基二氢-二苯乙烯-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酸基二苯乙烯-2,2'-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(dns，丹磺酰氯)；4-(4'-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸(dabcyl)；4-二甲氨基苯偶氮基苯基-4'-异硫氰酸酯(dabitc)；曙红和衍生物，例如，曙红和曙红异硫氰酸酯；赤藓红和衍生物，例如，赤藓红b和赤藓红异硫氰酸酯；乙锭；荧光素和衍生物，例如，5-羧基荧光素(fam)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(dtaf)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(joe)、异硫氰酸荧光素(fitc)、氯三嗪荧光素、萘并荧光素和qfitc(xritc)；荧光胺；ir144；ir1446；绿色荧光蛋白(gfp)；造礁珊瑚荧光蛋白(rcfp)；lissaminetm；丽丝胺罗丹明(lissaminerhodamine)、荧光黄(luciferyellow)；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；尼罗红(nilered)；俄勒冈绿(oregongreen)；酚红；b-藻红蛋白；邻酞二醛；芘和衍生物，例如，芘、芘丁酸酯和1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯；活性红4(cibacrontm亮红3b-a)；罗丹明和衍生物，例如，6-羧基-x-罗丹明(rox)、6-羧基罗丹明(r6g)、4,7-二氯罗丹明丽丝胺、罗丹明b磺酰氯、罗丹明(rhod)、罗丹明b、罗丹明123、罗丹明x异硫氰酸酯、磺酰罗丹明b、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明101(德克萨斯红(texasred))的磺酰氯衍生物、n,n,n',n'-四甲基-6-羧基罗丹明(tamra)、四甲基罗丹明和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(tritc)；核黄素；玫红酸和铽螯合物衍生物；氧杂蒽；或其组合。还可以使用本领域技术人员已知的其他荧光团或其组合，例如，可获自molecularprobes(eugene,or)和exciton(dayton,oh)的那些。
本公开的方法一般包括使用对pd-l1具有特异性的标记的结合成员(即，标记的pd-l1特异性结合成员)来标记细胞悬浮液的细胞，由此产生可以细胞计数方式测定的标记的细胞悬浮液。如上文所描述，根据情形而定，对pd-l1具有特异性的标记的结合成员可以特异性地结合pd-l1蛋白或可以特异性地结合pd-l1转录物。
在一些情况下，对pd-l1蛋白具有特异性的标记的结合成员可以特异性地结合在细胞表面上表达的pd-l1蛋白。人pd-l1蛋白是290个氨基酸的多肽，其具有残基1至约残基18的信号肽结构域、约残基19至约残基238的细胞外拓扑结构域、约残基239至约残基259的跨膜结构域和约残基260至290的细胞质拓扑结构域。人pd-l1的主要同种型(程序性细胞死亡1配体1同种型a前体np_054862.1)具有以下氨基酸序列：
人pd-l1还具有次要的可变剪接同种型(程序性细胞死亡1配体1同种型b前体np_001254635.1)，其具有以下氨基酸序列：
适用的对pd-l1蛋白具有特异性的特异性结合成员包括但不限于抗体，包括但不限于结合上述人pd-l1同种型中的一者或两者的抗体，所述同种型的序列已提供。在一些情况下，直接偶联至荧光团的抗pd-l1(即，抗cd274)抗体可用于所描述的方法。适用的可商购的直接偶联的抗pd-l1抗体包括但不限于例如下表1中所列的那些。
表1
在一些情况下，未偶联的抗pd-l1抗体可以用于本文所描述的方法，包括但不限于例如可获自商业供应商的那些未偶联的抗pd-l1抗体，包括例如上表1中所列的那些商业供应商。在一些情况下，未偶联的抗pd-l1抗体可以在使用前偶联，包括但不限于例如在未偶联的抗体偶联至荧光团的情况下。
抗pd-l1蛋白特异性结合成员不限于抗体，并且在一些情况下还可以包括例如抗pd-l1适体、抗pd-l1半抗原等。另外，对pd-l1蛋白具有特异性的合成特异性结合成员也可以来源于pd-1的pd-l1结合部分。举例来说，在一些情况下，pd-l1特异性结合成员可以被合理地设计成包括源自pd-1的pd-l1结合域，例如基于pd-1和pd-l1的结合相互作用，例如，如rcsb蛋白质数据库(pdb)结构4zqk中显示并且在zak等,(2015)structure23:2341-2348中描述；其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些情况下，本文所描述的方法可以利用对pd-l1转录物具有特异性的标记的结合成员。对pd-l1转录物具有特异性的标记的结合成员可以特异性地结合在细胞中表达的pd-l1mrna。适用的对pd-l1转录物具有特异性的特异性结合成员包括但不限于具有与pd-l1mrna序列的全部或一部分互补的序列的寡核苷酸。在一些情况下，适用的寡核苷酸探针可以包括与人pd-l1mrna转录物互补的序列，包括但不限于例如：
智人cd274分子(cd274)，转录变体1，mrna(nm_014143.3)：
智人cd274分子(cd274)，转录变体2，mrna(nm_001267706.1)：
适用的寡核苷酸探针可以基于dna或rna，并且可以包括但不限于用于原位杂交的那些探针，包括例如dna原位杂交探针、rna原位杂交探针(例如，核糖核酸探针)，以及具有一个或多于一个合成组分，包括例如一个或多于一个合成核苷碱基(例如，锁核酸(lna)等)的反义探针。这类探针的长度可以变化，在一些情况下，为13nt至100nt，例如14nt至50nt，例如15nt至25nt等。寡核苷酸探针可以直接与荧光团偶联，包括例如本文所描述的那些荧光团。在一些情况下，寡核苷酸探针可以与一个部分偶联，寡核苷酸杂交后，所述部分即允许结合标记。举例来说，寡核苷酸可以偶联至一个或多于一个生物素分子，从而允许寡核苷酸在杂交后加标记，例如，通过引入荧光标记的抗生蛋白链菌素。
适用于本文所描述的方法的试剂还可以包括对免疫细胞具有特异性的标记的特异性结合成员。这类特异性结合成员可以允许鉴别本公开的细胞群体内的免疫细胞和/或鉴别细胞不是如上文所描述的免疫细胞。
任何适宜的标记的免疫细胞特异性结合成员可用于本文所描述的方法，包括但不限于例如对个别的免疫细胞标志物具有特异性的抗体，包括但不限于例如抗cd114抗体、抗cd117抗体、抗cd11a抗体、抗cd11b抗体、抗cd14抗体、抗cd15抗体、抗cd16抗体、抗cd182抗体、抗cd19抗体、抗cd20抗体、抗cd22抗体、抗cd24抗体、抗cd25抗体、抗cd3抗体、抗cd30抗体、抗cd31抗体、抗cd34抗体、抗cd38抗体、抗cd4抗体、抗cd45抗体、抗cd56抗体、抗cd61抗体、抗cd8抗体、抗cd91抗体、抗foxp3抗体等。因此，在一些情况下，检测的赘瘤细胞可以进一步表征为缺乏一个或多于一个免疫细胞标志物的表达或具有低于预定阈值的表达，例如，如使用针对免疫细胞标志物，包括例如上文所列的那些的抗体来检测。
如上文例如关于dna含量的检测所描述，本文所描述的方法可以包括使用一种或多于一种dna标记试剂检测dna。各种dna标记试剂可以用于本文所描述的方法，包括但不限于：hoechst33342(2'-(4-乙氧基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-1h,1'h-2,5'-二苯并咪唑三盐酸盐)和hoechst33258(4-[6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1',3'-二氢-1h,2'h-2,5'-二苯并咪唑-2'-亚基]-2,5-环己二烯-1-酮三盐酸盐)和hoechst系列中的其他物质；syto40、syto11、12、13、14、15、16、20、21、22、23、24、25(绿色)；syto17、59(红色)、dapi、draq5tm(对双链dna具有高亲和力的蒽醌染料)、yoyo-1、碘化丙锭、yo-pro-3、to-pro-3、yoyo-3和toto-3、sytoxgreen、sytox、甲基绿、吖啶同二聚体、7-氨基放线菌素d、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。
