使用生物工程化的心脏组织模拟具有心脏功能障碍的神经病症和共济失调的制作方法
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本申请要求2018年3月28日提交的临时美国专利申请第62/649,468号的优先权权益，该临时申请以引入的方式并入本文中。
本公开大体上涉及医学健康和心脏生理学领域，并且更具体地，涉及关于来自患病患者的细胞中的心脏作用的体外模型和筛选领域。
背景技术：
弗里德希氏共济失调(friedreich’sataxia，frda)是一种遗传性神经退行性疾病，由9号染色体上的frataxin(fxn)基因的第一个内含子突变引起，由此在健康个体中正常重复至多40次的三核苷酸鸟嘌呤-腺嘌呤-腺嘌呤(gaa)序列会再出现数百次至一千多次。即使在frda患者中产生了功能齐全的野生型fxn蛋白，内含子突变也导致fxn表达量显著减少，与非携带者相比，仅残留5％至30％的残留蛋白。fxn是一种参与铁硫簇生物合成的线粒体蛋白，对atp的生产至关重要。
由于依赖线粒体消耗大量能量，因此心脏是患者的主要病理部位。frda诱发的心脏症状首先被检测为异常心电图(ekg)，并可能发展为代偿性肥厚性心肌病、扩张型心肌病，然后发展为心肌细胞(cm)死亡和纤维化，从而导致心力衰竭和心律失常。实际上，frda患者的主要死亡原因已归结于心脏问题。但是，尚未建立frda诱发的心脏症状的严重程度与fxn表达之间的相关性。
考虑到跨物种的fxn基因之间的氨基酸高度同一性，已经建立了鼠模型来研究frda病理。一种鼠模型是通过条件性切除fxn基因，使得在靶器官中完全敲除fxn来实现11。尽管此特定模型呈现预期的frda表型，例如心肌病和线粒体缺陷，但其基因型不能反映frda患者的基因型。通过具有扩增的gaa重复序列的人fxn基因的转基因表达与鼠fxn基因的敲除相结合，已经产生了另一种模拟人基因型的小鼠模型；然而，患病表型的严重性与在frda患者中观察到的严重性不匹配14,15。因此，使用人cm的体外模型似乎是研究frda心脏发病机制的更合适且相关的模型。然而，患者活检的可用性有限，并且不足以概括该疾病的功能性表型，例如收缩功能障碍。
随着重编程的进展，人诱导性多能干细胞(hipsc)可以源自frda患者，并分化为cm，以在人体外模型中研究疾病进展。然而，迄今为止，还没有在多细胞心脏模拟模型中检查或建议检查此类cm的收缩或电生理特性的报告或公开内容。
已经花费了许多努力来增进我们对人心血管系统和人心脏保健的理解，但是在本领域中仍然需要能够快速和准确地揭示患有传统上被理解为本质上是非心脏疾病的患者的细胞中的心脏作用的生物学模型。
技术实现要素：
为了改善并延长罹患具有有害心脏合并症的神经疾病或病症的患者的寿命，针对心脏症状(通常是导致死亡的主要原因)的治疗剂将是最有价值的。为了测试可能靶向并治疗这种心脏作用的候选治疗剂，需要创建一个可以充分概括疾病表型的有效体外平台，即合适的疾病模型。在过去的几十年中，动物模型已被大量使用，但是由于人的心脏与非人的心脏存在显著差异，因此动物模型无法很好地预测患者的预后。不幸的是，患者心脏活检的供应非常有限，并且这种分离的组织在体外无法长期存活。多能干细胞技术的最新发展已使人心脏细胞(心肌细胞)得以大量生产，这为疾病建模提供了一个有吸引力的平台。然而，培养的心肌细胞在疾病建模中的能力有限，因为单细胞特性难以推断到组织水平的表型，并且传统的单层培养不能概括心脏组织的各向异性三维结构和功能。工程化的人体心脏组织可以解决此问题，因为可以对其进行功能评估，并且可以对其设计进行定制以允许读数，而读数可能更容易与临床症状相关。因此，一套经过整合的工程化心脏组织测定套件可以提供优于任何一个系统的优势，该系统全面评估具有神经病理学基础的心脏疾病的治疗剂。为了说明本公开在评估候选治疗剂和确定与神经系统疾病相关的心脏作用的治疗中的益处，下面的描述集中于如何解决与弗里德希氏共济失调相关的心脏缺陷。该描述是本公开的益处的示例性描述，本领域技术人员可以容易地将其应用于模拟具有心脏作用的其他神经疾病。
本文公开的研究首次显示了降低的fxn水平对心脏电生理和收缩特性的影响，其中使用了多种工程化的组织构建体，这些构建体由源自人胚胎干细胞(hesc)或hipsc(统称为人多能干细胞或hpsc)的fxn缺陷型人心室cm(hvcm)构成，其中fxn水平通过短发夹rna(shrna)介导的fxn敲低而降低(在hesc和健康的hipsc中)，或者由于供体患者体内fxn基因突变而自然降低(在frdahipsc中)。本文公开的研究利用的组织平台提供用于模拟心脏电生理和心律失常的人心室心脏各向异性片(hvcas)19-22、用于模拟心力产生和收缩性缺陷的人心室心脏组织条(hvcts)23-24和/或设计用于通过电耦合和机械耦合的cm模拟更具生理条件的人心室心脏类器官腔(hvcoc)。这些组织平台是用于研究frda发病机理的上乘模型，可实现诸如传导速度、力产生的大小和心输出量的读数，而这些读数在单细胞或许多其他工程化组织模型中是不可能的。
总体上，本公开提供了一种系统和相关方法，以利于使用模拟具有至少一种有害心脏作用的神经疾病的工程化的hvcas、hvcts和hvcoc进行药物发现/筛选。这些工程化的构建体可以使用(a)健康的hpsc衍生的cm(或hpsc-cm)，其例如通过慢病毒shrna介导的一种或多种特定基因的敲低进行工程化来重现患者cm中致病突变的作用，或(b)来源于携带一种或多种致病突变的患者的本质上患病的hipsc衍生的cm(或hipsc-cm)进行组装。针对临床观察到的患者症状(例如心电图模式的改变、收缩功能障碍)验证了模型的生物保真度，并将其与相关的健康对照(例如用非靶向shrna慢病毒对照转导的健康hpsc-cm，或源自健康受试者的hipsc-cm)进行了比较以确保模型的特异性。经过验证的模型可用于关于对心脏组织有益或有毒的作用筛选治疗。这些工程化的构建体可用于在毒性和功效方面评估候选治疗对心脏的电生理和收缩作用，目的是确定可改善、挽救或消除疾病症状而不会引起有害副作用的治疗。例如，对于显示电生理和收缩症状的frda，可以同时使用电生理(hvcas)和收缩(hvcts/hvcoc)模型进行功效和安全性筛选。可以诱导两种症状改善的单一或组合治疗均有望成为有前景的候选治疗剂。
hvcas疾病模型是一种生物杂交材料，其呈(1)人心室心肌细胞(hvcm)和(2)为hvcm的生长和有序发育提供附着点的微加工衬底的形式，作为通过设计已在策略上保持一致的基本组成部分。在使用中，hvcm形成覆在微加工衬底上的单层细胞(称为人心室心脏各向异性片或hvcas)，该衬底提供了有利于体内人心脏细胞所特有的各向异性特性发展的环境。疾病建模hvcm可以是(a)健康的hpsc衍生的cm(或hpsc-cm)，其例如通过慢病毒shrna介导的一种或多种特定基因的敲低进行工程化来重现患者cm中致病突变的作用，或(b)来源于携带一种或多种致病突变的患者的本质上患病的hipsc衍生的cm(或hipsc-cm)。在一些实施例中，微加工衬底包含沿着衬底的单轴定向的凹槽。在一些实施例中，凹槽具有相似的尺寸。在一些实施例中，凹槽的宽度为1-30μm，包括其中凹槽的宽度为5-15μm，例如其中凹槽的宽度为15μm的实施例。在一些实施例中，凹槽的深度为约5μm。在一些实施例中，凹槽之间的间隔为约5μm。
本公开的一个方面提供了一种对疾病的电生理表型进行建模的方法，该方法包含：(a)用由健康hpsc工程化或源自患者hipsc的疾病建模cm制造hvcas；(b)在一个或多个点处刺激细胞的各向异性层；(c)检测电信号在细胞各向异性层中的传播；以及(d)评估hvcas的电生理特性。在各种实施例中，评估的hvcas的电生理特性是动作电位持续时间、横向传导速度、纵向传导速度、各向异性比、自动性(自发动作电位的存在)、最大捕获频率、最大上升速度、最大衰减速度、上升时间、传导模式、螺旋电传播波形式的心律失常事件的发生和/或可以使用心肌细胞的各向异性片进行监测的心肌细胞的任何其他生理参数。在一些实施例中，细胞的各向异性层包含来源于人的心室心肌细胞。存在本公开的该方面的实施例，其中该微加工衬底是聚苯乙烯。在一些实施例中，在一个点处刺激细胞的心脏各向异性层，例如其中刺激为5-30伏，脉冲持续时间为5-30毫秒。在一个示例性实施例中，刺激为10伏，脉冲持续时间为10毫秒。在本公开的该方面的一些实施例中，电刺激在hvcas疾病模型中诱发螺旋电传播波，从而模仿在疾病的临床症状中的心律失常。在一些实施例中，hvcas疾病模型表现出改变的电生理参数，例如动作电位持续时间和传导速度。
更具体地，本公开的一个方面涉及一种关于对患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞的电生理作用筛选化合物的系统，该系统包含：(1)人心室心肌细胞(hvcm)，和(2)为hvcm的生长和有序发育提供附着点的微加工衬底，作为通过设计已在策略上保持一致的基本组成部分。在使用中，hvcm形成覆在微加工衬底上的单层细胞(称为人心室心脏各向异性片或hvcas)，该衬底提供了有利于体内人心脏细胞所特有的各向异性特性发展的环境。该方法适于筛选候选化合物以鉴定对患病生物体的心肌细胞具有电生理作用的化合物，并适于筛选已知可用于治疗的治疗剂以鉴定对心肌细胞具有电生理作用的那些治疗剂。疾病建模hvcm可以是(a)健康的hpsc衍生的cm(或hpsc-cm)，其例如通过慢病毒shrna介导的一种或多种特定基因的敲低进行工程化来重现患者cm中致病突变的作用，或(b)来源于携带一种或多种致病突变的患者的本质上患病的hipsc衍生的cm(或hipsc-cm)。在一些实施例中，凹槽具有相似的尺寸。在一些实施例中，凹槽的宽度为1-30μm，包括其中凹槽的宽度为5-15μm，例如其中凹槽的宽度为15μm的实施例。在一些实施例中，凹槽的深度为约5μm。在一些实施例中，凹槽之间的间隔为约5μm。本公开的一个方面提供了一种筛选治疗的电生理作用的方法，其包含：(a)使hvcas疾病模型与治疗接触；(b)在一个或多个点处刺激hvcas疾病模型；(c)在hvcas疾病模型中检测电信号传播；以及(d)确定该化合物是否显示功效(例如通过消除心律失常，如不存在或减少螺旋电传播波所示)或毒性(例如通过诱导或加剧螺旋电传播波)。存在本公开的该方面的实施例，其中该微加工衬底是聚苯乙烯。在一些实施例中，在一个点处刺激hvcas，例如其中刺激为5-30伏，脉冲持续时间为5-30毫秒。在一个示例性实施例中，刺激为10伏，脉冲持续时间为10毫秒。在本公开的该方面的一些实施例中，电刺激在hvcas疾病模型中诱发螺旋电传播波，从而模仿由治疗诱发的心律失常。在一些实施例中，治疗诱发hvcas疾病模型中的电生理参数的改变，例如动作电位持续时间和传导速度。
