嗜中性粒细胞亚型的制作方法

本公开涉及嗜中性粒细胞，将嗜中性粒细胞分类为嗜中性粒细胞亚型和将其分开和/或分离/富集的方法。本公开还涉及与嗜中性粒细胞亚型相关的治疗、诊断和预后方法或试剂盒。
背景技术：
：：嗜中性粒细胞是针对病原体的早期先天免疫应答的不可缺少的细胞。嗜中性粒细胞生成中的任何缺陷都可能导致威胁生命的疾患，因此需要严格调控它们的发育。由于其半衰期短，嗜中性粒细胞需要从增殖性骨髓(bm)前体不断补充。虽然已经确立了嗜中性粒细胞来源于粒细胞-巨噬细胞祖细胞(gmp)，但是从gmp到功能性成熟的嗜中性粒细胞的分化途径很不明确。技术实现要素：本发明试图提供一种将嗜中性粒细胞分类/表征为嗜中性粒细胞亚型以及将其分开和/或分离/富集的方法。本发明还试图提供与嗜中性粒细胞亚型相关的试剂盒和治疗、诊断和预后方法。根据本发明的一个方面，提供了一种表征和/或分开嗜中性粒细胞的方法，该方法包括根据嗜中性粒细胞上cd101的表达表征嗜中性粒细胞和/或将嗜中性粒细胞分离为包含增殖性嗜中性粒细胞的第一群体和包含成熟嗜中性粒细胞的第二群体。在一些实例中，第一群体表达cd101-和第二群体表达cd101+。在一些实例中，当嗜中性粒细胞是人嗜中性粒细胞时，该方法可进一步包括根据嗜中性粒细胞上cd10的表达表征和/或分开嗜中性粒细胞，其中包含增殖性嗜中性粒细胞的第一群体是cd10-cd101-，而包含成熟嗜中性粒细胞的第二群体是cd10+cd101+，任选地第二嗜中性粒细胞群体还包含呈cd10-cd101+的未成熟嗜中性粒细胞。在一些实例中，该方法可进一步包括根据一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分开嗜中性粒细胞，所述生物标记物选自下组：cd49d、cd16、cxcr2、cd34、cd66、cd15、cd71和cd11b。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以包括原嗜中性粒细胞(pro-neutrophil)和前嗜中性粒细胞(pre-neutrophil)。在一些实例中，原嗜中性粒细胞可以是cd101-cd10-cd16-cd34-cd66b+cd15+cd71+cd49d+cd11b-cxcr2-，前嗜中性粒细胞可以是cd101-cd10-cd16-cd34-cd66b+cd15+cd71+cd49d+cd11b+cxcr2-，未成熟嗜中性粒细胞可以是cd101+cd10-cd16-cd34-cd66b+cd15+cd71-cd49dlocd11b+cxcr2-，和成熟嗜中性粒细胞可以是cd101+cd10+cd16+cd34-cd66b+cd15+cd71-cd49dlocd11b+cxcr2+。在一些实例中，当嗜中性粒细胞是鼠嗜中性粒细胞时，该方法可进一步包括根据嗜中性粒细胞上ckit的表达表征和/或分开嗜中性粒细胞，其中包括增殖性嗜中性粒细胞的第一群体可以是ckithicd101–、ckitintcd101–或ckitlocd101–之一，且第二群体包括可以是ckit-cd101+的成熟嗜中性粒细胞。在一些实例中，第一嗜中性粒细胞群体可以进一步包含呈ckitlocd101+的未成熟嗜中性粒细胞。在一些实例中，所述方法可进一步包括根据一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分开嗜中性粒细胞，所述生物标记物选自下组：cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1和cxcr4。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以包括原嗜中性粒细胞和前嗜中性粒细胞。