上文所描述的标志物包括细胞内标志物。如本文所用的术语“细胞内标志物”是指在细胞内除了质膜外表面之外的细胞组分。这类组分可以是细胞的任何内部组分或可以在细胞的任何内部组分内，所述内部组分包括但不限于质膜的内表面、细胞质、细胞核、线粒体、内质网等。因此，细胞内标志物的标记或检测需要横跨至少质膜的外表面运输细胞内标志物的特异性标记或特异性结合剂。在一些情况下，用于细胞内标志物的标记或特异性结合剂可以是可渗透膜的，因此对于细胞内标志物的标记不需要调节膜渗透性。在一些实施方案中，用于细胞内标志物的标记或特异性结合剂可以是不可渗透膜的，因此对于细胞内标志物的标记需要调节膜渗透性，包括例如用一种或多于一种如本文所描述的透化试剂制备和/或处理细胞。
上文所描述的标志物包括细胞表面标志物。如本文所用的术语“细胞表面标志物”是指细胞的组分，其至少部分或完全暴露在细胞质膜的外表面上，因此可以在不调节细胞渗透性的情况下进入，例如，在不使用一种或多于一种如本文所描述的透化试剂的情况下。在一些情况下，细胞表面标志物包括细胞的组分，其具有暴露在细胞膜外表面上的部分，但也含有细胞内部分和/或跨膜部分。
如本文所描述并且对于本领域普通技术人员将显而易见的是，本文所描述的试剂和标记的任何组合可以用于所描述的方法，条件是这种组合是适当的且组分不在物理上或光学上有干扰。举例来说，可以和/或应当采用特定标记的变更或替代以允许有两种或更多种所需组分的组合在普通技术人员的技能范围内。作为非限制性实例，在生物标志物的特定荧光标记在光学上干扰特定发射波长的所需dna标记试剂(例如，具有重叠的发射光谱)的情况下，生物标志物的荧光标记可以用与所需dna标记试剂的发射光谱没有或有较少重叠的不同荧光标记替代。
治疗方法
如上文所概述，本公开包括了治疗对象的赘瘤的方法。术语“对象”、“个体”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物对象，特别是人类。
主题方法的方面一般包括鉴别对象中的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性赘瘤，并通过向对象施用抗pd-1/pd-l1免疫疗法来治疗对象。将对象中的赘瘤鉴别为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的可以根据本文所描述的任何方法进行，并且一般将包括以细胞计数方式检测表达高于预定阈值的pd-l1的赘瘤细胞。
根据本文所描述的方法治疗的对象包括具有疑似表达pd-l1的赘瘤的对象。在一些情况下，根据本文所描述的方法治疗的对象可以是具有疑似或显示免疫逃避症状的赘瘤的对象。各种指标可以表明赘瘤的免疫逃避，包括但不限于例如肿瘤生长或进展、免疫抑制、对免疫疗法无反应等。肿瘤微环境中存在的各种因素和事件可以直接指示免疫逃避或肿瘤进展，所述肿瘤进展间接指示免疫逃避，包括但不限于例如在不存在适当共刺激的情况下活化t细胞的存在、t细胞抑制分子(例如，hla-g、hla-e等)的肿瘤细胞表达、肿瘤抗原损失、mhc分子下调、调控性t细胞(treg)(例如，cd4+cd25+treg、cd4+cd25+foxp3+等)、cd1d限制性t细胞的存在、免疫抑制因子和源自肿瘤的细胞因子(例如，转化生长因子(tgf)-β、肿瘤坏死因子(tnf)-α、vegf、il-1、il-1β、il-6、il-8、il-10、gm-csf、i型ifn、神经节苷脂、受体结合癌相关表面抗原(rcas1)等)、免疫抑制性骨髓细胞群体(未成熟骨髓细胞群体，例如，表达inos(也称为nos2)或精氨酸酶1(arg1)的那些、源自骨髓的抑制细胞(mdsc)、调节性树突状细胞(dc)、替代性活化的m1和m2巨噬细胞、cd11b+gr1+mdsc等)的存在、tcrζ链下调、免疫抑制酶(例如，吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)、精氨酸酶、核因子κb激酶(ikk)2抑制剂等)上调，等等。在一些情况下，特定肿瘤特征也可以指示免疫逃避，包括但不限于例如肿瘤对细胞毒性途径的抗性(例如，如在具有fas突变的肿瘤中所见)、编码trail受体死亡受体5(dr5)的基因中的突变、抗凋亡分子(例如，flip、bcl-xl等)的过度表达，等等。
在一些情况下，本文所描述的检测对象中的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性细胞的方法可以用于限制向患有免疫相关病症的对象或发展免疫相关病症的风险增加的对象施用抗pd-1/pd-l1免疫疗法。由于在免疫细胞上天然表达，pd-l1靶向疗法可以负面影响对象的免疫细胞。在一些情况下，本公开的方法可以用于在抗pd-1/pd-l1免疫疗法之前筛选对象，包括例如最有可能受抗pd-1/pd-l1免疫疗法负面影响或具有抗pd-1/pd-l1免疫疗法所致的不良事件的那些对象，包括例如患有免疫相关病症的那些对象。
免疫相关病症的非限制性实例包括但不限于例如自身免疫性病症，例如急性播散性脑脊髓炎(adem)、急性坏死性出血性白质脑炎、阿狄森氏病(addison'sdisease)、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗gbm/抗tbm肾炎、抗磷脂综合征(aps)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经异常、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳病(aied)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性血小板减少性紫癜(atp)、自身免疫性甲状腺病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病、巴洛病(balodisease)、白塞氏病(behcet'sdisease)、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯特莱曼病(castlemandisease)、乳糜泻、查加斯病(chagasdisease)、慢性疲劳综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、慢性复发性多灶性骨髓炎(crmo)、丘格-斯特劳斯综合征(churg-strausssyndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、克罗恩氏病(crohn'sdisease)、柯刚氏综合征(coganssyndrome)、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎(coxsackiemyocarditis)、crest疾病、原发性混合性冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(devic'sdisease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征(dressler'ssyndrome)、子宫内膜异位、嗜酸细胞性食管炎、嗜酸细胞性筋膜炎、结节性红斑、实验性变应性脑脊髓炎、伊文思综合征(evanssyndrome)、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球性肾炎、古德帕斯彻氏综合征(goodpasture'ssyndrome)、肉芽肿性多血管炎(gpa)(原称为韦格纳氏肉芽肿病(wegener'sgranulomatosis))、格雷夫斯氏病(graves'disease)、格林-巴利综合征(guillain-barresyndrome)、桥本氏脑炎(hashimoto'sencephalitis)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto'sthyroiditis)、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(henoch-schonleinpurpura)、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(itp)、iga肾病、igg4相关硬化性疾病、免疫调控性脂蛋白、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎、川崎综合征(kawasakisyndrome)、兰伯特-伊顿综合征(lambert-eatonsyndrome)、白细胞破碎性血管炎、扁平苔癣、硬化性苔藓、木样结膜炎、线状iga疾病(lad)、狼疮(sle)、慢性莱姆病(lymedisease)、美尼尔氏病(meniere'sdisease)、显微镜下多血管炎、混合性结缔组织病(mctd)、莫伦氏溃疡(mooren'sulcer)、穆-哈二氏病(mucha-habermanndisease)、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、嗜眠发作、视神经脊髓炎(德维克氏病)、嗜中性白血球减少症、眼部瘢痕性类天庖疮、视神经炎、复发性风湿病、pandas(