hvcts疾病模型或hvcas疾病模型可以在两层筛选中与hvcoc疾病模型配对，其中第一层筛选使用hvcts评估对心脏的收缩作用或使用hvcas来评估心肌细胞的一个或多个生理参数，然后在hvcoc系统的高阶生物学结构上进行第二层筛选，以确认第一层筛选的结果并揭示从第一层筛选中使用的细胞不明显的任何类器官或器官水平的作用。本公开还提供了第三筛选的可能性，该第三筛选可以被视为与第一层和第二层筛选最佳组合的第三层筛选。在第三层筛选中，使用多类器官系统筛选了多个类器官。第三层筛选产生的数据甚至比从两层筛选获得的数据更加可靠。此外，多类器官格式允许在筛选中使用相同类型的多个类器官，例如心脏类器官，和/或在第三层筛选中同时使用不同的互连类器官，使用本文公开的通用多类器官系统。(如本文所用，“类器官”通常是指器官样生物材料，但该术语也可以指工程化的组织，其可以被视为器官样生物材料。本文所用术语的含义将从其使用的上下文中显而易见。)在一些实施例中，人心室心脏组织包含hpsc源性心室心肌细胞(vcm)。我们的团队已对这类细胞的单细胞特性，例如电生理学(动作电位、ca2+处理)、转录组、蛋白质组等进行了广泛表征30-48。如本文所公开的，各种细胞，例如人心室心肌细胞，可以用于开发用于第二层hvcoc系统的类器官和用于开发用于第三层多类器官系统的类器官。
在本公开的多层系统和方法的第二层和第三层中使用的多类器官系统是一个平台，其同时表征多个体外组织工程化的组织或类器官，包括镜布置以及单个检测装置。配备了流体交换网络，类器官在此平台上相互连接，以建立一个“迷你人体”系统，该系统模拟人类患者的全身药物反应，可用于替代动物试验作为默认的体内模型。半自动化平台包括多个特征，以帮助调查对已递送药物的功能响应，例如环境控制(例如温度和co2)、高速照相机、同步的压力-体积记录、互连的流体交换系统、药物灌注、类器官内压力控制、机械刺激和电刺激。这些特征被设计成改善培养操作，允许检查组织或类器官的长期药物暴露，并允许同时进行多组织和/或多器官药物反应。当前的体外治疗剂筛选通常仅评估单个组织或类器官的急性反应，这使挑战性扩大且成本高昂。通过使用带有镜布置的单个照相机进行多类器官成像，此系统比当前可用的设计更具可扩展性。
为了开发下一代体外人体模型，生物反应器平台包括模块化的类器官盒系统和流体交换网络，可实现灵活的系统生物学方法。“即插即用型”类器官盒加快对生物反应器内感兴趣的各种组织和/或类器官组合成像的过程。另外，组织或类器官之间的培养基循环和交换可以重现人的循环系统。信号传导因子和代谢产物可以在组织或类器官之间自由交换，并且可以影响一种或多种组织或类器官的药物反应。这种“罐中身体(body-in-a-jar)”技术促进药物发现和精确度或个性化的医学研究，并且优于由于缺乏三维组织而常常无法完全重现器官功能的器官芯片技术。
使用临床相关的终点(例如心脏组织中的射血分数、肺组织中的通透性)对新的分子实体进行表征，然后使用经过训练以检测生物活性和毒性模式的自动计算机算法(例如机器学习)进行分类。本文公开的多类器官成像平台增加了通量，并且可用于更高含量的筛选。通过提高通量，该系统变得更易于临床前药物筛选。该平台还用于探测来源于患有神经疾病或病症的患者的组织工程化人类构建体中的基础生物学。
除了一层hvcts系统和方法之外，本公开提供了用于开发工程化类器官组织的通用生物反应器平台，其更紧密地模拟相应人体器官的体内结构和功能。利用高速照相机和压力传感器的组合，本公开提供了一种将移位组织或类器官(例如收缩心脏类器官)的时空运动与压力记录相结合以测量压力-体积关系的方法。另外，与使用简单的静水压力系统的一些系统相反，本公开提供了一种用于通过协同使用流体泵、三通阀和流体箱在生物反应器平台内进行流体交换的复杂系统。流体交换系统还提供了生物反应器内任意数量的类器官的连接。本公开的流体交换系统提供了控制培养基递送的附加功能，用于进料、抽吸培养基、混合生物活性组分(例如治疗剂)以及按急性时间表(例如推注)或慢性时间表(例如灌注)注射生物活性剂。生物活性组分可包括但不限于药物化合物、病毒载体、条件培养基、祖细胞和细胞外囊泡。流体交换系统还提供了对流体管线的清洁、漂洗或冲洗。另外，本公开通过将用于机械拉伸的方法应用于具有腔室的组织或类器官来提供对发育中的组织或类器官的机械刺激。通过施加机械拉伸，本公开提供了一种用于操纵组织或类器官的手段，只要机械拉伸可以充当机械转导信号即可。与经由场刺激对人心脏类器官的电起搏相反，本公开提供了对此类类器官的点刺激，从而导致对类器官组织的更精确和细化的刺激。利用点刺激，可以例如通过使用光学标测技术来完成组织或类器官(例如心脏)内的电导率测量。此外，根据本公开，机器学习原理在组织或类器官行为分析中的应用有望通过全面分析和理解高维参数空间来改善对治疗反应结果的评估。本公开以集成包装提供所有益处，这代表了治疗剂筛选领域的重大进步，包括新方法，即实验测定，预期将改进预防、治疗和/或改善与各种神经疾病、病症和病况相关的心脏症状。
更具体地，本公开的一个方面涉及一种关于对患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞的心脏作用(例如收缩作用)筛选化合物的系统，该系统包含：(a)筛选设备，其包含：(i)包含患病生物体的多个心肌细胞或多个工程化的心肌细胞的生物相容性凝胶；(ii)用于悬浮生物相容性凝胶的生物相容性支撑设备，其中该生物相容性凝胶和生物相容性支撑设备形成心脏组织条，该心脏组织条包含患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞；(iii)用于检测生物相容性凝胶的运动的检测装置；以及(iv)用于对生物相容性凝胶施加电起搏刺激的电源。该化合物可以是由于其对心肌细胞的收缩作用而已知可用于心脏治疗的治疗剂，或者该化合物可以是候选治疗剂。在一些实施例中，用于筛选化合物的系统还包含：(a)第二级筛选设备，其包含：(i)至少一个类器官模块，该模块包含至少一个类器官盒，其中该类器官盒包含培养基入口、培养基出口和至少一个与外部检测装置相容的壁，其中每个类器官盒包含患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞，并且其中至少一个类器官盒包含患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞；以及(ii)检测装置，用于观察每个类器官盒中患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞的监测的生物发育。在一些实施例中，本文公开的第二级筛选设备还包含镜布置，用于同时监测每个类器官盒中患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞的任何生物发育。
本公开的另一方面是关于对患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞的心脏作用筛选化合物的系统，该系统包含：(a)筛选装置，其包含：(i)在微加工衬底上的心肌细胞的各向异性层；(ii)电源，用于在一个或多个点处刺激细胞的各向异性层；以及(iii)检测装置，用于检测电信号在细胞的各向异性层中的传播。在一些实施例中，微加工衬底包含沿着衬底的单轴定向的凹槽。在一些实施例中，凹槽的宽度为1-30μm，凹槽的深度为约5μm，凹槽之间的间隔为约5μm，或其组合。在一些实施例中，电源是至少一个电极，例如单个电极或电极阵列，或衬底的至少一个带电部分。部分或完全带电的衬底能够建立电场，该电场可以是均匀的或可以呈现出梯度。在一些实施例中，用于针对心脏作用筛选化合物的系统包含筛选装置，该筛选装置还包含：(a)第二级筛选设备，其包含：(i)至少一个类器官模块，该模块包含至少一个类器官盒，其中该类器官盒包含培养基入口、培养基出口和至少一个与外部检测装置相容的壁，其中每个类器官盒包含患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞，并且其中至少一个类器官盒包含患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞；以及(ii)检测装置，用于观察所监测的每个类器官盒中患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞的生物发育。
在根据本公开的系统的一些实施例中，心肌细胞是人心肌细胞，例如人心室心肌细胞，例如，其中心肌细胞以至少106个细胞/毫升的浓度存在。
在该系统的一些实施例中，心肌细胞是工程化的心肌细胞或由来源于患有神经疾病的患者的hipsc产生，该神经疾病包括但不限于弗里德希氏共济失调(frda)、卡-塞氏综合征(kearns-sayresyndrome)、碳水化合物缺乏性ia型糖蛋白综合征、脊髓小脑性共济失调、威尔逊氏病(wilsondisease)、丹迪-沃克氏综合征(dandy-walkersyndrome)、扩张型心肌病伴共济失调、利氏病(leighdisease)、melas(线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作)或merrf(肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病)。在一些实施例中，心肌细胞被工程化成具有低fxn表达，或是来源于例如患有弗里德希氏共济失调(frda)的患者的hipsc。