在一些实例中，原嗜中性粒细胞可以是cd101-ckithily6c+cd106+siglecf-cd115-cd205-cd11blogr1locxcr4hi，前嗜中性粒细胞可以是cd101-ckitloly6c+cd106++siglecf-cd115-cd205+cd11bhigr1hicxcr4hi或cd101-ckitintly6c+cd106++siglecf-cd115-cd205+cd11bhigr1hicxcr4hi，未成熟嗜中性粒细胞可以是cd101-ckitintly6c+cd106+siglecf-cd115-cd205+cd11bhigr1hicxcr4lo或cd101-ckitloly6c+cd106+siglecf-cd115-cd205+cd11bhigr1hicxcr4lo和成熟嗜中性粒细胞可以是cd101+ckit-ly6c+cd106losiglecf-cd115-cd205+cd11bhigr1hicxcr4lo。根据本发明的另一个方面，提供了一种用于分离嗜中性粒细胞的试剂盒。在一些实例中，所述试剂盒可以包含用于检测嗜中性粒细胞上cd101的表达的试剂；和/或分离器，其用于根据嗜中性粒细胞上cd101的表达分离包含增殖性嗜中性粒细胞的第一群体和包含成熟嗜中性粒细胞的第二群体。在一些实例中，第一群体可以表达cd101-和第二群体可以表达cd101+。在一些实例中，所述试剂盒可用于分离人嗜中性粒细胞，且所述试剂盒可进一步包含用于检测人嗜中性粒细胞上cd10的表达的试剂，并且所述分离器可适应于根据嗜中性粒细胞上cd10的表达分开嗜中性粒细胞，其中包含增殖性嗜中性粒细胞的第一群体是cd10-cd101-，并且包含成熟嗜中性粒细胞的第二群体是cd10+cd101+，任选地第二群体还包含呈cd10-cd101+的未成熟嗜中性粒细胞。在一些实例中，用于检测cd10表达的试剂是适应于靶向cd10的抗体，和/或其中用于检测cd101表达的试剂是适应于靶向cd101的抗体。在一些实例中，所述试剂盒可以进一步包括用于检测一种或多种生物标记物在嗜中性粒细胞上的表达的试剂，所述生物标记物选自下组：cd49d、cd16、cxcr2、cd34、cd66、cd15、cd71和cd11b，且其中所述分离器适应于根据嗜中性粒细胞上cd49d、cd16、cxcr2、cd34、cd66、cd15、cd71和cd11b中的一种或多种的表达来分开嗜中性粒细胞。在一些实例中，所述试剂盒可以用于分开鼠嗜中性粒细胞，且其中所述分离器可以进一步适应于根据cd101和/或ckit的表达分开嗜中性粒细胞，其中第一群体可以包含增殖性嗜中性粒细胞，其是ckithicd101–、ckitintcd101–或ckitlocd101–之一，并且第二群体可以包含成熟嗜中性粒细胞，其是ckit-cd101+，任选地其中第一群体还可以包含呈ckitlocd101+的未成熟嗜中性粒细胞。在一些实例中，用于检测cd101和/或ckit表达的试剂可以是适应于靶向cd101和/或ckit的抗体。在一些实例中，所述试剂盒可进一步包括用于检测一种或多种生物标记物在嗜中性粒细胞上表达的试剂，所述生物标记物例如但不限于cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1、cxcr4等，且其中所述分离器可适应于根据所述生物标记物之一在嗜中性粒细胞上的表达来分开嗜中性粒细胞，所述生物标记物例如但不限于cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1和/或cxcr4。根据本发明的另一个方面，提供了分离和/或富集所需的嗜中性粒细胞的方法。在一些实例中，该方法可包括根据嗜中性粒细胞上cd101的表达将样品中的嗜中性粒细胞分类为包含增殖性嗜中性粒细胞的第一群体以及包含成熟嗜中性粒细胞的第二群体。在一些实例中，所述方法可进一步包括从第一群体和/或第二群体分离和/或富集一种或多种嗜中性粒细胞。在一些实例中，样品可以从人类受试者获得。在这样的实例中，该方法可进一步包括根据嗜中性粒细胞上cd10的表达将嗜中性粒细胞分类，其中包含增殖性嗜中性粒细胞的第一群体是cd10-cd101-，且包含成熟嗜中性粒细胞的第二群体是cd10+cd101+。在一些实例中，第二群体还可以包含未成熟嗜中性粒细胞且为cd10-cd101+。在一些实例中，该方法可包括用适应于靶向cd10和/或cd101的试剂检测cd10和/或cd101的表达。