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、帕-罗二氏综合征(parryrombergsyndrome)、帕森-特纳综合征(parsonnage-turnersyndrome)、睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血、poems综合征、结节性多动脉炎、i型、ii型和iii型自身免疫性多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、孕酮性皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺现象(raynaudsphenomenon)、反应性关节炎、反射交感性营养不良、莱特尔氏综合征(reiter'ssyndrome)、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、肉状瘤病、施密特综合征(schmidtsyndrome)、巩膜炎、硬皮病、斯耶格伦氏综合征(sjogren'ssyndrome)、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(sbe)、苏萨克氏综合征(susac'ssyndrome)、交感性眼炎、高安氏动脉炎(takayasu'sarteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(ttp)、托洛萨-亨特综合征(tolosa-huntsyndrome)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(uctd)、葡萄膜炎、血管炎、水疱性皮肤病、白癜风、韦格纳氏肉芽肿病(现称为肉芽肿性多血管炎(gpa))，等等。
在一些情况下，免疫相关病症还可以包括活化的免疫系统，例如，存在于对抗感染或其他免疫刺激病状的对象中。
在一些情况下，可以测试具有赘瘤的对象以确定对象的赘瘤的一个或多于一个细胞是否表达高于预定阈值的pd-l1，并且如果检测到一个或多于一个细胞，那么随后可以用抗pd-1/pd-l1免疫疗法治疗对象。可以测定任何赘瘤以评估对象的赘瘤是抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的可能性，包括对象的赘瘤是否先前已经显示免疫逃避的指标。
在一些情况下，在接受用于赘指标瘤的任何其他治疗之前，如本文所描述，评估诊断有赘瘤的对象以确定对抗pd-1/pd-l1免疫疗法的反应性的可能性。在一些情况下，在接受用于赘瘤的疗程同时，如本文所描述，评估诊断有赘瘤的对象以确定对抗pd-1/pd-l1免疫疗法的反应性的可能性。在一些情况下，在接受用于赘瘤的疗程之后，如本文所描述，评估诊断有赘瘤的对象以确定对抗pd-1/pd-l1免疫疗法的反应性的可能性。
可以在评估对象的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性之前、期间或之后施用于对象的赘瘤疗法将根据众多因素而变化，包括例如赘瘤的类型、对象的病史、一般健康状况和/或任何合并症等。适用的赘瘤疗法包括但不限于例如放射疗法、化学疗法、免疫疗法等。可以局部或全身施用赘瘤疗法，例如但不限于放射疗法、化学疗法、免疫疗法等。
在一些情况下，可以在疗程(包括但不限于例如免疫疗法)开始之前评估对象的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性。举例来说，在一些情况下，医学专业人员可以在施用抗pd-1/pd-l1免疫疗法之前测定对象以确定对象癌症的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性，并且只有当对象的赘瘤例如通过检测表达高于预定阈值的pd-l1的一个或多于一个细胞而被鉴别为可能是抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性时，医学专业人员才可以施用疗法。
在开始疗程之前可以评估对象以确定对象的赘瘤是否为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的时间量可以变化，并且可以为1天或短于1天的时间至一个月或长于一个月的时间，包括但不限于例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月等。在一些情况下，疗程可以在对对象的赘瘤的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性进行评估的同一天开始。
在一些情况下，可以在已经施用疗程之后评估对象的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性。举例来说，在一些情况下，可以在免疫疗法，包括但不限于例如抗pd-1/pd-l1免疫疗法的过程失败之后测定对象的赘瘤的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性。在一些情况下，如果评估将赘瘤鉴别为抗pd-1/pd-l1免疫反应性的，那么可以再次尝试抗pd-1/pd-l1免疫疗法。在一些情况下，如果评估将赘瘤鉴别为不是抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的，那么医学专业人员可能不会再次尝试抗pd-1/pd-l1免疫疗法。在一些情况下，指示赘瘤不是抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的评估可以指示有理由进行另一疗程(例如，非pd-l1免疫疗法、化学疗法、放射疗法等)。
在疗程已经结束之后可以评估对象以确定对象的赘瘤是否为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的时间量可以变化，并且可以为1天或短于1天的时间至一个月或长于一个月的时间，包括但不限于例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月等。在一些情况下，对象的赘瘤的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的评估在疗程结束的同一天进行。在一些情况下，可以在对象的长期随访评估期间进行抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的评估。在疗程之后进行长期随访的时长将变化，并且可以为3个月或短于3个月的时间至10年或长于10年的时间，包括但不限于例如3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年等。
在一些情况下，可以在治疗对象的赘瘤的疗程期间进行对对象是否具有抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性赘瘤的评估。举例来说，可以开始治疗对象的赘瘤的疗程，并且在疗程期间可以进行抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的一个或多于一个评估，例如，以对疗法进行监控。在一些情况下，对象可能正在接受免疫疗程，包括例如抗pd-1/pd-l1免疫疗程，并且可以在免疫疗法期间进行对象的赘瘤的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的一个或多于一个评估。可以出于多种原因进行这类评估，包括但不限于例如评估是否继续免疫疗法、评估是否改变免疫疗程(例如，改变所施用的免疫疗法药物、改变所施用的免疫疗法药物的剂量、改变施用频率等)。举例来说，如果在疗程期间的评估指示对象的赘瘤是抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的，那么可以将对象转换至抗pd-1/pd-l1免疫疗法，或可以增加对象的抗pd-1/pd-l1免疫疗法的剂量，或可以增加向对象施用抗pd-1/pd-l1免疫疗法的频率。相反地，如果在疗程期间的评估指示对象的赘瘤不是抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的，那么可以将对象转换至非抗pd-1/pd-l1免疫疗法，或可以减少或终止对象的抗pd-1/pd-l1免疫疗法的剂量，或可以减少或终止向对象施用抗pd-1/pd-l1免疫疗法的频率。