在该系统的一些实施例中，心肌细胞是基因型正常的，并且来源于健康的hpsc，包括来自健康志愿者的已建立的hesc或hipsc，并且被工程化成重现神经疾病典型的突变疾病表型，包括但不限于弗里德希氏共济失调(frda)、卡-塞氏综合征、碳水化合物缺乏性ia型糖蛋白综合征、脊髓小脑性共济失调、威尔逊氏病、丹迪-沃克氏综合征、扩张型心肌病伴共济失调、利氏病、melas(线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作)或merrf(肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病)，例如其中将心肌细胞工程化成表达水平降低的frataxin(fxn)蛋白，如通常在frda患者中所观察到。
在一些实施例中，生物相容性凝胶包含基质胶，例如其中基质胶以至少0.5mg/ml的浓度存在的凝胶。在一些实施例中，生物相容性凝胶还包含胶原蛋白，例如其中胶原蛋白是i型人胶原蛋白。在一些实施例中，胶原蛋白以至少1mg/ml的浓度存在。
用于生物相容性凝胶的支撑装置可以是至少两个竖直支撑构件。在一些实施例中，竖直支撑构件由聚二甲基硅氧烷制成。在具体实施例中，存在两个竖直支撑构件，每个竖直支撑构件的横截面均为近似圆形，直径为约0.5mm。在一些实施例中，心脏组织条是约26.5mm长度×约16mm宽度×约6mm高度。
本文公开的系统设想了其中检测装置是高速照相机的实施例。在一些实施例中，第二级筛选设备的镜布置包含至少一个角锥镜。筛选系统的一些实施例包含第二级筛选设备，该设备还包含与至少一个类器官盒中的组织或类器官具有可调关系的电极。在一些实施例中，第二级筛选设备还包含温度控制元件、光源、模块接入端口或其任何组合。在一些实施例中，包含第二级筛选设备的系统还包含与检测装置、温度控制元件、光源、模块接入端口或其任何组合电子通信的数据处理器。在一些实施例中，检测装置是数字照相机、至少一个压力传感器或数字照相机和至少一个压力传感器的组合。
本公开进一步考虑的是一种进一步包含监测器的系统。在一些实施例中，包含第二级筛选设备的系统包含多个类器官模块。该系统的一些实施例还包含互连的流体交换网络，其中该网络包含多条流体管线、多个阀、至少一个泵和至少一个流体箱。一些实施例还包含用于引入化合物的端口。在一些实施例中，互连的流体交换网络包含至少两个类器官盒之间的流体连通。在一些实施例中，流体是培养基。一些实施例还包含气压控制器，例如其中气压控制器控制至少一个模块或一个或多个类器官盒中的o2和co2中的至少一种的浓度的实施例。一些实施例还包含用于将化合物递送至细胞、组织或类器官的药物灌注设备。一些实施例还包含培养基混合器。
本公开的另一方面是一种筛选具有心脏作用的化合物的方法，其包含：(a)在存在或不存在候选心脏化合物的情况下，以电刺激在0.5hz、1.0hz、1.5hz或2.0hz的起搏频率下对本文公开的心脏组织条起搏；(b)检测在存在或不存在候选心脏化合物的情况下，起搏的心脏组织条的任何运动；(c)将在存在候选心脏化合物的情况下起搏的心脏组织条的运动与在不存在候选心脏化合物的情况下起搏的心脏组织条的运动相比较；以及(d)当在存在化合物的情况下起搏的心脏组织条的运动与在不存在化合物的情况下起搏的心脏组织条的运动不同时，确定候选心脏化合物是心脏化合物。在该方法的一些实施例中，起搏频率是1.0hz。在一些实施例中，化合物是药物、病毒载体、条件培养基、细胞外囊泡、其他细胞或其任何组合。在一些实施例中，该方法还包含测量化合物毒性的测定。
在该方法的一些实施例中，心肌细胞是工程化的心肌细胞或由来源于患有神经疾病的患者的hipsc产生的心肌细胞，该神经疾病包括但不限于弗里德希氏共济失调(frda)、卡-塞氏综合征、碳水化合物缺乏性ia型糖蛋白综合征、脊髓小脑性共济失调、威尔逊氏病、丹迪-沃克氏综合征、扩张型心肌病伴共济失调、利氏病、melas(线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作)或merrf(肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病)。在一些实施例中，心肌细胞被工程化成具有低fxn表达，或是来源于患有弗里德希氏共济失调(frda)的患者。在一些实施例中，工程化的心肌细胞是基因型正常的，并且来源于健康的hpsc，包括来自健康志愿者的已建立的胚胎干细胞系或hipsc，并且被工程化成重现神经疾病典型的突变疾病表型，包括但不限于弗里德希氏共济失调(frda)、卡-塞氏综合征、碳水化合物缺乏性ia型糖蛋白综合征、脊髓小脑性共济失调、威尔逊氏病、丹迪-沃克氏综合征、扩张型心肌病伴共济失调、利氏病、melas(线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作)或merrf(肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病)，例如其中将心肌细胞工程化成表达水平降低的frataxin(fxn)蛋白，如通常在frda患者中所观察到。在涉及监测起搏的心脏组织条的运动的化合物筛选方法的一些实施例中，该方法还包含：(a)使微加工衬底上的心脏细胞的各向异性层与化合物接触；(b)使用电源在一个或多个点刺激细胞的各向异性层；(c)检测电信号在细胞各向异性层中的传播；以及(d)确定与在不存在化合物的情况下相比，在存在化合物的情况下心脏细胞是否表现出心脏作用。
本公开的另一方面是一种组织监测系统，其包含(a)至少一个类器官模块，该模块包含多个类器官盒，其中每个类器官盒包含培养基入口、培养基出口和至少一个与外部检测装置相容的壁，其中多个类器官盒各自包含患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞；(b)镜布置，用于同时监测至少两个类器官盒中的每一个的患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞的任何生物发育；以及(c)检测装置，用于观察所监测的至少两个类器官盒中的每一个的患病生物体的心肌细胞或工程化的心肌细胞的生物发育。在一些实施例中，心肌细胞是工程化的心肌细胞或来源于患有神经疾病的患者的心肌细胞，该神经疾病包括但不限于弗里德希氏共济失调(frda)、卡-塞氏综合征、碳水化合物缺乏性ia型糖蛋白综合征、脊髓小脑性共济失调、威尔逊氏病、丹迪-沃克氏综合征、扩张型心肌病伴共济失调、利氏病、melas(线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作)或merrf(肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病)。在一些实施例中，心肌细胞被工程化成具有低fxn表达，或是来源于患有弗里德希氏共济失调(frda)的患者。在该系统的一些实施例中，心肌细胞是工程化的心肌细胞，其为基因型正常的并且来源于健康的hpsc，包括来自健康志愿者的已建立的胚胎干细胞系或hipsc，并且被工程化成重现神经疾病典型的突变疾病表型，包括但不限于弗里德希氏共济失调(frda)、卡-塞氏综合征、碳水化合物缺乏性ia型糖蛋白综合征、脊髓小脑性共济失调、威尔逊氏病、丹迪-沃克氏综合征、扩张型心肌病伴共济失调、利氏病、melas(线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作)或merrf(肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病)，例如其中将心肌细胞工程化成表达水平降低的frataxin(fxn)蛋白，如通常在frda患者中所观察到。
在一些实施例中，镜布置包含至少一个角锥镜。一些实施例还包含与至少一个类器官盒中的细胞、组织或类器官具有可调关系的电极。在一些实施例中，检测装置是记录装置。一些实施例还包含温度控制元件、光源、模块接入端口或其任何组合。一些实施例还包含与检测装置、温度控制元件、光源、模块接入端口或其任何组合电子通信的数据处理器。在一些实施例中，记录装置是数字照相机、至少一个压力传感器或数字照相机和至少一个压力传感器的组合。一些实施例还包含具有至少一种人细胞的组织。该系统的一些实施例还包含监测器。
在一些实施例中，该系统包含多个类器官模块。一些实施例还包含互连的流体交换网络，其中该网络包含多条流体管线、多个阀、至少一个泵和至少一个流体箱。一些实施例还包含用于引入化合物的端口。在一些实施例中，流体是培养基。一些实施例还包含气压控制器，例如其中气压控制器控制至少一个模块或一个或多个类器官盒中的o2和co2中的至少一种的浓度的实施例。一些实施例还包含多个模块接入端口。一些实施例还包含用于将治疗剂递送至细胞、组织或类器官的药物灌注设备。
根据以下详细描述和附图以及根据权利要求，所公开的主题的其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1.通过fxn缺陷型hpsc的工程化心脏组织构建体对frda的体外建模。a)用于生成心脏组织模型、人心室心脏各向异性片(hvcas)和人心室心脏组织条(hvcts)的实验时间表，以分别进行电生理和收缩评估。b)标准化为gapdh表达的hesc(n＝9)、hipsc(n＝9)以及frda-hipsc系68(n＝10)和03665(n＝3)的fxn转录本和蛋白质表达。数据显示为平均值+sem。*指示统计显著性，p<0.05。
图2.源自hesc的等基因frda心脏模型。a)相对于用lv-shnt(n＝8)转导的对照，用lv-shfxn1(n＝4)和lv-shfxn2(n＝4)转导的hesc-hvcm(标准化为gapdh表达)的fxn转录本和蛋白质表达。数据显示为平均值+sem。b)在第12天，用lv-shfxn1和lv-shfxn2转导的hes2-hvcts的代表性颤搐力迹线，以lv-shnt作为对照。c)与用lv-shnt(n＝17)转导的对照相比，在第7、9和12天，由用lv-shfxn1(n＝14)和lv-shfxn2(n＝7)转导的1hz起搏hesc-hvcts的颤搐力产生，显示为四分位数间距的中位数。d)在第12天hesc-hvcts力产生的动力学分析。所有力产生数据显示为四分位数间距的中位数。*指示统计显著性，p<0.05。