在一些实例中，该方法可包括分离一种或多种嗜中性粒细胞，包括通过适应于靶向cd10和/或cd101的试剂来固定化该一种或多种嗜中性粒细胞。在一些实例中，所述方法可进一步包括通过检测一种或多种生物标记物的表达来验证第一和/或第二群体中嗜中性粒细胞的步骤，所述生物标记物选自下组：cd49d、cd16、cxcr2、cd34、cd66、cd15、cd71和cd11b。在一些实例中，样品可以从鼠受试者获得。在一些实例中，第一群体可以包含呈cd101-的增殖性嗜中性粒细胞，并且第二群体可以包含呈cd101+的成熟嗜中性粒细胞。在一些实例中，第一群体还可以包含呈cd101-的未成熟嗜中性粒细胞。在一些实例中，该方法可以包括用适应于靶向cd101的试剂检测cd101的表达。在一些实例中，所述方法可包括分离一种或多种所需的嗜中性粒细胞亚型。在这样的实例中，该方法可以包括通过适应于靶向cd101的试剂固定化一种或多种所需的嗜中性粒细胞亚型。在一些实例中，所述方法可进一步包括通过检测一种或多种生物标记物的表达来验证所需的嗜中性粒细胞亚型的步骤，所述生物标记物例如但不限于cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1和cxcr4。在一些实例中，所述方法可包括在从受试者获得细胞群体之前，向受试者施用例如但不限于普乐沙福(plerixafor)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)和/或白介素3(il-3)的药剂。在一些实例中，所需的嗜中性粒细胞亚型可以是原嗜中性粒细胞和/或前嗜中性粒细胞。在一些实例中，该方法可进一步包括用一种或多种选自下组的生长因子扩增原嗜中性粒细胞和/或前嗜中性粒细胞的步骤：白介素6(il-6)、白血病抑制因子(lif)、干细胞因子(scf)、g-csf和il-3。根据本发明的另一个方面，提供了包含增殖性嗜中性粒细胞的组合物。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是cd10-cd101-。根据本发明的另一个方面，提供了包含治疗有效量的增殖性嗜中性粒细胞的组合物用于治疗。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是cd10-cd101-。在一些实例中，所述组合物可用于治疗患者中的免疫缺陷相关疾病和/或病症。根据本发明的另一个方面，提供了一种用于增强受试者的免疫系统和/或维持受试者中的免疫应答的组合物，其包含治疗有效量的增殖性嗜中性粒细胞。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是cd10-cd101-。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以包括原嗜中性粒细胞和/或前嗜中性粒细胞。在一些实例中，原嗜中性粒细胞可以是cd101-cd10-cd16-cd34-cd66b+cd15+cd71+cd49d+cd11b-cxcr2-和/或前嗜中性粒细胞可以是cd101-cd10-cd16-cd34-cd66b+cd15+cd71+cd49d+cd11b+cxcr2-。根据本发明的另一方面，提供了增殖性嗜中性粒细胞在制备用于治疗患者中的免疫缺陷相关疾病和/或病症的药物中的用途。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是cd10-cd101-。根据本发明的另一方面，提供了一种治疗患者中的免疫缺陷相关疾病和/或病症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的增殖性嗜中性粒细胞。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是cd10-cd101-。在一些实例中，所述免疫缺陷相关疾病和/或病症可以与癌症和/或感染相关。在一些实例中，患者可以是免疫受损的。在一些实例中，所述方法可包括每三(3)至五(5)天向患者施用治疗有效量的增殖性嗜中性粒细胞。