在疗程期间作出的评估在本文中也可以被称作监控，包括监控抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性。除了监控接受抗pd-1/pd-l1免疫疗法的对象的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性之外，主题方法还包括在不是抗pd-1/pd-l1免疫疗法治疗的疗程期间监控对象的赘瘤的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性。举例来说，在一些情况下，可以监控经历放射疗法的对象的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性，并且如果对象的赘瘤被鉴别为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的，那么可以与放射疗法联合或代替放射疗法来起始抗pd-1/pd-l1免疫疗程。在一些情况下，可以监控经历化学疗法的对象的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性，并且如果对象的赘瘤被鉴别为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的，那么可以与化学疗法联合或代替化学疗法来起始抗pd-1/pd-l1免疫疗程。在一些情况下，可以监控经历非抗pd-1/pd-l1免疫疗法(即，具有除pd-l1或pd-1之外的标靶的免疫疗法)的对象的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性，并且如果对象的赘瘤被鉴别为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的，那么可以与非抗pd-1/pd-l1免疫疗法联合或代替非抗pd-1/pd-l1免疫疗法来起始抗pd-1/pd-l1免疫疗程。
治疗具有为或预测为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的赘瘤的对象的方法一般将包括向对象施用抗pd-1/pd-l1免疫疗法。任何抗pd-1/pd-l1免疫疗法可以用于主题方法，包括但不限于例如包括向对象施用有效量的一种或多于一种抗pd-1/pd-l1治疗性拮抗剂的那些疗法，其中这类拮抗剂包括但不限于例如
纳武单抗
适用于本文所描述的方法的抗pd-l1拮抗剂(包括例如抗体)包括但不限于例如以下美国专利号中所描述的那些：7,722,868、7,794,710、7,892,540、7,943,743、8,168,179、8,217,149、8,354,509、8,383,796、8,460,927、8,552,154、8,741,295、8,747,833、8,779,108、8,952,136、8,981,063、9,045,545、9,102,725、9,109,034、9,175,082、9,212,224、9,273,135和9,402,888；其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
适用于本文所描述的方法的抗pd-1拮抗剂(包括例如抗体)包括但不限于例如以下所描述的那些：6,808,710、7,029,674、7,101,550、7,488,802、7,521,051、8,008,449、8,088,905、8,168,757、8,460,886、8,709,416、8,951,518、8,952,136、8,993,731、9,067,998、9,084,776、9,102,725、9,102,727、9,102,728、9,109,034、9,181,342、9,205,148、9,217,034、9,220,776、9,308,253、9,358,289、9,387,247和9,402,899；其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
包括一种或多于一种主题抗pd-1/pd-l1拮抗剂的组合物可以每天施用一次、每天施用几次或数次或甚至每天施用多次，这尤其取决于所治疗的适应症和处方医生的判断。
可以根据所治疗的疾患和所施用的药物组合物，例如所施用的抗pd-1/pd-l1药物组合物来选择施用方法。主题药剂的施用可以多种方式完成，包括但不限于药剂的局部施用，包括例如皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内，以及可能直接注射至指定器官或肿瘤，但是也可以使用全身施用。药物组合物的施用可以通过单一途径或同时通过数种途径。
“有效量”意指足以具有治疗作用的量。治疗赘瘤的有效量将使赘瘤的症状和/或大小通常调节至少约1％，包括但不限于例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％。这将引起例如受影响的细胞数量的统计学显著和可定量的变化。这种变化可以是原发性肿瘤大小的减小、远处器官中微转移数量的减少、复发性转移性疾病的减少等。
在一些实施方案中，本公开的方法可以提供某些优点，例如但不限于，例如，特定细胞类型的改善的检测、改善的治疗决策和/或改善的治疗结果等。改善的检测可以包括具有改善的特异性的检测、具有改善的灵敏度的检测以及具有改善的灵敏度和特异性的检测。在一些实施方案中，改善的检测的优点还可以包括更有效、更方便和/或更具成本效益的检测。改善的治疗决策不仅包括导致改善的治疗结果的决策，而且在某些情况下，还包括关于是否治疗对象的改善的决策、防止不必要的药剂施用的决策、更具成本效益、更有效和/或更方便的治疗等。在一些实施方案中，其他优点可以包括但不限于减少需要从对象收集的和/或分析的样品的数量和/或不同类型、改善对特定治疗方案的依从性、改善患者对处方治疗方案的信心等。
试剂盒
还提供了用于实施一种或多于一种上文所描述的方法的试剂盒。主题试剂盒可以变化很大。包括在主题试剂盒中的试剂和装置包括上文关于检测表达高于预定阈值的pd-l1的赘生性细胞的方法所提到的那些。
这些将包括例如pd-l1的特异性结合成员，包括例如对pd-l1具有特异性的抗体。主题试剂盒还可以包括一种或多于一种样品制备试剂，包括但不限于例如细胞固定剂、细胞透化试剂、细胞标记试剂、缓冲剂、稀释剂等。上述组分可以存在于单独的容器中，或一种或多于一种组分可以组合至单个容器，例如玻璃或塑料小瓶中。在一些情况下，本公开的试剂盒还可以包括样品制备装置，例如均化器。
试剂盒还可以包括样品获得装置，例如血液收集装置或活检收集装置。活检收集装置的非限制性实例包括但不限于例如针活检装置、核芯活检装置、钻取活检装置、手术活检装置、真空辅助活检装置等。在一些情况下，试剂盒还可以包括一种或多于一种用于细胞解离的试剂和/或装置，包括但不限于例如酶、酶抑制剂、洗涤剂、细胞解离介质或缓冲液、涡旋装置、章动装置、摇动装置等。主题试剂盒还可以包括对照试剂和样品，包括但不限于例如对照细胞样品(例如，阳性对照细胞样品、阴性对照细胞样品等)、校准试剂(例如，荧光珠粒、预标记细胞等)。
除了上述组分以外，主题试剂盒还可以包括用于实施主题方法的说明书。这些说明书可以多种形式存在于主题试剂盒中，所述形式中的一种或多于一种可以存在于试剂盒中。这些说明书可以存在的一种形式是作为适合的媒介或衬底上的印刷信息，例如，上面印刷信息的一张或多张纸、在试剂盒的包装中、在包装说明书中等。另一种工具将是上面已经记录信息的计算机可读媒体，例如，磁盘、cd等。另一种可以存在的工具是可以经由互联网使用的网站地址以在远端位点访问信息。任何便利的工具都可以存在于试剂盒中。
尽管有所附权利要求书，但本公开也由以下条款定义：
1.一种检测赘瘤样品中是否存在表达高于预定阈值的程序性死亡配体1(pd-l1)的赘生性细胞的方法，所述方法包括：
使所述赘瘤样品与对pd-l1具有特异性的标记的结合成员接触以产生标记的细胞悬浮液；
以细胞计数方式测定所述标记的细胞悬浮液来定量每个细胞的pd-l1表达，以检测所述赘瘤样品中是否存在表达高于预定阈值的pd-l1的赘生性细胞。
2.根据条款1所述的方法，其中所述以细胞计数方式测定还包括测定细胞周期。
3.根据条款2所述的方法，其中测定细胞周期包括定量每个细胞的dna含量。
4.根据条款2或3所述的方法，其中测定细胞周期包括检测表达的细胞周期标志物。
5.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述细胞悬浮液样品与dna标记试剂接触。
6.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述赘瘤样品与对表达的细胞周期标志物具有特异性的标记的结合成员接触。
7.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述以细胞计数方式测定还包括测定非整倍性。
8.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述检测的细胞是增殖性的。
9.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述检测的细胞是非整倍体。
10.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述标记还包括使所述赘瘤样品与至少一个对免疫细胞具有特异性的标记的结合成员接触。
11.根据条款10所述的方法，其中所述至少一个对免疫细胞具有特异性的标记的结合成员包括对淋巴细胞标志物cd45具有特异性的标记的结合成员。