图3.源自frda-hipsc的frda心脏模型。a)健康对照hipsc-hvcm(n＝5)、frda(68)-hipsc-hvcm(n＝4)和frda(03665)-hipsc-hvcm(n＝4)的fxn转录本和蛋白质表达(标准化为gapdh表达)。b)hesc-和hipsc-hvcts中产生的力与fxn表达的相关性(在第12天，以1hz起搏)。数据显示为平均值+sem。*指示统计显著性，p<0.05。
图4.源自hesc和hipsc的fxn缺陷型hvcas相对于其各自健康对照的电生理学测量结果。a)来自对照和lv-shfxn转导的hesc-hvcas，以及健康对照和frda患者来源的hipsc-hvcas的代表性动作电位和等时线图。b)对照(n＝32)对比shfxn(n＝33)hesc-hvcas和健康对照(n＝25)对比frda(n＝35)hipsc-hvcas的最大捕获频率(mcf)。c)从对照对比lv-shfxn转导的hesc-hvcas和健康对照对比frdahipsc-hvcas的光学标测得出的在50％复极化(apd50)和90％复极化(apd90)的动作电位持续时间。数据显示为四分位数间距的中位数。*表示统计显著性，p<0.05。
图5.frdahvcts模型的fxn表达挽救。a)相对于用lv-fxn转导的挽救组(n＝3)，用lv-rfp对照转导的frda(03665)-hipsc-hvcm(n＝3)的fxn蛋白表达和代表性蛋白质印迹图像。b)相对于lv-rfp对照(n＝9)，在用lv-fxn(n＝10)转导的ffrda(03665)-hipsc-hvcts中以1hz起搏产生的颤搐力。fxn表达数据显示为平均值+sem，力产生数据显示为四分位数间距的中位数。*和**分别表示p<0.05和p<0.01的统计显著性。c)相对于在1hz下用lv-shfxn和lv-rfp转导的对照，用lv-shfxn和lv-fxn双转导的hesc来源的hvcts的等距力测量(lv-shfxn+lv-fxn：n＝17；lv-shfxn+lv-rfp：n＝14)。fxn表达数据显示为平均值+sem，力产生数据显示为四分位数间距的中位数。*表示统计显著性，p<0.05。
图6.frdahvcoc疾病模型。用lv-shfxn转导的hesc-hvcm或患者来源的frdahipsc-hvcm创建的hvcocfrda模型在物理上完好无损，并且可以泵送流体并产生压力。这些模型可以与健康的hesc-hvcm在功能特性上进行交叉比较，这些功能特性包括搏出功、心搏量、射血分数、发展压和心输出量。
图7.a)生物反应器系统的示意图，该系统包含类器官模块10、计算机控制的检测/记录装置2(例如照相机)，用于通过角锥反射镜13同时对多达四个类器官盒20进行成像(并可选地保存图像)，每个类器官盒都含有类器官1(其中至少一个是心脏，而其他则可以是任何类器官，例如心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、前列腺、子宫、血液、血管、肿瘤、眼睛或皮肤)。类器官模块10可以含有多个相同类型的类器官1或多种类器官1类型。类器官盒20可与类器官腔20互换使用。b)由计算机或数据处理器5组成的成像生物反应器平台的示意图，该计算机或数据处理器控制类器官模块10的阵列。
图8.具有四个类器官盒20的类器官模块10的三维渲染图。示出了等轴测图和侧视图。还显示了类器官1、连接到镜头3的检测/记录装置2、灯12(例如led灯)、角锥镜13、类器官盒20、温度控制元件4(例如加热器)以及混合器19，例如搅拌棒。
图9.a)用于类器官盒的流体交换系统的示意图，包括流体管线、泵、阀、压力传感器和流体箱。根据功能使用阀和泵的特定配置，例如b)抽吸或c)向培养基槽中添加新鲜培养基。实例6中提供对生物反应器系统的图示实施方案的详细描述。
图10.a)流体交换系统的图形表示，该流体交换系统由在模块内的多个类器官盒之间引导培养基的流体管线、泵和阀组成。可以连接多种类器官类型来模拟“罐中身体”。b)具有足够泵送能力的心脏类器官可以用作唯一的生物泵，以形成自动力的“罐中身体”。实例6提供了生物反应器系统的这些实施方案的附加描述。
图11.a)示出了生物反应器系统的一个实施例，其显示了用于通过由阀控制的类器官1的培养基交换的入口和出口路径(左窗格：心脏类器官；右窗格：肝脏类器官)。b)机械刺激系统的示意图，其中可逆流体泵连接到类器官1以进行充气和放气。基于刺激系统传递的压力变化和类器官1的柔韧性，类器官1受到拉伸。
图12.用于操作生物反应器平台或系统的labview前面板的示意图。a)多个类器官的采集预览窗口。b)环境控制面板。c)电刺激参数。用户可以选择控制电压功率、更改频率、选择要刺激的腔室并决定发送连续刺激或单个脉冲。d)四个不同类器官的实时压力、体积数据。压力用灰线表示，而类器官体积用黑线表示。e)记录参数。
图13.matlab分析以从采集中生成平均p-v环。a)计算组织的平均体积收缩曲线。将跳动的每个体积收缩绘制为散点图，最大收缩时间设置为t＝0秒。平均曲线表示为红色实线。b)总结多个收缩的平均p-v环线图。红色圆圈表示采样时间点的值。
图14.labview软件的流程图，该软件用于监测本文公开的系统和设备中的细胞、组织和类器官。流程图示意性地例示了基于软件控制环境变量，例如温度和co2水平，以及基于软件控制系统和装置的特征，例如镜头控制、照明控制和系统或设备中包含的细胞、组织和/或类器官的电刺激控制。
具体实施方式
本公开提供了一种系统和相关方法，该系统和相关方法用于针对源自患有神经疾病、病症或病况且可具有至少一种心脏作用的患者的心肌细胞的有益或毒性心脏作用筛选化合物。系统的典型配置包括功效筛选，然后是毒性筛选，具体取决于要建模的疾病的表型。最初的功效筛选用于确定可改善、挽救或消除疾病症状的治疗，然后是毒性筛选以消除具有有害副作用的治疗。为了模拟心脏电生理和心律失常，提供了一种心脏各向异性片，例如包含覆在微加工衬底上的单层人心室心肌细胞的人心室心脏各向异性片(hvcas)，它提供了有利于发展体内人心脏细胞所特有的各向异性特性的环境。连同定义明确的纳入/排除质量控制标准和算法，cas平台(例如hvcas)可重现天然人心脏的关键电生理特征，同时使常规hpsc-cm电生理测定中对疾病和药物诱发的心律失常性进行系统评估所常见的变异性见到最少。生物杂交材料的显著优势在于可以进行更准确地反映体内生理效应的体外测定。为了评估收缩性，采用了多层系统，例如两层系统和相关方法，其中第一层被设计成提供针对有益心脏作用的准确而又快速，通用且具有成本效益的化合物初步筛选。第一层系统包含心脏组织条(cts)，例如以允许凝胶运动显著灵活性的方式支撑的人心室心脏组织条(hvcts)，以及在存在或不存在测试化合物的情况下捕获凝胶运动的相关检测(例如记录)装置。cts易于制备，并且以简单方法用于筛选化合物诱导包埋细胞的凝胶运动的能力。第一层系统和方法适用于高通量格式以及常规格式。
第二层筛选系统和方法涉及组织和类器官，该组织或类器官被开发并维持在通常位于类器官模块中的类器官盒或腔中，如本文所述。第二层筛选涉及将组织或类器官暴露于放置在检测(例如记录)装置可以监测类器官行为的环境中的盒或腔中的候选化合物。该环境通常还提供在受控条件下递送和除去流体，例如培养基和含化合物的流体，需要各种控制来维持与组织或类器官生存力相容的环境。两层系统用于两层方法中，该方法揭示了在细胞、组织和/或类器官或器官水平上具有有益心脏作用的化合物，从而提高了在筛选具有此类作用的化合物时所获得结果的准确性和可靠性。此外，本公开提供了三层系统和方法，其涉及上述两层系统和方法并补充了涉及多类器官(或多组织或混合组织和类器官)模块系统和相关方法的第三层系统和方法。在此第三层中，将多种组织和/或类器官开发并维持在可以方便地位于单个类器官模块中的不同类器官盒或腔中(应理解，类器官盒以及类器官模块可以含有组织或类器官)，这些组织和/或类器官可以是相同类型(例如心脏)或不同类型。这种典型的布置方便地允许将单个镜系统(例如角锥镜系统)与单个检测(例如记录)装置结合使用。在使化合物经历三层系统和方法时，获得有关化合物对细胞的有益心脏作用以及化合物对一种或多种同源组织、类器官或器官或对多种不同组织、类器官或器官的作用的信息。三层筛选系统和方法进一步增强了在准确性、可靠性和可重复性方面获得的数据，并在金钱和时间方面增加了可管理的成本。
以下引述的术语在本文明确定义。
“apd50”意指50％复极化的动作电位持续时间。
“apd90”意指90％复极化的动作电位持续时间。
“frda”意指弗里德希氏共济失调。
“fxn”意指蛋白frataxin，而“fxn”意指编码fxn的多核苷酸。
“工程化的心肌细胞”是经过重组工程化以表现出特定基因型和表型的心肌细胞。如本文所用，典型的工程化的心肌细胞包含使用任何已知载体，例如本文公开的慢病毒载体，引入外源核酸，例如针对fxn的短发夹rna的心肌细胞。
“hesc”意指人胚胎干细胞，“hescs”意指多个人胚胎干细胞。
“hipsc”意指人诱导性多能干细胞，“hipscs”意指多个人诱导性多能干细胞。
“hpsc”意指人多能干细胞，“hpscs”意指多个人多能干细胞。
“hvcas”意指人心室心脏各向异性片，“hvcass”意指多个人心室心脏各向异性片。
“hvcm”意指人心室心肌细胞，“hvcms”意指多个人心室心肌细胞。
“hvcoc”意指人心室心脏类器官腔，“hvcocs”意指多个人心室心脏类器官腔。
“hvcts”意指人心室心脏组织条，“hvctss”意指多个人心室心脏组织条。
一般而言，本公开涵盖了具有心脏功能障碍的神经疾病或病症和共济失调，例如扰乱神经心脏轴的神经疾病或病症。遗传性神经疾病和病症可能具有直接或间接的心血管作用，包括对心脏生理功能的影响。具有这种作用潜能的示例性神经疾病和病症包括但不限于弗里德希氏共济失调(frda)，如本文所述；卡-塞氏综合征，其为一种线粒体肌病，伴有心脏传导异常和心肌病；碳水化合物缺乏性ia型糖蛋白综合征，其为一种神经疾病，具有畸形和心脏表现(心脏损害的平均发作时间为5个月，20％死于生命的第一年内，通常是由于严重的心脏并发症引起)；脊髓小脑共济失调，其具有心血管异常，特别是异常心率变异性；威尔逊氏病，其为一种铜代谢病症，具有同心重塑和室上性心动过速；心律失常；丹迪-沃克氏综合征，其以心脏畸形为特征；扩张型心肌病伴共济失调，其表现出dcm和长qt，其中70％的患者进展为心力衰竭或心源性猝死；利氏病，其为一种神经病症，可能与肥厚性心肌病有关；mefas(线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作)，其为一种具有fv肥大的线粒体疾病；merrf(肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病)，其为一种具有心肌病的神经肌肉病症。