根据本发明的另一个方面，提供了一种增强患者的免疫系统的方法。在一些实例中，所述方法可以包括步骤(a)获得包含嗜中性粒细胞的细胞群；(b)根据嗜中性粒细胞上的cd10和/或cd101表达从所述细胞群分离增殖性嗜中性粒细胞，其中所述增殖性嗜中性粒细胞是cd10-cd101-；和(c)向患者施用治疗有效量的所述增殖性嗜中性粒细胞。在一些实例中，其中步骤(b)可进一步包括用适应于靶向cd10和/或cd101的试剂检测cd10和/或cd101的表达。在一些实例中，该方法可进一步包括在步骤(c)之前扩增前嗜中性粒细胞的步骤。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以用一种或多种选自白介素6(il-6)、白血病抑制因子(lif)、干细胞因子(scf)、g-csf和il-3的生长因子扩增。在一些实例中，步骤(a)可包括从患者获得包含嗜中性粒细胞的细胞群。在一些实例中，所述细胞群可来自患者的骨髓和/或来自脐带血。根据本发明的另一方面，提供了一种用于诊断或预后患者中的医学病状的方法。在一些实例中，该方法可以包括以下步骤：(a)测试从患者获得的包含嗜中性粒细胞的样品，以检测嗜中性粒细胞上cd10和/或cd101的表达；(b)测量所述样品中增殖性嗜中性粒细胞、未成熟嗜中性粒细胞和/或成熟嗜中性粒细胞的水平，其中增殖性嗜中性粒细胞为cd10-cd101-，未成熟嗜中性粒细胞为cd10-cd101+，和成熟嗜中性粒细胞为cd10+cd101+；和(c)将样品中增殖性嗜中性粒细胞、未成熟嗜中性粒细胞和/或成熟嗜中性粒细胞的水平与对照中的参照水平进行比较，以确定医学病状的存在与否，或预测医学病状的进程。在一些实例中，样品可以是骨髓样品和/或脾样品。在这样的实例中，样品中的增殖性嗜中性粒细胞的水平高于对照中的参照水平可以指示患者具有炎性医学病状。在一些实例中，炎性医学病状可能与自身免疫性疾病、败血症和/或癌症有关。在一些实例中，样品中未成熟嗜中性粒细胞的水平高于对照中的参照水平可指示患者患有医学病状。在一些实例中，未成熟嗜中性粒细胞的水平可与医学病状的进展相关。在一些实例中，样品可以是血液样品或肿瘤样品。在一些实例中，所述医学病状可以是癌症。在一些实例中，癌症可以是胰腺癌。根据本发明的另一个方面，提供了用于检测和/或预测患者中的炎症的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)用于检测嗜中性粒细胞上cd10的表达的试剂和/或用于检测嗜中性粒细胞上cd101的表达的试剂，以测量取自患者的样品中的增殖性嗜中性粒细胞的水平，其中所述增殖性嗜中性粒细胞是cd10-cd101-；和(b)用于比较增殖性嗜中性粒细胞的测量水平的参照水平，其中样品中增殖性嗜中性粒细胞的水平高于参照水平可表明患者患有炎性医学病状。根据本发明的另一个方面，提供了用于诊断和/或预后患者中的癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)用于检测嗜中性粒细胞上cd10的表达的试剂和/或用于检测嗜中性粒细胞上cd101的表达的试剂，以测量取自患者的样品中未成熟嗜中性粒细胞的水平，其中所述未成熟嗜中性粒细胞是cd10-cd101+；和(b)用于比较未成熟嗜中性粒细胞的测量水平的参照水平，其中样品中未成熟嗜中性粒细胞的水平高于参照水平可表明患者患有癌症，和/或其中未成熟嗜中性粒细胞的水平可以与癌症的进展相关。附图简述现在将参照附图仅通过示例的方式描述本发明，附图如下：图1(a)基于通过质谱细胞术的40种不同标记物的表达的人cd45+bm细胞的可视化t-sne图。(b-c)嗜中性粒细胞人工设门为lin-cd15+cd66b+，并被鉴定为增殖性(idu+)和非增殖性(idu-)。idu+和idu-嗜中性粒细胞中标记物的中值表达接着绘制为热图以鉴定增殖性和非增殖性嗜中性粒细胞之间差异表达的标记物。图2(a)人bm嗜中性粒细胞亚群的设门策略，嗜中性粒细胞亚群被定义为前嗜中性粒细胞(preneu)、不成熟的嗜中性粒细胞和成熟嗜中性粒细胞。(b)接下来将嗜中性粒细胞亚群中表面标记物的中值表达绘制为热图(蓝色：低表达；红色：高表达)。