12.根据条款10或11所述的方法，其中所述至少一个对免疫细胞具有特异性的标记的结合成员包括对淋巴细胞标志物cd8具有特异性的标记的结合成员。
13.根据条款10-12中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测对于至少一种免疫细胞标志物是阴性的细胞。
14.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述赘瘤样品是体液样品。
15.根据条款14所述的方法，其中所述体液样品是血液样品。
16.根据条款14或15所述的方法，其中所述检测的细胞是循环肿瘤细胞。
17.根据条款14-16中任一项所述的方法，其中所述检测的细胞是造血癌细胞。
18.根据条款1至13中任一项所述的方法，其中所述赘瘤样品是实体肿瘤样品。
19.根据条款18所述的方法，其中所述实体肿瘤是上皮肿瘤。
20.根据条款18或19所述的方法，其中所述实体肿瘤是肺癌肿瘤。
21.根据条款20所述的方法，其中所述肺癌肿瘤是非小细胞肺癌(nsclc)肿瘤。
22.根据条款18或19所述的方法，其中所述实体肿瘤是乳癌肿瘤。
23.根据条款18至22中任一项所述的方法，其中所述检测的细胞包括鳞状细胞癌细胞。
24.根据条款18至22中任一项所述的方法，其中所述检测的细胞包括腺癌细胞。
25.根据条款18至22中任一项所述的方法，其中所述检测的细胞包括腺鳞癌细胞。
26.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述赘瘤样品从活检制备。
27.根据条款26所述的方法，其中所述活检是固体组织活检。
28.根据条款27所述的方法，其中所述方法还包括从所述固体组织活检制备所述赘瘤样品。
29.根据条款28所述的方法，其中从所述固体组织活检制备所述赘瘤样品包括均化所述固体组织活检的组织。
30.根据条款26所述的方法，其中所述活检是液体活检。
31.根据条款30所述的方法，其中所述方法还包括从所述液体活检制备所述赘瘤样品。
32.根据条款26所述的方法，其中所述活检是细针抽吸(fna)活检。
33.根据条款32所述的方法，其中所述方法还包括从所述fna活检制备所述赘瘤样品。
34.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述标记的细胞悬浮液样品的所述细胞是固定的。
35.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述方法还包括固定所述赘瘤样品的所述细胞。
36.根据条款35所述的方法，其中固定所述赘瘤样品的所述细胞在所述接触之前进行。
37.根据条款35所述的方法，其中固定所述赘瘤样品的所述细胞在所述接触期间进行。
38.根据条款35所述的方法，其中固定所述赘瘤样品的所述细胞在所述接触之后进行。
39.根据条款35至38中任一项所述的方法，其中固定所述细胞包括使所述赘瘤样品的所述细胞与温和交联剂接触。
40.根据条款39所述的方法，其中所述温和交联剂包括基于甲醛的固定剂。
41.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是每个细胞100个或多于100个pd-l1分子。
42.根据条款41所述的方法，其中所述预定阈值是每个细胞500个或多于500个pd-l1分子。
43.根据条款42所述的方法，其中所述预定阈值是1000个或多于1000个pd-l1分子。
44.一种鉴别对象中的赘瘤是否为抗程序性死亡配体1(pd-l1)免疫疗法反应性的方法，所述方法包括：
使从所述赘瘤制备的细胞悬浮液样品与对pd-l1具有特异性的标记的结合成员接触以产生标记的细胞悬浮液；
以细胞计数方式测定所述标记的细胞悬浮液来检测是否存在各自表达超过预定阈值的pd-l1水平的细胞群体，以鉴别所述赘瘤是否为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的。
45.根据条款44所述的方法，其中所述以细胞计数方式测定还包括测定细胞周期。
46.根据条款45所述的方法，其中测定细胞周期包括定量每个细胞的dna含量。
47.根据条款45或46所述的方法，其中测定细胞周期包括检测表达的细胞周期标志物。
48.根据条款44至47中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述细胞悬浮液样品与dna标记试剂接触。
49.根据条款44至48中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述细胞悬浮液样品与对表达的细胞周期标志物具有特异性的标记的结合成员接触。
50.根据条款44至49中任一项所述的方法，其中所述以细胞计数方式测定还包括测定非整倍性。
51.根据条款44至50中任一项所述的方法，其中所述细胞群体是增殖性的。
52.根据条款44至51中任一项所述的方法，其中所述细胞群体是非整倍体。
53.根据条款52所述的方法，其中所述非整倍体细胞指示所述对象中循环肿瘤细胞的存在。
54.根据条款44至53中任一项所述的方法，其中所述标记还包括使所述细胞悬浮液样品与至少一个对免疫细胞具有特异性的标记的结合成员接触。
55.根据条款54所述的方法，其中所述至少一个对免疫细胞具有特异性的标记的结合成员包括对淋巴细胞标志物cd45具有特异性的标记的结合成员。
56.根据条款54或55所述的方法，其中所述至少一个对免疫细胞具有特异性的标记的结合成员包括对淋巴细胞标志物cd8具有特异性的标记的结合成员。
57.根据条款54至56中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以细胞计数方式测定所述标记的细胞悬浮液以检测增殖性免疫细胞是否存在。
58.根据条款57所述的方法，其中所述方法还包括定量增殖性免疫细胞的量。
59.根据条款54至58中任一项所述的方法，其中方法包括鉴别所述细胞群体对于免疫细胞标志物是否是阴性的。
60.根据条款44至59中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包括循环肿瘤细胞。
61.根据条款44至60中任一项所述的方法，其中所述赘瘤是造血癌症。
62.根据条款44至60中任一项所述的方法，其中所述赘瘤是实体肿瘤。
63.根据条款62所述的方法，其中所述实体肿瘤是上皮肿瘤。
64.根据条款62或61所述的方法，其中所述实体肿瘤是肺癌肿瘤。
65.根据条款64所述的方法，其中所述肺癌肿瘤是非小细胞肺癌(nsclc)肿瘤。
66.根据条款62或63所述的方法，其中所述实体肿瘤是乳癌肿瘤。
67.根据条款63至66中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含鳞状细胞癌细胞。
68.根据条款63至66中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含腺癌细胞。
69.根据条款63至66中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含腺鳞癌细胞。
70.根据条款44至69中任一项所述的方法，其中所述细胞悬浮液样品从活检制备。
71.根据条款70所述的方法，其中所述活检是固体组织活检。
72.根据条款71所述的方法，其中所述方法还包括从所述固体组织活检制备所述细胞悬浮液样品。
73.根据条款72所述的方法，其中从所述固体组织活检制备所述细胞悬浮液样品包括均化所述固体组织活检的组织。
74.根据条款70所述的方法，其中所述活检是液体活检。
75.根据条款74所述的方法，其中所述方法还包括从所述液体活检制备所述细胞悬浮液样品。
76.根据条款70所述的方法，其中所述活检是细针抽吸(fna)活检。
77.根据条款76所述的方法，其中所述方法还包括从所述fna活检制备所述细胞悬浮液样品。
78.根据条款44至77中任一项所述的方法，其中所述标记的细胞悬浮液样品的所述细胞是固定的。
79.根据条款44至78中任一项所述的方法，其中所述方法还包括固定所述细胞悬浮液样品的所述细胞。
80.根据条款79所述的方法，其中固定所述细胞悬浮液的所述细胞在所述接触之前进行。
81.根据条款79所述的方法，其中固定所述细胞悬浮液的所述细胞在所述接触期间进行。
82.根据条款79所述的方法，其中固定所述细胞悬浮液的所述细胞在所述接触之后进行。
83.根据条款79至82中任一项所述的方法，其中固定所述细胞包括使所述细胞悬浮液样品的所述细胞与温和交联剂接触。
84.根据条款83所述的方法，其中所述温和交联剂包括基于甲醛的固定剂。
85.根据条款44至84中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是每个细胞100个或多于100个pd-l1分子。
86.根据条款85所述的方法，其中所述预定阈值是每个细胞500个或多于500个pd-l1分子。