为了维持恒定的心脏收缩所需的能量消耗，赋予心肌细胞(心脏的单个工作单元)所有细胞中最高的线粒体密度。26frda，作为一种对心脏具有有害作用的示例性非心脏疾病，是由基因突变引起的，该突变减少fxn产生且因此减少对线粒体的氧化代谢至关重要的许多铁硫蛋白的生物合成。因此，预计该疾病会对心肌细胞产生不利影响，其主要取决于线粒体atp的产生。毫不奇怪，心力衰竭和心律失常是frda患者死亡的主要原因3-6，表明在细胞水平上的收缩和电生理功能障碍。在本文公开的实验研究中，测试了fxn表达对从hesc或hipsc生成的hvcm模型中收缩和电生理功能的影响，其中hipsc包括从frda患者细胞重编程的细胞系。实际上，两名不同患者的frda-hipsc系均显示出比健康hesc和hipsc更低的fxn转录本和蛋白质，表明来自frda-hipsc的hvcm为体外研究frda提供了模型。
为了消除归因于不同hpsc系遗传背景变化的收缩和电生理功能的可能差异反应，通过使用慢病毒递送的lv-shfxn敲低hesc中的fxn表达来模拟如frda患者中所报告的低fxn表达，从而生成了等基因frda模型，如以下实例中所公开。如在转录本和蛋白质水平上fxn表达的减少所证明，该策略已被证明是有效的(图2a，实例3)。更重要的是，首次在由fxn缺陷型hvcm工程化的心脏组织hvcts中观察到了收缩功能障碍。与随时间推移显示出发展力逐渐增加的健康hesc-hvcts不同，在fxn缺陷型hesc-hvcts中，收缩力降低并且保持较低(图2b和2c，实例3)。此外，在缺乏fxn的hesc-hvcts中，力发展的上升和衰减速度也较慢。这些观察结果表明，fxn的缺乏影响了hvcm产生力的能力，随着hvcts随时间推移逐渐成熟，这一点变得更加明显。
fxn缺乏对心脏收缩功能障碍的影响在frda-hipsc衍生的hvcm模型中得到了进一步验证。类似于等基因的fxn缺陷型hesc-hvcm模型，尽管细胞系之间的遗传背景不同，但相对于健康的hipsc-hvcm对照，frda-hipsc衍生的hvcm还通过qpcr和蛋白质印迹证实了fxn的合成减少。frda的六种不同的hesc-和hipsc-hvcts模型(包括健康hesc-和hipsc-hvcts中的等基因fxn敲低模型，它们各自的健康hesc-和hipsc-hvcts对照以及来自两名患者的frda患者来源的hipsc-hvcts)验证了发展力与fxn表达之间的关系。重要的是要注意，主动力的大小与fxn表达之间存在很强的正相关关系(图3b，实例4)，如皮尔逊系数(pearson’scoefficient)0.84所示，其中>0.5的值表示很强的正相关关系。因此，本文公开的数据首次在两种体外模型中建立了frda收缩表型，即来自fxn敲低的等基因模型和直接来自具有fxn基因固有突变的frda患者的另一种模型。
fxn缺陷型hvcts的收缩性受损可能归因于个别hvcm的收缩性降低或收缩细胞数量的减少。由于hvcts的活死染色在fxn缺陷型和健康的hvcts之间没有显示出死细胞数量的差异，因此可以排除收缩性hvcm随时间推移的丧失是fxn缺陷型hvcts收缩性降低的原因。个别hvcm的收缩性降低是合理的预期，因为收缩与高能量消耗相关，并且氧化代谢中所涉及的乌头酸酶和琥珀酸脱氢酶等铁硫蛋白需要fxn，氧化代谢是在成熟的心肌细胞中产生atp的主要方法。预计对atp产生的不利影响将导致力的产生受损。
fxn缺乏诱发hvcm的电生理变化
鉴于frda患者死亡的主要原因之一是心律失常3-6，因此进行了广泛的研究，以确定fxn对hvcas(单层的对齐的hvcm)中电生理特性的影响。这种组织结构不仅可以测量个别细胞的动作电位参数，还可以测量这些细胞作为合胞体的电导率，这是真正测试心律失常性的唯一方法。心律失常性通过自律性的发生率和以螺旋波表示的折返性心律失常的发生率进行评估。尽管与对照相比，在fxn缺陷型hvcas中检测到心律失常没有统计学上的显著增加，但重要的是要注意hvcas由心室cm构成，而在frda患者中，室上性心律失常是常见的心律不齐类型。
尽管在用lv-shfxn转导或在fxn中携带遗传缺陷的fxn缺陷型hvcas中均未检测到致心律失常性的增加，但是通过任一方法产生的fxn缺陷型hvcas与它们各自的健康对照相比，心脏组织构建体的平均mcf始终较低(图4b，实例5)。mcf是细胞连通性的指标-fxn缺陷型hvcas中的mcf较低表明这些细胞之间的电耦合较弱。实际上，在来自frda患者的心脏组织样品切片中已观察到在闰盘形成间隙连接的连接蛋白43的组织破坏。27
有趣的是，与相应的对照相比，等基因fxn缺陷型hesc-hvcas和frda-hipsc-hvcas的apd50和apd90持续延长(图4c，实例5)。该结果表明该疾病表型是稳健的，不受背景遗传差异的影响。有趣的是，可以通过异常的电生理学，尤其是在ekg中存在反映出异常的细胞复极化的t波倒置来检测由于心脏中的代谢应激引起的frda相关病理症状的第一个迹象。6该观察结果与在fxn缺陷型hvcas中观察到的复极化延迟一致。延迟的复极化可能是由于细胞内ca2+的增加所致，合理的预期是因为负责将ca2+运回到肌质网(sr)的肌质网/内质网ca2+-atp酶(serca)的泵送活性降低，从而影响了跨肌膜的na+-ca2+交换。跨模型的apd延长一致性表明，apd参数可以用作使用盘中疾病模型筛选药理治疗的可靠读数。
fxn表达的恢复挽救了受损的收缩功能
通过在frda患者的hipsc和fxn敲低的hescfrda模型中诱导fxn的表达，两个模型在hvcts中产生的力得到了显著改善，这首次证明了通过恢复fxn的表达挽救了人frda三维组织模型中受损的收缩功能(图5，实例6)。这与可诱导和可逆的鼠frda模型相一致，该模型表明fxn表达的恢复可以逆转病理效应。16这些发现表明，fxn表达的恢复是通过预防和逆转作为frda患者致死性的主要促成因素的病理性心脏症状来治疗frda患者的有效策略。重要的是，本文公开的研究证明，具有适当选择的敏感读数的人多能干细胞衍生的三维组织，如使用等距力测量系统所显示的那样，可作为敏感准确的疾病模型用于治疗测试和药物筛选。
fxn缺陷型hvcoc模型
除hvcts外，流体喷射人心室心脏类器官腔(hvcoc)为frda疾病表型建模提供了高阶工程化的心脏组织。hvcoc模型可以概括生理上复杂的行为，例如压力-体积关系、搏出功和心输出量，并且还提供了促成熟环境来增强心脏模拟特性，尤其是与收缩性有关。用lv-shfxn转导的hesc-hvcm或患者来源的frdahipsc-hvcm创建的hvcocfrda模型在物理上完好无损，并且可以泵送流体并产生压力(图6)。当与对照hesc-hvcoc相比时，这些模型在基线条件下或用0.1μm异丙肾上腺素(已知的正性肌力剂)治疗时，均显示出受损的功能特性，包括搏出功、心搏量、射血分数、发展压和心输出量(图6)。它们为在hvcts疾病模型中产生正性结果的治疗添加了更高层次的测定，从而提供了更具生理性和成熟性的组织构建体，并具有更高的敏感性来确认对收缩性的正性作用。
frda体外心脏模型的当前和未来状态
对于以下实例中公开的实验，开发了两种人心脏frda模型，它们使用通过fxn敲低的hesc和从frda患者细胞重编程的hipsc。每种模型都有其自身优于另一种模型的独特优势。尽管通过hesc的fxn敲低生成frda模型可模拟fxn缺乏并创建等基因患病细胞以与健康细胞进行比较，从而通过消除遗传背景差异来减少读数变异性，但从frda患者来源的hipsc产生的frda模型有望成为生理上更准确的盘中心脏病模型，其中fxn表达受到fxn基因中病理性gaa扩增的抑制。该后一种模型有望适用于frda发病机理的体外机制研究。通过利用等基因和患者特定的frda模型，我们能够确定稳固的收缩力(在1hz起搏下的发展力)和电生理(mcf和apd)读数，如在两种测试的frda模型中均表现出一致的表型所指示。
与相应的对照相比，下文公开的实验证明了由fxn缺陷型hpsc衍生的心室cm模型构建的心脏组织的收缩和电生理功能障碍，这些模型是由健康hesc和hipsc的shrna敲低或frda患者特异性hipsc工程化而来。具体来说，在fxn缺陷型hvcts中检测到力的产生减少，并且在fxn缺陷型hvcas中测量到电耦合功能障碍和动作电位延长，这分别反映了心肌病和t波倒置的临床症状。这些参数的评估有望为使用frda或能够表现出有害心脏作用的其他非心脏疾病的体外工程化心脏组织模型提供可靠的药理学筛选读数。对于与frda类似的具有电生理和收缩症状的疾病，可以同时使用电生理(hvcas)和收缩(hvcts/hvcoc)模型进行功效和安全性筛选。
重要的是，我们已经在两个人frda体外模型中证明，通过恢复fxn表达可以挽救与fxn缺乏相关的心脏收缩功能的病理影响。这表明可以刺激患者心脏中fxn表达的治疗可以挽救frda的收缩症状，从而揭示了一种潜在的治疗策略。
以下实例说明了本发明的实施例。实例1公开了本文公开的实验中使用的材料和方法。实例2显示从frda患者成纤维细胞重编程的hipsc显示出降低的fxn表达水平。实例3确定具有等基因fxn敲低的hesc-hvcm表现出降低的fxn表达和降低的收缩功能。实例4显示fxn缺陷型hvcts具有降低的产生收缩力的能力。实例5揭示fxn缺陷型hvcas表现出改变的电生理特性。实例6显示挽救fxn缺乏症可恢复hvcts中的收缩力。实例7显示在基线条件下以及在用0.1μm异丙肾上腺素治疗时，具有收缩功能障碍的fxn缺陷型hvcoc，如由受损的心搏量、心搏量、发展压和心输出量所指示。
实例1
该实例描述了本文实例中公开的实验中使用的材料和方法。
hpsc培养和向cm的分化
在37℃与5％co2下，将健康的hesc(hes2；esi，nih代码eso2)和frda患者特异性hipsc(frda(68)和frda(03665)在具有mtesr1培养基(stemcelltechnologies)的hesc限定的基质胶(coming)上培养，将通过转录因子oct3/4、sox2、klf4、l-myc和lin28加上p53干扰shrna的游离型核转染从外周血单核细胞重编程的hipsc(pb02)在具有essential8培养基(gibco)的hesc限定的geltrex(gibco)上培养。为了使hpsc分化为心肌细胞，使解离的hpsc在超低附着平板中在具有1ng/ml骨形态发生蛋白4(bmp4)的mtesr1中及缺氧条件下形成细胞簇过夜。从第1天到第4天，在缺氧条件下，在补充了glutamax(thermofisherscientific)的stempro-34培养基中，用50μg/ml抗坏血酸(sigma-aldrich)、10ng/ml激活素a和10ng/mlbmp4处理细胞簇。接下来，在缺氧条件下，在stempro-34培养基中用50μg/ml抗坏血酸和5mmiwr-1处理细胞簇直到第8天。在第8天后，将细胞簇在常氧条件下用含有50μg/ml抗坏血酸的stempro-34培养基维持。使用这种分化方案25，可以达到hpsc衍生的cm超过70％的心室亚型产率。这些分化的细胞称为人心室(hv)cm，并用于本文公开的所有实验中。
hvcm中fxn的敲低和过表达
为了在hesc和hipsc衍生的vcm中模拟frda的fxn缺乏，在两种类型的hvcm中通过按照图1a中的时间表以感染复数(moi)5用慢病毒shrna转导(lv-shfxn1：trcn0000006137或lv-shfxn2：trcn0000010996插入plko.1载体主链中)来敲低fxn。用哺乳动物非靶向shrna(lv-shnt)转导各自的对照hvcm。为了恢复fxn表达，用慢病毒转导fxn缺陷型hvcm以过表达fxn(lv-fxn；gedharmaconohs5835-eg2395)，而递送红色荧光蛋白的慢病毒(lv-rfp)作为对照。为了评估和比较健康的、fxn缺陷型和/或过表达fxn的hvcm之间的电生理和收缩功能，从这些细胞构建了两个组织构建平台，每个平台均经过专门设计以实现功能评估，如下所述。
人心室心脏组织条(hvcts)的收缩评估
为了通过测量力的产生来评估收缩功能，如前所述，以hvcts的形式评估hvcm。23-24简而言之，将hpsc心脏分化第15天的心脏簇解离成单个细胞，并使其在培育箱中恢复3天，随后构建成hvcts。每个hvcts由从hpsc分化的1.3×106个心肌细胞和1.3×105个人包皮成纤维细胞在40％5mg/ml胶原蛋白i(thermofisherscientific)、10％9.3mg/ml基质胶、6％10×pbs、2％1mnaoh、8％10×最低必需培养基(sigma-aldrich)、8％0.2mhepes、10％hvcts维持培养基(具有10％新手小牛血清的杜尔贝科氏最低必需培养基)和无菌水中组成，最终体积为100μl。将细胞-胶原混合物添加到聚二甲基硅氧烷(pdms)模具中，在条带的每个末端均具有力感测悬臂柱，以形成hvcts。将hvcts维持在补充有10％新生小牛血清的dmem培养基(gibco)中。
由hvcts产生的力是在37℃下在具有hepes的不含酚红的dmem培养基中，使用定制设计的力测量系统记录悬臂柱的位移来测量的。hvcts通过电场刺激进行起搏来测量力-频率响应。实验时间表的概述在图1a中示出。
人心室心肌各向异性片(hvcas)的电生理评估
为了评估作为与体内心室cm相似且具有各向异性传导特性的对齐和电耦合的合胞体的hvcm的电生理特性，将hpsc心脏分化第20天的心脏簇解离成单个细胞，将每平方厘米4.5×105个细胞以单层形式覆在由聚苯乙烯收缩膜(shrinkydinks‘crystalclear’,k&binnovations)制成的基质胶涂布的微凹槽衬底上，其中凹槽宽度为15μm，凹槽深度为5μm，凹槽间距为5μm，以形成hvcas，如前所述。20在允许恢复8天后，使用micamultima成像系统(scimedia)使用电压敏感的荧光团di-8-anepps和pluronicf-127(thermofisherscientific)在含有布雷他汀(blebbistatin)的台氏液(tyrode’ssolution)(sigma-aldrich)中光学绘制hvcas的动作电位。首先确定每个hvcas的自律性、阈值电压和最大捕获频率(mcf)，然后通过编程的电刺激测试折返性心律失常。实验时间表的概述在图1a中示出。
用人心室心脏类器官腔(hvcoc)进行疾病建模
为了评估三维心脏模拟结构中的心脏功能，如前所述，以hvcoc的形式评估hvcm49。简而言之，将hpsc心脏分化第15天的心脏簇解离成单个细胞，并使其在培育箱中恢复3天，随后构建成hvcoc。每个hvcoc由1×107个hvcm和1×106个人包皮成纤维细胞在40％5mg/ml胶原蛋白i(thermofisherscientific)、10％9.3mg/ml基质胶、6％10×pbs、2％1mnaoh、8％10×最低必需培养基(sigma-aldrich)、8％0.2mhepes、10％hvcts维持培养基(具有10％新手小牛血清的杜尔贝科氏最低必需培养基)和无菌水中组成，最终体积为1ml。将冰冷的无菌组织混合物转移到定制设计的生物反应器中。将整个装置在37℃和5％co2下培育2小时以引发凝胶聚合，然后将其浸入hvcoc维持培养基中。将组织在此环境中在37℃和5％co2下维持10天，每日更换一半培养基，在此期间，组织在球囊核周围变紧，形成空心的人体工程化心脏类器官。
培养10-12天后，将硅橡胶球囊放气并从类器官内部小心地取出。将高灵敏度压力导管(millar)推入hvcoc腔的内腔，并密封导管入口点。将高速照相机(alliedvision,exton,pa,usa)安装在生物反应器外部，并允许以100帧/秒采集图像以进行直接组织监测。使用labview(nationalinstruments,austin,tx,usa)中内置的自定义采集程序同时采集腔室压力和数字视频，并使用matlab(mathworks,natick,ma,usa)中的自定义脚本从视频中提取腔室横截面积。然后通过假设具有相同横截面积的等效球体来估算腔室体积。根据所得p-v环，以发展压和心搏量的乘积计算搏出功。当需要时，使用间距为19mm的一对碳电极在10v振幅下使用50ms的刺激脉冲宽度来诱导电场刺激。在进行数据分析之前，压力信号和视频信号都要通过matlab中具有13-hz截止频率的数字低通滤波器。在自发搏动和1.0hz的电场刺激过程中测量hvcoc收缩。
实例2
从frda患者成纤维细胞重编程的hipsc表现出减少的fxn表达
评估了一种健康hesc、一种健康hipsc以及来自两名患者的重编程的两种frda-hipsc系frda(68)和frda(03665)的fxn表达。两种frda-hipsc系在转录水平上的fxn相当，两者均比健康的hesc和hipsc系表达的fxn低50％以上(图1b)。fxn的蛋白质水平与转录本一致，相对于健康hpsc系，frda-hipsc表达最低水平的fxn。与hesc相比和frda(68)与hipscs相比，两种frda系的表达差异均是统计学上显著的(图1b)。
实例3
从hesc-hvcm生成的等基因fxn敲低模型表现出减少的fxn表达和收缩功能
为了模拟和研究frda在体外等基因人cm中的进展，用两种lv-shfxn构建体lv-shfxn1和lv-shfxn2转导hesc衍生的hvcm，并以非靶向lv-shnt转导为对照。相对于lv-shnt转导的对照，如hesc-hvcm表达水平降低约70％所证明，两种lv-shfxn均成功地在转录水平上诱导了fxn的敲低(图2a)。lv-shfxn1和lv-shfxn2分别使hvcm中fxn蛋白减少60％和80％。值得注意的是，相对于健康的hesc组，lv-shfxn转导的hvcm表现出fxn表达减少，与frda-hipsc相比其相应的健康对照的fxn表达减少相当(图1b)。
收缩功能作为在1hz起搏期间发展的颤搐力产生加以评估。hvcts通常在构建后6-7天内重建自发性收缩。在hvcts构建后的第7天、第9天和第12天，从hvcts测量了在1hz电起搏下的颤搐力产生(图2b和2c)。对照hesc-hvcts中的收缩力从第7天的中位数5μn逐渐增加到第12天的135μn。相反，通过任一lv-shfxn敲低fxn的hesc-hvcts都无法随时间推移显著增加发展力。到第12天，fxn缺陷型hvcts的中位力比对照低75-80％(图2c)。
实例4
fxn缺陷型hvcts中的收缩力产生减少
在转录本和蛋白质水平上均评估了源自frda(68)-hipsc和健康hipsc的hvcm的fxn表达。与健康对照相比，从frda(68)-hvcm分化的hvcm在转录水平上表达的fxn少约50％，在蛋白质水平上表达的少将近80％(图3a)。在将frda-hipsc-hvcm构建成hvcts后测量力，并再次与健康的hipsc对照相比。为了使力产生的大小与fxn表达水平相关，将通过1hz起搏刺激的第12天在hvcts中产生的力相对于fxn转录物表达作图(图3b)。通常，fxn缺陷型hvcts(由于健康的hesc或hipsc衍生的心肌细胞的敲低或由于frda-hipsc衍生的心肌细胞的遗传缺陷)表现出受损的力产生，发展作为表达fxn的健康对照的不到一半的力。因此，如皮尔逊系数0.81所示，发展力水平与fxn表达之间存在很强的直接相关性。
实例5
fxn缺陷型hvcas的电生理特性改变