87.根据条款86所述的方法，其中所述预定阈值是1000个或多于1000个pd-l1分子。
88.根据条款44至87中任一项所述的方法，其中所述以细胞计数方式测定还包括定量所述细胞群体的规模。
89.根据条款88所述的方法，其中如果所述细胞群体的规模超过所述细胞悬浮液样品中的赘生性细胞的1％，那么所述赘瘤被鉴别为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的。
90.根据条款44至89中任一项所述的方法，其中所述赘瘤先前已经通过免疫组织化学鉴别为pd-l1阳性的。
91.一种治疗对象的赘瘤的方法，所述方法包括：
将抗pd-1/pd-l1免疫疗法施用于包含抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性赘瘤的对象，其中所述赘瘤根据如条款44至90中任一项所述的方法被鉴别为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的。
92.根据条款91所述的方法，其中所述对象先前已经用化学疗法治疗。
93.根据条款91或92所述的方法，其中所述对象先前已经用放射疗法治疗。
94.根据条款91至93中任一项所述的方法，其中所述对象先前已经用免疫疗法治疗。
95.根据条款91至94中任一项所述的方法，其中所述对象患有免疫相关病症或发展免疫相关病症的风险增加。
96.根据条款91至95中任一项所述的方法，其中所述抗pd-1/pd-l1免疫疗法包括向所述对象施用一种或多于一种选自由以下组成的组的抗pd-1/pd-l1治疗性拮抗剂：
97.根据条款91至96中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述疗法期间监控所述赘瘤的抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性，并且只有当所述赘瘤被鉴别为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性时才继续所述疗法。
98.根据条款97所述的方法，其中所述监控包括：
使来自所述赘瘤的细胞悬浮液样品与对pd-l1具有特异性的标记的结合成员接触以产生标记的细胞悬浮液；
以细胞计数方式测定所述标记的细胞悬浮液来检测是否存在各自表达超过预定阈值的pd-l1水平的细胞群体，以鉴别所述肿瘤是否为抗pd-1/pd-l1免疫疗法反应性的。
99.一种试剂盒，其包括：
对pd-l1具有特异性的标记的结合成员；以及
包含固定试剂的细胞悬浮液固定溶液。
100.根据条款99所述的试剂盒，其中所述固定试剂是温和交联剂。
101.根据条款100所述的试剂盒，其中所述温和交联剂包括基于甲醛的固定剂。
102.根据条款99至101中任一项所述的试剂盒，其还包括透化试剂。
103.根据条款102所述的试剂盒，其中所述细胞悬浮液固定溶液包含所述透化试剂。
104.根据条款99至103中任一项所述的试剂盒，其还包括均化装置。
105.根据条款99至104中任一项所述的试剂盒，其还包括dna标记试剂。
106.根据条款99至105中任一项所述的试剂盒，其还包括对表达的细胞周期标志物具有特异性的标记的结合成员。
107.根据条款99至106中任一项所述的试剂盒，其还包括至少一个对免疫细胞具有特异性的标记的结合成员。
108.根据条款107所述的试剂盒，其中所述至少一个对免疫细胞具有特异性的标记的结合成员包括对淋巴细胞标志物cd45具有特异性的标记的结合成员。
109.根据条款107或108所述的试剂盒，其中所述至少一个对免疫细胞具有特异性的标记的结合成员包括对淋巴细胞标志物cd8具有特异性的标记的结合成员。
110.根据条款99至109中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含活检收集装置。
111.一种检测肿瘤样品中是否存在异质性指标高于预定阈值的赘生性细胞的方法，所述方法包括:
将赘瘤样品与对程序性死亡配体(pd-l1)具有特异性的标记的结合成员接触，以产生标记的细胞悬浮液；
对所述标记的细胞悬浮液进行细胞分析以获得每个细胞的异质性指标，包括定量每个细胞的pd-l1表达，以检测赘瘤样品中是否存在异质性指标高于预定阈值的赘生性细胞。
112.根据条款111所述的方法，其中所述异质性指标包括以细胞计数方式测量的细胞复杂性。
113.根据条款111或112所述的方法，其中所述异质性指标包括测定的dna含量。
114.根据条款111至113中任一项所述的方法，其中所检测的细胞是增殖性的。
115.根据条款111至114中任一项所述的方法，其中标记还包括使所述赘瘤样品与至少一种对免疫细胞具有特异性的标记的结合成员接触。
116.根据条款111至115中任一项所述的方法，其中所检测的细胞是循环肿瘤细胞、造血癌细胞或实体肿瘤细胞。
117.根据条款111至116中任一项所述的方法，其中所述预定阈值包括细胞复杂性阈值、dna含量阈值和每个细胞的100个或多于100个pd-l1分子的pd-l1阈值。
118.一种间接检测患有赘瘤的对象中是否存在循环肿瘤细胞(ctc)的方法，所述方法包括:
将由赘瘤制备的细胞悬浮液样品与dna标记试剂或细胞周期标志物接触以产生标记的细胞悬浮液；
对标记的细胞悬浮液进行细胞分析，以量化赘瘤细胞群中的增殖是否高于预定阈值，从而间接检测对象中是否存在ctc。
119.根据条款118所述的方法，其中所述方法还括评估群体细胞的非整倍性。
120.根据条款118或119所述的方法，还包括将细胞悬浮液样品与对pd-l1具有特异性的标记的结合成员接触，并对标记的细胞悬浮液进行细胞分析，以量化群体细胞是否表达超过预定阈值的pd-l1水平。
121.根据条款118至120中任一项所述的方法，其中所述赘瘤是肺癌。
122.根据条款118至121中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过进行直接检测ctc的分析来确认ctc是否存在。
123.一种治疗对象赘瘤的方法，所述方法包括:
根据条款118至122中任一项所述的方法，间接检测对象体内是否存在ctc；和
当间接检测到存在ctc时，对对象进行全身治疗，当不存在ctc时，对对象进行赘瘤的局部治疗。
124.根据条款123所述的方法，其中所述全身治疗包括放射疗法、化学疗法、免疫疗法或其组合。
125.一种试剂盒，其包括:
dna标记试剂、细胞周期标志物、对pd-l1具有特异性的标记的结合成员或其组合；
包含固定试剂的细胞悬浮液固定溶液；和
执行根据条款1至14中任一项的方法的说明书。
实验
提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开内容和描述，而不意图限制发明人看待其发明的范围，也不意图表示以下实验是所进行的全部或仅有的实验。虽然已经努力确保所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。
分子生物化学和细胞生物化学中的一般方法可以见于如下标准教科书中：molecularcloning:alaboratorymanual,第3版(sambrook等,harborlaboratorypress2001)；shortprotocolsinmolecularbiology,第4版(ausubel等编,johnwiley&sons1999)；proteinmethods(bollag等,johnwiley&sons1996)；nonviralvectorsforgenetherapy(wagner等编,academicpress1999)；viralvectors(kaplift和loewy编,academicpress1995)；immunologymethodsmanual(i.lefkovits编,academicpress1997)；以及cellandtissueculture:laboratoryproceduresinbiotechnology(doyle和griffiths,johnwiley&sons1998)，其公开内容以引用的方式并入本文中。本公开中所提到的用于遗传操控的试剂、克隆载体和试剂盒可获自商业销售商，例如，biorad、stratagene、invitrogen、sigma-aldrich和clontech。
实施例1
根据brifford等(actacytol.1982年3月-4月；26(2):195-200)所描述的细针非抽吸细胞学(fnnac)方法(又称为“细胞穿刺”方法)，从通过细针抽吸(fna)收集的新鲜收集的肺组织或样品制备细胞悬浮液。从具有健康肺的对象以及患有非小细胞肺癌(nsclc)的患者收集样品。