通过敲低(对照hesc对比lv-shfxnhesc)或由frda患者特异性体细胞重编程(对照hipsc对比frda-hipsc)而缺乏fxn的hpsc衍生的hvcm的电生理功能是通过作为hvcas进行光学标测来评估。hvcas的动作电位和等时线图是从光学记录中得出的(图4a)。与用lv-shnt转导的对照相比，用lv-shfxn转导的hesc-hvcas的螺旋传导波和自律性的发生率或动作电位的自发产生在统计学上没有差异。lv-shfxn转导的hesc-hvcas的最大捕获频率(mcf)，中位数为2.0hz，在统计学上低于对照，中位数为2.5hz(图4b)。与对照相比，frda-hipsc衍生的hvcas在更高的起搏频率下同样更难捕获——frda-hipsc-hvcas的中位mcf为1.5hz，健康hipsc-hvcas的中位mcf为2.5hz(图4b)。
从光学记录量化的动作电位和传导参数揭示了健康的hvcas和fxn缺陷型hvcas之间的电生理差异(图4c)。对于hesc和hipsc组，fxn缺陷型hvcas与对照之间的动作电位上升和衰减速度以及传导速度在纵向和横向上均未显示出一致的差异。然而，相对于对照(apd50：138ms，apd90：236ms)，用lv-shfxn转导的hesc-hvcas(apd50：153ms，apd90：268ms)显著延长了50％复极化(apd50)和90％复极化(apd90)的动作电位持续时间(图4c)。值得注意的是，与健康对照相比，frda-hipsc-hvcas同样延长了apd50和apd90(图4c)。
实例6
挽救fxn缺乏恢复hvcts的收缩功能
作为评估fxn缺乏的恢复是否可以挽救hvctsfrda模型中受损的收缩功能的第一步，通过在frda(03665)-hvcts中用lv-fxn转导来强制表达fxn。与用lv-rfp转导的对照相比，fxn转录本和蛋白质的表达高出30倍以上，表明用lv-fxn转导的frda(03665)-hvcts中的fxn缺陷得以纠正(图5a)。在构建后第17天，lv-fxn转导的frda(03665)-hvcts在1hz起搏时产生的收缩动力学和力与53μn的对照相比明显较高，中位收缩力为167μn(图5b)。
接下来，在互补的等基因hesc-hvctsfrda模型中评估了恢复的fxn表达的功能结果，该模型包括两个具有fxn敲低和强制表达组合的双重转导的组——具有fxn的敲低和强制表达的lv-shfxn+lv-fxn组以及具有fxn敲低和rfp对照的lv-shfxn+lv-rfp组(图5c)。如所预期，hesc-hvcts转导的lv-shfxn+lv-fxn的fxn蛋白表达得以恢复，其表达水平显著高于lv-shfxn+lv-rfp对照。通过以0.225mm(2.5％应变)的步长控制肌肉条的长度来进行更详细的生理等距力测量，结果显示，在构建后的第18天，所有hvcts组在1hz起搏下发展的抽搐力均随着肌肉条长度的增加而增加，在lmax(在最大颤搐力下的长度)下达到更高的颤搐力。与在frda-hipsc模型中观察到的fxn挽救效果相似，在具有稳定fxn表达的挽救的hesc-hvctsfrda模型中，在17.5-27.5％应变生理范围下，颤搐力与在50μn下的fxn缺陷型对照相比明显更高，在lmax下表现出109μn的中位力。在具有恢复的fxn表达的hesc-hvctsfrda模型中，力动力学也显著加快，与在lmax下0.42μn/ms的对照水平相比中位收缩速率为0.89μn/ms，而与在lmax下0.24μn/ms的对照速率相比中位舒张速率为0.57μn/ms。
实例7
类器官模块
在本文公开的生物反应器的一些实施例中，外壳(约25×25×15cm)由可灭菌材料与检测/记录装置2(例如照相机)和温度控制元件4(例如加热单元)制成，附接到类器官模块10的顶部，全部如图7中所示。在一些实施例中，例如加热器形式的温度控制元件4被放置在外壳内。竖直照相机聚焦到四侧45度角锥镜13上，其将一个或多个类器官1的侧面轮廓向上反射到照相机。倾斜的led灯12均匀地照亮每个类器官1的侧面轮廓。接入门允许将可更换的类器官盒20简单地插入到类器官模块10中以进行监测，然后取出进行其他实验分析(例如光学标测)。在对类器官1进行治疗性给药后，使用微型磁力搅拌器(例如thermoscimicrostirrer)形式的混合器19混合培养基93，该混合器可以使用软件控制来打开和关闭。参见图8。使用包含恒温器、加热器和风扇的温度控制元件4(例如incukitmini)对每个类器官模块10进行温度控制。为了细胞培养缓冲，co2水平也单独控制在5％。平台的co2控制系统包含连接至压力调节器的单箱，该箱在连接至每个类器官模块10之前先连接至电磁阀歧管(例如takasagoctv-2-4mic)，最后又连接至流量计(dwyermini-masterflowmeter)。每个阀通过多通道数字输出模块(例如ni-9472)进行单独控制。外壳内的co2传感器(例如sprintir)测量co2水平并控制阀在打开和关闭状态之间切换。考虑并入其他传感器(例如o2传感器)以进一步控制封闭环境内的特定分压。
由于微组织缺少较大器官的关键特征(例如较厚组织的扩散限制)，因此它们不是模拟人体器官反应的理想选择。允许在多个宏观类器官之间进行流体交换的生物反应器概括了人体的关键生理和药理特征。在简化的人体仿生模型中测量多个功能特性的能力为弥合传统细胞培养系统、体内动物模型和临床试验之间的长期差距提供了新途径。结合诱导的hpsc的体细胞重编程，“罐中人体”系统有望成为下一代药物发现、心脏毒性筛选、疾病模型化以及其他种族、性别和患者特异性应用的通用平台。
来自hvcocfrda疾病模型的数据还揭示了健康的心肌细胞与有效源自frda患者的心肌细胞之间的生理区别(图6)。用lv-shfxn转导的hesc-hvcm或患者来源的frdahipsc-hvcm创建的hvcocfrda模型在物理上完好无损，并且可以泵送流体并产生压力(图6)。这些模型与健康的hesc-hvcm(用慢病毒非靶向shrna对照转导)进行交叉比较时，在基线条件下和在用0.1μm异丙肾上腺素(iso)治疗时均显示出受损的功能特性，包括搏出功、心搏量、射血分数、发展压和心输出量(图6)。
实例8
筛选设备或生物反应器
本公开提供了用于培养许多，并且在一些情况下，培养多种组织工程化的人类器官的定制生物反应器。该装置被设计成允许互连和同时测量多个类器官，并具有通过使操作员能够以最少操纵或干预而在同一生物反应器中进行后续表征来增强类器官功能测试的重现性和效率的特征。
图6提供了高级示意图，说明所公开的生物反应器系统的多功能性。图6a显示了一个类器官模块10，该模块含有至少一个类器官盒20。类器官盒20含有任何类型的单个类器官1(例如心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、前列腺、子宫、血液、血管、肿瘤、眼睛或皮肤等)，优选心脏。类器官模块10可以含有多个类器官盒20，因此可以含有多个单一类型的类器官1或多种类器官1。类器官模块10被定向成使得检测/记录装置2(例如照相机)可以检测和记录类器官模块10的内容，例如通过使类器官模块10最靠近检测/记录装置2并且优选地垂直于该装置的表面对检测/记录装置2所检测的电磁频谱的至少一个波长基本上或完全透明来进行该检测和记录。图6b示出了与至少一个类器官模块10连接的数据处理器5，例如计算机。类器官模块10通常与检测/记录装置2呈1:1对应，并且检测/记录装置2通过通信路径7，例如常规的电线或无线通信与数据处理器5进行电子通信。视频监视器6也可以通过通信路径7连接到数据处理器5。
图7示出了类器官模块10的透视图。至少一个类器官盒20位于类器官模块10内。安置于类器官模块10之内或之外(未示出)以及安置于类器官盒20之内(未示出)或之外的是混合器19，例如上面放置类器官模块10的可移动平台(例如振动器或旋转平台)或位于类器官盒20内部或外部的磁力搅拌装置(例如搅拌棒)。在一些实施例中，至少一个光源12位于类器官模块10内，用于照亮类器官1。同样位于类器官模块10内的是至少一个镜13，用于以直射和/或反射光图像的形式将电磁辐射从类器官1引导至检测/记录装置2。在一些实施例中，镜13是角锥镜13，用于将图像从多个类器官盒20引导至单个检测/记录装置2。角锥镜13可以将多个类器官盒20的图像汇合成单个聚集的视点以使图像分辨率最大，同时允许各个类器官盒20以物理方式彼此间隔开。
图8示出了生物反应器系统的一个实施例的元件，该元件涉及流体移动，例如培养基流动，特别是涉及添加或供给新鲜培养基以及去除或抽吸用过或废弃的培养基所涉及的流体移动。图8a示出了用于类器官模块10中的单个类器官盒20的整个流体交换系统，图8b提供了用于抽吸的激活阀和泵的组合，而图8c提供了用于供给新鲜培养基的组合。该系统中涉及流体(例如培养基)运动的组件可以位于类器官模块10之内或之外。在描述如图8所示的提供流体运动的生物反应器系统的一个实施例时，注意力将集中在用于培养基抽吸的图8b以及用于将培养基供给至本公开的细胞、组织和类器官的图8c。应理解，抽吸和供给的组合描述将提供对生物反应器系统的一个实施例中的完整流体连通的描述，如图8a所示。在图8的其余描述中，附件应理解为在附接的组件之间提供流体连通。
现转到生物反应器系统的一个实施例中涉及用于抽吸培养基的图8b的特征，培养基93与盒培养基-接头d管道86接触，该管道附接到接头d阀67。类器官-接头d管道85也附接到接头d阀67。此外，接头d阀67附接到接头d-泵c管道87，该管道附接到泵c72。泵c72附接到泵c-接头c管道88，该管道附接到接头c阀66。接头c阀66附接到接头c-混合/再循环箱管道89，该管道又附接到混合/再循环箱73。在一些实施例中，培养基93再循环并被导向混合/再循环箱73。接头c阀66还附接到从接头c阀66通向废料的接头c-废料管道90。
在操作中，类器官中细胞的供给涉及图8c中突出显示的组件，包括新鲜培养基箱60，其附接到新鲜培养基-接头b管道78，该管道又附接到接头b阀65。接头b阀65附接到接头b-泵b管道79，该管道附接到泵b71。泵b71又附接到泵b-接头e管道80，该管道附接到接头e阀68。接头e阀68还附接到接头e-接头f管道82，该管道附接到接头f阀69。盒培养基-接头f管道83也附接到接头f阀69，该管道也接触盒培养基93。