使用incelldx,inc.incellprep样品制备方案(incelldx,inc.menlopark,ca)制备新鲜收集的样品。简而言之，incell制备方案被设计成从新鲜人类来源的组织样品制备单细胞悬浮液。均化器轻轻地破坏组织并且incell制备试剂固定并透化悬浮液中的个别细胞。incell制备方案是非酶促的。将获得的组织的少量样品放置于所提供的具有集成帽的2ml微量离心管中。将杜氏磷酸盐缓冲盐水(dulbecco'sphosphate-bufferedsaline)ph7.4(d-pbs)(约800μl)和均化器添加至管中。将均化器连接至电源并且设置为低速旋转叶片(电压调整至约1v)。发生轻微的组织破坏，在不剪切细胞膜的情况下逐出完整的细胞。组织破坏完成之后，弃去均化器。将产生的细胞悬浮液离心(约600g，5分钟)，以便于通过抽吸去除d-pbs。使离心的细胞再悬浮于incell制备试剂(约2ml)中用于在环境温度下固定和透化至少1小时。
将fnnac或incell制备法制备的细胞悬浮液离心(600g，5分钟)，抽吸，并且添加pbs/2％牛血清白蛋白(bsa)溶液。通过离心和抽吸去除pbs/2％bsa溶液。在环境温度下用抗体组标记细胞悬浮液30分钟，所述抗体组含有用于检测免疫细胞(cd3/cd8/cd45)的抗体和抗pd-l1抗体(克隆体28-8或e1l3n；荧光偶联)。通过离心和抽吸去除标记混合物，并且在轻轻涡旋下用1mlpbs/2％bsa溶液洗涤细胞。去除洗涤溶液之后，添加200μl工作浓度的dapi标记溶液，并且将标记的细胞悬浮液在黑暗中在环境温度下孵育30分钟。
使用具有488nm和405nm激光配置的beckmancoultercytoflex平台进行细胞计数分析。分析对照样品(supm2，pd-l1阳性对照细胞；pc3pd-l1阴性对照细胞)的pd-l1表达。图1(左图-阳性对照；右图-阴性对照)中提供的对照样品细胞计数分析的结果显示表达pd-l1的细胞与不表达pd-l1的细胞之间的清楚分离。
评价pd-l1阳性细胞百分比的流式细胞计数定量的线性。简而言之，使用掺有已知量的阳性对照细胞的阴性细胞样品进行细胞混合实验，并且使用各种抗pd-l1抗体针对阳性细胞的流式细胞计数检测来测定样品。来自线性测试的数据提供于图2中，显示所计算的pd-l1阳性百分比(y轴)横跨具有各种百分比的pd-l1阳性对照细胞的混合细胞样品(x轴)的强线性。
还测定了每个细胞的pd-l1表达的流式细胞计数定量的线性。所计算的每个细胞的pd-l1受体表达是基于使用具有已知的荧光与蛋白质(ftp)比率的抗pd-l1抗体克隆体的细胞染色的平均荧光强度。对应的标准等效可溶性荧光色素分子(mesf)珠粒与每种样品一起运作以便于定量。使用具有已知的荧光色素拷贝的mesf珠粒允许基于珠粒或细胞的总荧光对比已知标准中的荧光拷贝数来导出定量标准曲线。通过在每次运作下运作mesf珠粒标准并且基于结合至抗体的荧光分子的已知数量(ftp)计算每个细胞/细胞类型的受体拷贝，在每个细胞的基础上确定受体拷贝数。基于mesf的标准化定量的一个实例呈现于图3中。
使用含有用alexafluor647以1:1ftp标记的28-8抗pd-l1克隆体的半自动96孔面板，使用源自患者的nsclc样品验证pd-l1流式细胞计数定量测定。测定包括定量超过背景表达pd-l1的细胞的百分比以及在每个细胞的基础上pd-l1受体的数量。对来自健康(“正常肺”)和nsclc(“肿瘤”)患者样品的肿瘤细胞与免疫细胞子组都进行这种定量。如图4中所示，pd-l1肿瘤细胞的检测限于肿瘤样品，验证了使用这种方法以细胞计数方式检测pd-l1阳性细胞。
测试已经显示pd-l1表达可以在二倍体细胞以及非整倍体细胞中类似地定量。使用这种方法可以评估各种定量测量值，包括例如表达pd-l1的肿瘤细胞的百分比、每个肿瘤细胞表达的pd-l1受体的平均数、表达pd-l1的免疫细胞的百分比、每个免疫细胞表达的pd-l1受体的平均数、表达pd-l1的非整倍体肿瘤细胞群体的百分比、表达pd-l1的二倍体肿瘤细胞群体的百分比、肿瘤浸润淋巴细胞(til)的百分比等。
实施例2
制备其他临床肺样品并且以流式细胞计数方式分析以获得肿瘤和免疫细胞的pd-l1和细胞周期染料数据。所获得的数据的实例示于图5所提供的表2中。为作比较，表2中还提供了通过免疫组织化学(ihc)评估的pd-l1+肿瘤的百分比数据。
为了确定非主观使用流式细胞计数法进行的单细胞pd-l1定量与高度主观的常规免疫组织化学之间的相关性，对匹配/分离的样品进行分析，其中一个组织样品用于福尔马林固定石蜡包埋的载玻片，另一个连续样品通过如前所述的ivd无酶单细胞制备装置进行处理(chargin等人，(2016)cancerimmunolimmunother.65:1317-23；其公开内容通过引用整体并入本文)。进行多参数流式细胞计数法，并使用pb450-面积与pb450-高度点图分析对单核细胞进行门控。单个有核细胞被电子分离成免疫(cd45+、cd3+、cd4+、cd8+)群体和cd45-、二倍体和非整倍体肿瘤细胞群体。定量在肿瘤细胞和非整倍体肿瘤细胞群体中的pd-l1。将肿瘤细胞群体的pd-l1定量结果与ihc定量结果进行比较。oncotectio肺试验与dakopd-l1ihc28-8pharmdx试剂盒的比较显示总体一致率为95％(诊断临界值：≥5％；阴性百分比一致率：97％；阳性百分比一致率：89％；总体一致率：95％)，并且通过oncotectio肺试验检测到ihc漏诊的一项阳性结果。
进一步分析从22个临床肺样品获得的数据以及用作基线的对照数据。因为本文所描述的方法定量肿瘤浸润淋巴细胞(til)和细胞周期染料数据，所以可以评估til的增殖状态。图6示出了从正常组织样品、肿瘤组织样品(来自两个独立测定)和对照细胞样品测定的g1后期til和辅助t细胞的量。这个数据显示与正常组织中存在的til相比，肿瘤组织中存在的til的增殖增加。另外，当对照pbmc用作pbmc的标志物时，观察到肿瘤组织具有cd8+til的流入(35.9％对比22.3％)。总之，这个数据表明肿瘤组织空间内til的增加并且与正常组织相比那些til具有增加的增殖。
在所获得的数据中还比较了与非t细胞相比巨噬细胞的相对存在。如图7中所示，与正常肺组织样品相比，在肺肿瘤组织样品中观察到数量减少的巨噬细胞(两个独立测定)。因此，与正常组织相比，本文所描述的分析方法还表明肿瘤组织损失抗原呈递细胞。因此，总而言之，本实施例中呈现的数据显示所描述的方法可以检测到肿瘤组织中巨噬细胞的损失、非t细胞的增加以及cd8+til与cd3+子组的增殖增加。另外，如图8中所示，与肺组织样品中二倍体ctl的量相比，所描述的方法还可以检测到在细胞毒性t淋巴细胞(ctl)当中非整倍性的增加(针对正常组织中的ctl标准化)。
这些数据进一步表明本文所描述的方法检测和定量肿瘤组织样品的临床有用特征的能力，包括肿瘤组织中存在的免疫细胞的特征，例如，肿瘤组织内某些免疫细胞群体的规模、群体内非整倍性的量等。这个测定不仅可以定量肿瘤组织中的这些细胞群体和其比率，而且细胞周期染料分析的使用进一步允许人们确定检测的细胞的功能状态，包括例如免疫浸润物的增殖。
实施例3
如上文所概述，本文所描述的方法可以进一步用于直接或间接分析组织样品的循环肿瘤细胞(ctc)。举例来说，使用细胞周期染料以及ctc检测以流式细胞计数方式分析肺组织样品的免疫细胞标志物、pd-l1和细胞周期参数。表3如下提供了来自这种评估的数据。
表3
如上述数据可见，原发性肺肿瘤中非整倍性的检测指示ctc的存在。因此，本实施例中呈现的结果进一步支持使用根据本文所描述的方法从肿瘤组织样品获得的非整倍性数据，用于预测ctc是否可能存在。
实施例4
通过将定量的pd-l1表达与dna含量的关系进行比较，进一步评估pd-l1表达相对于dna含量的差异之间的关系(图9)。如图9所示，通过荧光强度测量的dna含量通常表现为1个染色体当量(1c)，其中细胞分裂前的少量细胞群体表现出的是二倍体细胞(1c)荧光强度的两倍(2c)。非整倍体肿瘤细胞的dna含量不属于1c或2c荧光当量。发现pd-l1在细胞周期不同阶段的细胞中表达不同，这取决于患者。特别地，相对于二倍体群体，非整倍体群体中pd-l1的表达增加(图9)。
肿瘤异质性也进一步得到解决。特别是，肿瘤异质性对影响治疗的因素，如pd-l1表达的影响，肿瘤异质性是基于三个参数确定的：pd-l1表达、侧向光散射(复杂性)、和dna含量。基于这三个参数，证明在患者样品中存在多个不同的肿瘤克隆。当我们将pd-l1表达绘制为确定的异质性指标的函数时，发现pd-l1表达的增加与肿瘤异质性的增加相关(图10)。
在肿瘤细胞内和肿瘤微环境中的nsclc异质性导致了定制有效患者治疗策略的挑战。大多数常规的基于分子的精确医学诊断从这些异质肿瘤中提取核酸，并且失去了表达标志物的背景。通过使用基于细胞的多参数分析平台来表征肿瘤和肿瘤微环境，本文所述的诊断方法可以解决肿瘤异质性和微环境的问题。作为一种临床试验，这种分析可以通过在细胞周期不同阶段的肿瘤细胞和非肿瘤细胞中定量til、确定肿瘤细胞非整倍性和定量pd-l1来提供可操作的信息。
抗肿瘤免疫反应由cd8+细胞毒性t淋巴细胞(ctl)介导，通过pd-1和ctla-4的免疫检查点阻断的广泛成功提供了ctl具有有效抗肿瘤活性的临床证据。肿瘤浸润淋巴细胞(til)已被证明是许多实体瘤的关键预后决定因素。til的量化已经包括在本文中，允许通过肿瘤内til的测量推断对象的生存率。使用这种方法，与正常肺组织对照相比，发现nsclc中cd8+ctl增加。特别是，与二倍体肿瘤相比，非整倍体nsclc中的ctl显著增加。尽管目前的研究中没有包括t细胞衰竭的标志物，如tim-3和ctla-4，但在目前的研究中，由后期g0-g1％确定的增殖是t细胞活化和活性的一个强有力的标记。对这些ctl浸润的进一步探查显示，通过后期g0-g1％测定的这些淋巴细胞的增殖表明，与二倍体肿瘤相比，非整倍性肿瘤的增殖减少。当前研究中的另一个发现是，与正常肺组织相比，nsclc组织中的抗原呈递细胞在统计学上显著减少，这可能会降低免疫控制。
在65％的nsclc肿瘤中发现的非整倍性是nsclc中的一个预后因素。元分析得出结论，二倍体肿瘤患者在1年至5年内死亡风险显著降低。同样，在其他研究中，非整倍体型肿瘤患者的3年生存率明显低于二倍体型肿瘤患者。这些研究得出结论，非整倍体肿瘤患者的死亡率是远端转移的结果，而二倍体肿瘤患者的局部复发是死亡的主要原因。在手术切除后的前三年，发现非整倍体肿瘤患者比二倍体型患者有更高的远端转移风险。在这里，我们已经表明80％的nsclc是非整倍体，其dna指数大于1.10。此外，根据肿瘤细胞在细胞周期中所处的位置，pd-l1表达因患者而异。非整倍性肿瘤细胞中的pd-l1表达特别重要，因为非整倍性细胞倾向于表现为ctc并最终转移。
进一步评估了作为肿瘤转移替代指标的ctc的存在与肿瘤增殖之间的关系。使用独立的分析检测ctc，并将ctc计数绘制为肿瘤增殖的函数(即，原发肿瘤中的后期g0-g1)(图11)。这些数据的线性回归揭示了肿瘤增殖和ctc患病率之间的相关性。因此，在不存在独立的ctc分析的情况下，如上述测定中所述，对原发性肿瘤增殖的测定允许血液中ctc的存在，并相应地以细胞计数法预测转移。
此外，还进一步研究了ctc的存在与肿瘤非整倍性之间的关系。与上述类似，使用独立的测定法检测ctc，并且作为由dna含量定量确定的肿瘤细胞非整倍性的函数来测量ctc计数。该分析的结果在图12中提供，其显示了在二倍体和非整倍体细胞群体中测量的ctc的平均数量。如图12所示，平均而言，与具有二倍体细胞群的样品相比，具有非整倍体细胞群体的样品中存在更多的ctc。因此，在上述分析中用细胞计数法测量的倍性状态也提供了对象中ctc存在和患病率的预测指标。
总体而言，本研究中使用的肿瘤组织工作流程比常规使用的ihc方法产生了更多可操作的信息。例如，发现oncotectio和ihc之间的总体一致性为95％(见上文)。此外，oncotectio检测到ihc遗漏了一个明显的pd-l1阳性细胞群体。oncotectio试验不会漏掉任何ihc阳性的病例。此外，除pd-l1表达外，oncotectio肺试验提供关于til和非整倍性的预后信息，使该试验能够更好地告知临床医生患者肿瘤环境，从而改善治疗决策。
材料和方法
样品
新鲜组织取自19例nsclc。记录收集日期、年龄、性别、种族、诊断、原发肿瘤大小和美国癌症联合委员会(ajcc)分类。切除组织，然后储存在洛斯维·帕克纪念研究所(rpmi)1640培养基中，温度为2℃至8℃，然后用冷包装连夜运送到incelldx。
使用incellprep进行组织分离
将至少100mg的肿瘤活检组织置于rpmi中进行运输，之后从整个组织的每个组织中取4mm穿孔，并将其放入含有800μldulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs)的eppendorf管中。利用整个组织来产生最具代表性的单细胞池，以说明整个组织中肿瘤的异质性。将incelprep(inceldx，inc)组织匀浆器插入每个试管中，并设置运行，直到上清液出现混浊(<7.5分钟)。通过在600×g离心沉淀细胞，并通过台盼蓝染色在每一百万个活细胞的1mlincellmax中固定和透化。
oncotectio试验
将250000个活细胞的等分试样用oncotectio肺试验进行测试，该试验包含针对pd-l1(28-8)、cd45、cd3和cd8的抗体以及细胞周期染料。在最大浓度下固定1小时后，将相当于250000个细胞的250μl样品等分到12×75mm试管中，随后用1mldpbs+2％牛血清白蛋白(bsa)洗涤。然后用结合了抗人抗体的pd-l1-alexafluor647(克隆28-8，abcam)、cd45-fitc、cd3-pe和cd8-pc5(b3821f4a/sfci21thy2d3/ucht1，贝克曼库尔特公司)在dpbs+2％bsa中对样品进行染色，然后在室温下在黑暗中孵育30分钟。接下来，向每个试管中加入1mldpbs+2％bsa，并在室温下孵育5分钟，然后以600×g离心5分钟。吸取上清液，用dpbs+2％bsa重复洗涤一次。洗涤后，向每个样品中加入100μl的1μg/ml的细胞周期染料，并在室温下黑暗中培养30分钟。
流式细胞计数法
首先在cytoflex细胞计数器(贝克曼库尔特公司)上分析细胞，使用pb450-面积与pb450-高度密度图，通过细胞周期染料染色在有核单细胞上设置一个门。然后将该门应用于cd45-fitc侧向光散射图，以将cd45+免疫细胞与cd45-细胞(上皮/肿瘤细胞)分离。通过cd3-pe散点图，通过cd8-pc5将免疫细胞进一步分离成cd3+和cd3+/cd8+群体。在cd8+/cd3+细胞(细胞毒性t细胞)周围建立门。此外，pb450-lin计数图用于筛选cd45-二倍体群体。确定了这些群体后，通过前向光散射分析每个群体的pd-l1表达。基于低/正常pd-l1表达建立了假定门，并通过该19个样品数据集进行了验证。记录cd45-群体的pd-l1表达高于正常临界值。类似地，非整倍体细胞的存在是通过计算cd45和淋巴细胞群体的二倍体门的细胞周期信号的比率来确定的。比值>1.05(dna指标)表示为非整倍性。当测定的比值大于1.05时，记录非整倍体cd45-细胞上的pd-l1表达。肿瘤细胞克隆是使用cd45阴性门内的ssc群体、dna指标和+/-pd-l1表达来计算的。这些参数的结果就是异质性指标。
免疫组织化学
通过从组织活检中获得匹配/分离的ffpe切片来测试与ihc的一致性。ffpe块以5μm厚度切片。载玻片在一系列二甲苯和逐渐稀释成水的酒精中进行脱蜡。用di水冲洗后，载玻片用基于柠檬酸盐的抗原回收溶液处理，该溶液预热至65℃。载玻片在预热的柠檬酸盐缓冲液中孵育，在99℃下加热20分钟，冷却20分钟，然后在dako自动染色仪上进行免疫组织化学(ihc)染色。用kpl溶液淬灭内源过氧化物酶，随后在室温下通过蛋白质封闭和兔抗-pd-l1抗体(28-8克隆)孵育1小时。将相关的非特异性同种型对照用作阴性对照。漂洗初级抗体后，将载玻片与生物素结合的二级抗体和辣根过氧化物酶结合的链霉抗生物素蛋白一起孵育，然后与二氨基联苯胺(dab)一起孵育以显现信号。ihc染色完成后，载玻片在一系列酒精和二甲苯中脱水，然后盖片以进行显微评估。
实施例5
比较流式细胞计数法获得的数据和细胞计数法获得的数据的可比性。基本上如上所述制备样品，并使用流式细胞计数器和细胞式细胞计数器并行分析。分析表明，本文所述方法中使用的各种流式细胞计数法参数可以通过细胞式细胞计数法获得，例如，使用ctc细胞式细胞计数器/分类器。例如，流式细胞计数法获得的dna含量数据和异质性指标数据与细胞式细胞计数法获得的dna含量数据和异质性指标数据相当。在图13中提供了该数据的可比性的实例，其描绘了使用流式细胞计数器(左)和ctc细胞式细胞计数器(右)获得的pd-l1表达与dna含量的关系。在用细胞式细胞计数器分析代替流式细胞分析以获得本发明方法中使用的参数的情况下，在某些情况下，相应的细胞式细胞计数测量可以代替流式细胞计数测量。例如，当流式细胞计数侧向光散射被用作异质性指标的一部分时，可以使用可通过细胞式细胞计数器测量的细胞复杂性的相应的细胞式细胞计数测量来代替。至少部分地，该实施例表明，在所述方法中有用的通过流式细胞计数法获得的某些数据，例如dna含量数据和异质性指标数据，也可以通过细胞式细胞计数法从自动化成像细胞计数器获得。
前述内容仅仅说明本发明的原理。应理解，本领域技术人员将能够设计各种布置，这些布置尽管在本文中没有明确地描述或示出，但是体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文所叙述的所有实例和条件语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和由发明人提供的促进技术的构想，并且应解释为不限于这类特别叙述的实例和条件。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定实例的所有陈述意图涵盖其结构等效物与功能等效物。另外，这类等效物意图包括当前已知的等效物与将来开发的等效物，即，所开发的执行相同功能的任何元件，而不管结构如何。因此，本发明的范围不意图限于本文所示和描述的示例性实施方案。更确切地，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。
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