描述了附加的附接组件，其在系统内提供流体连通并允许附加的功能，包括但不限于治疗性添加剂稀释、治疗剂的灌注、类器官的治疗性清洗、流体管线的冲洗等。新鲜培养基箱60附接到新鲜培养基-接头a管道74并与之流体连通，该管道又附接到接头a阀64，例如三通流体控制器或阀并与之流体连通。添加剂容器62(例如治疗剂容器)用于将至少一种治疗剂递送至添加剂箱63，该添加剂箱附接到添加剂箱-接头a管道75，该管道又附接到接头a阀64。接头a阀64还附接到接头a-泵a管道76，该管道附接到泵a70。泵a70附接到泵a-混合/再循环箱管道77，该管道又附接到混合/再循环箱73。在一些实施例中，来自新鲜培养基箱60的培养基用于稀释来自混合/再循环箱73内的添加剂箱63的治疗剂。混合/再循环箱73还附接到混合/再循环箱-接头b管道92，该管道又附接到接头b阀65。接头e阀68附接到接头e-类器官盒管道81。在一些实施例中，培养基可以通过接头e-类器官盒管道81进行递送，以增加类器官1内的压力。压力探针，即压力传感器95，检测类器官1内的压力和压力变化，并将压力转换为模拟电信号，该信号通常会传输到数据处理器，从而允许压力由系统监测和调整。另外，该装置提供了对流体管线的清洗或冲洗。特别地，接头f阀69附接到接头f-废料管道84，该管道又从接头f阀69引导至废料。在一些实施例中，通过经由接头f-废料管道84排出到废料，可以在不与类器官盒20接触的情况下从流体交换系统中除去流体。
图9示出了类器官模块10内的流体交换的高级示意图，以说明“罐中身体”的形成。图9a示出了流体交换系统，该流体交换系统在类器官模块10内的至少两个类器官盒20之间转移培养基。流体通过一系列的阀和泵被引导通过该系统。图9b示出了流体交换系统，其中流体由阀引导并且仅由生物泵(例如心脏类器官1)泵送，从而提供自供能的“罐中身体”。
图10示出了使流体流入和流出类器官1的方法。图10a示出了类器官1(左图：心脏类器官；右图：肝脏类器官)，其连接至培养基入口管26和培养基出口管28，从而允许流体被引导到类器官1的空隙中并通过培养基出口管28流出至废料路径。流经类器官1的流体的方向由入口阀27和出口阀29控制。图10b表示了向类器官1(例如肺类器官1)施加机械压力的方法。流体泵控制流体流动(例如气体或液体)到类器官1并调节类器官腔的压力以控制类器官1的大小。绝对压力值取决于类器官1的材料特性和给定应用所需的膜尺寸。调整施加的相对压力以使机械应变至多25％。
如对本领域技术人员显而易见的，生物反应器的一些特征是可选的，并且大多数特征存在于各种实施例中。在一些实施例中，细胞可以源自任何哺乳动物物种或被工程化为来自细胞和/或细胞外基质的类器官1。任何器官组织类型均适用于所公开的系统、组合物和方法；心脏细胞、组织和类器官是优选的。例如，组织可以充当任何器官的替代物，包括但不限于心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、前列腺、子宫、血液、血管、肿瘤、眼睛和皮肤。
含有类器官1的类器官盒20通常是由透明固体制成的立方体，其可以是一次性的或可灭菌的，具有至少两个接入端口，例如门。合适的透明固体包括玻璃和透明塑料，例如聚苯乙烯、丙烯酸和聚碳酸酯。只要检测/记录装置2可以检测和记录类器官盒20内的类器官1中的细胞的行为，类器官盒20也可以是任何多边形。假定类器官盒20的结构受到允许检测/记录装置2检测细胞行为的需求所限制，很明显可以在构造类器官盒20中使用各种透明和半透明的材料。在检测/记录装置2不检测来自类器官1的可见光的透射的实施例中，甚至设想了不透明的材料。类器官盒20也被构造成不透流体的，从而允许类器官盒20容纳盒培养基93以供给类器官1的细胞。此外，盒盖可以提供用于穿透至少一个电极或压力探针(即压力传感器95)的孔。
在类器官模块10中含有至少一个类器官盒20，该模块由与用于类器官盒20的材料相似的材料形成。类器官模块10在平面图中通常为正方形或矩形，并且除了底部外还含有顶部。类器官模块10的尺寸可容纳至少1、2、3、4、5、6、8、10或更多个类器官盒20。类器官模块10的壁、顶部和底部通常由透明固体形成，例如玻璃或透明塑料(例如丙烯酸或聚碳酸酯)，但也可以由半透明或不透明的材料制成，只要检测/记录设备2可以检测和记录细胞行为即可。类器官模块10通常还含有一个或多个光源12，以及一个或多个镜13，例如角锥镜13。在若干实施例中，对于类器官模块10中所含的每个类器官盒20，存在至少一个光源12和镜13的至少一个表面。
该系统的其余组件包括诸如新鲜培养基箱60、混合/再循环箱73和添加剂箱63之类的箱，它们是用于容纳生物反应器中使用的流体的容器。这样的箱可以是任何各种尺寸，并且可以由多种材料制成，只要所构造的箱可以在设计用于最小化生物污染的环境(例如无菌环境)中使用，并且只要所使用的材料与其可以容纳的任何流体相容并且与形成一个或多个流体移动端口相容即可。生物反应器的实施例还可以涉及一个或多个泵，例如泵a70、泵b71和泵c72，这些泵可以相同或不同，并且可以按照已知的任何提供流体(例如通过管的空气和/或培养基)移动的原理进行操作。示例性的泵包括蠕动泵、与无菌环境相容的虹吸泵、诸如活塞驱动泵的正排量泵和诸如离心泵的非正排量泵。在一些实施例中，重力被用于使流体移动，而没有泵被用于使例如培养基移动。
类器官模块10还可以与各种管接口以使用于提供压力的气体(例如空气)移动，例如使类器官膨胀，该类器官可以是球囊(例如6-fr硅foley导管球囊)或用于使流体移动。压力变化足以控制球囊的充气或使流体在系统中移动，这是在与多种管类型的使用相容的压力下实现的，而不仅仅是经认证处理高压的管道。例如，适合使用透明的塑料柔性管道，例如
在一些实施例中，类器官模型具有流入和流出的流体路径(图10a)。阀(例如止回阀、电磁阀)控制流体移动进出带有腔的类器官的方向。在一些实施例中，考虑了用于流入和流出的单个轴或管(图10b)。流体泵控制流入和流出类器官的流体流动速率。在一些实施例中，不相等的流入和流出流体速率用于控制类器官内的流体量。调节类器官腔内的体积会导致柔韧性类器官的机械拉伸。在一些实施例中，以阶跃函数(被动拉伸)或s形函数(循环拉伸)形式施加拉伸。在许多类器官类型中，机械拉伸被认为是机械转导信号。在一些实施例中，机械刺激和电刺激的组合为治疗剂筛选提供了更稳健的反应。
流体交换系统自动进行常规培养基更换，调节腔内压力，在筛选过程中对候选治疗剂进行灌注并在类器官之间交换培养基(图8和9)。流体系统由一系列微流体泵、由数字输出板控制的三通阀和培养基储集器组成。更改阀配置会改变培养基的行进方向。在一些实施例中，可以将流体添加到中空的竖直安装轴中或从中去除，该轴连接有类器官，从而调节静水压力。压力传感器95和信号调节器(例如opp-m和lifesens)感测类器官内的平均压力，并通过labview与泵通信以调节所需的腔内压力。另外，流体交换系统用于将化合物混合和灌注至类器官。从添加剂箱中泵吸出溶液，并与循环培养基混合。然后该化合物灌注到类器官盒20中并通过类器官1，类似于经由人血流的药物递送。在一些实施例中，泵和阀的流体系统连接类器官模块10内的至少两个类器官盒20，以允许在类器官1之间或当中进行培养基和/或治疗剂的交换。另外，在一些实施例中，类器官盒20之间的流体交换系统由类器官1形式的生物泵(例如心脏类器官1)提供动力。
实例9
生物反应器控件.
自定义labview代码自动执行该过程的很大一部分，包括硬件和软件。每个类器官模块10通过一台由labview驱动的计算机(即数据处理器5)进行离散控制。有关示例性软件流程图，参见图13。因此，在或可以在不同条件下同时监测多个类器官1和多个类器官模块10(图11)。labview代码控制相关的硬件，例如数据采集装置、多通道数字输出源、阀、泵和照相机捕获卡。因此，该代码以电子方式控制生物反应器平台或系统的多种功能，例如自动药物灌注和混合、腔内压力控制、电刺激、co2和温度控制以及具有同步图像捕获功能的压力传导。该计算机配备有足够的内存和存储空间来连续捕获数据(例如，足以进行至少24小时的连续数据收集)。图像采集与生物反应器的其他采集模式(例如类器官内压力测量)同步，以实现临床上相关的终点测量(例如压力-体积环)。labview代码中的几种分析功能可以增强和简化生物反应器的用户功能。阈值数字图像的粒子分析例如通过角锥镜13量化多个离散类器官1的实时体积，其可用于实时计算相关类器官1的收缩特征。这些功能与或可以与电刺激器的控制组合，用于自动最大捕获频率分析和相关的电生理测试方案。例如，对于心脏类器官1，labview代码通过向心脏类器官1发送0.5hz的双相电刺激脉冲开始，并监测该类器官1是否捕获了当前频率。该代码会自动增加电刺激的速率，直到丢失1:1捕获为止，此时心脏类器官1的跳动频率不再与刺激速率匹配。记录日期、药物干预时间、电起搏方案以及所探测到的每个类器官1的其他信息都保存为元数据，以用于存档和质量控制目的。
实例10
数据捕获.
同时记录来自生物反应器的压力和体积数据，以在相关的收缩类器官中生成压力-体积曲线。高速数字照相机(alliedvision)获取高达100帧/秒的图像。通过假设具有相同横截面积的等效球体来估算类器官体积。从例如心脏类器官1的单次采集通常包含多次收缩。为了表征类器官的平均收缩特征，matlab代码首先将曲线分成离散的收缩。然后将每次收缩的数据对齐并取平均值(图12a)。然后可以将平均压力曲线和平均体积曲线绘制为平均p-v环(图12b)。
分析记录的高速明场视频(例如光流)以表征收缩类器官1的运动模式。分析收缩概况的变化以确认对类器官1收缩性能的治疗作用。为了处理大量的多维数据采集，机器学习算法确定与治疗反应相关的关键参数，并最终将未知的治疗剂分类为感兴趣的类别。此外，机器学习可以与长期数据采集同时执行，以鉴定罕见的异常事件并最小化数据存储。例如，长期数据采集可以分为一系列连续的采集。随着进一步的采集继续，已完成的采集被发送到缓冲区进行分析。机器学习(例如二进制支持向量机)会根据缓冲区内的数据评估功能中的任何异常，例如罕见的异常事件。如果检测到异常，则将相关数据永久存储，而将正常功能数据丢弃。
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从引用的上下文中显而易见的是，在此引用的每个参考文献都以全文或相关部分引用的方式并入本文中。
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