(c)基于cd10和cd101的表达，lin-cd15+cd66b+总嗜中性粒细胞可细分为preneu、未成熟的和成熟嗜中性粒细胞。图3(a)在静息状态下preneu和未成熟嗜中性粒细胞主要位于bm中而不在血液中。(b)嗜中性粒细胞亚群在组织之间显示相似的增殖状态。图4将分选的lyz2-gfp+preneubm内转移至野生型接受体中。黑点代表转移后第1天(顶部行)和第2天(底部行)的转移细胞。数据代表五只独立小鼠中的一只。eo-嗜酸性粒细胞，mo-单核细胞。图5质谱细胞术揭示了具有不同表型特征的增殖性嗜中性粒细胞。(a)从manz和boettcher,2014修改的造血作用的层次顺序的示意图。(b)由fucci-(s-g2-m)(#474)小鼠在体内在各种祖细胞和成熟的白细胞群体中增殖性细胞的频率。结果表示为平均值±sd(n＝3)并代表两个独立的实验。腹膜lpm-腹膜大腹腔巨噬细胞；脾rpm-脾红髓巨噬细胞。(c)基于40种不同参数的表达，来自小鼠cd45+bm细胞的idu+(增殖性的)和idu-(非增殖性的)细胞的可视化t-sne图谱。(d)基于(c)中鉴定的簇，计算每种标记物的中值强度并绘制为热图以鉴定各自的免疫细胞群。(e)idu+和idu-嗜中性粒细胞的表面标记物表达(中值强度)的热图，显示差异表达的标记物(黑色箭头)。(c-e)数据代表两个独立实验(n＝3)中的一个(还参见图12)。图6在与car细胞紧密接近的簇中发现的增殖性嗜中性粒细胞前体的鉴定。(a)基于11种标记物的表达，相应地对fucci-(s-g2-m)(#474)小鼠的bmgr1+cd11b+嗜中性粒细胞设门并进行t-sne降维。(b)由蓝色(低表达)到红色(高表达)颜色绘制的fucci-(s-g2-m)(#474)的表达图。(c)由所示标记物的覆盖直方图(中间)和图(右)表示的fucci-(s-g2-m)+(绿色)和fucci-(s-g2-m)-(灰色)簇的差异表达(左)。(d)bm股骨的清理的远端骺(250μm厚的振动切片)的快照显示fucci-(s-g2-m)+细胞(绿色)、嗜中性粒细胞(s100a9，红色)、胶原蛋白(二次谐波产生，灰色)和血管(层粘连蛋白，蓝色)(比例尺＝300μm)。显示了簇的放大视图(右)(比例尺＝20μm)。(e)与fucci-(s-g2-m)-s100a9+细胞(底部，星号)相比较，紧邻cxcl12+基质细胞的fucci-(s-g2-m)+s100a9+细胞(顶部，箭头)的来自3个独立的实验的代表性图像(比例尺＝10μm)。(f)到最接近的car细胞(cxcl12+)或血管(层粘连蛋白+)的距离和平均距离(n＝1893preneu和n＝1509neu，来自3个bm股骨的远端骨骺)。数据反映了三次独立实验的平均值±sem。＊＊，p＜0.01；＊＊＊，p＜0.001；＊＊＊＊，p＜0.0001(单向anova)。(g)比较野生型小鼠、s100a8crecxcr4fl小鼠和cxcr4whim/+小鼠中的bmpreneu。数据代表至少两个实验。结果表示为细胞数的倍数变化±sd(n＝10只小鼠/组)。＊＊，p＜0.01；＊＊＊＊，p＜0.0001(还参见图13)。图7转录组学分析揭示了嗜中性粒细胞发育期间的不同表达特征。(a-g)根据设门策略(a)从三只单独的小鼠中分选bmgmp、preneu、未成熟的neu、成熟的neu和血液neu，并提取rna用于rna-seq分析(参见图14a中的设门策略)。(b)分选的群体的wright-giemsa染色(比例尺＝10μm)。数据代表3次独立的实验。(c)基因表达的pca。(d)使用pearson相关系数产生的相关矩阵，其表示亚群之间基因表达的相似性(低相似性＝红色，高相似性＝黄色)。(e)20％最可变的基因(24098个检测的转录物中的4820个基因)中的亚群之间差异表达的基因的热图。依照分层聚类定义基因簇(1至7)并输出用于基因本体(go)生物过程分析。(f)各种指示的簇中富含的go生物过程术语。(g)在分选的群体中指示的簇相关基因的中值基因表达(log2cpm)。(h)使用fucci-(g0-g1)(#639)/fucci-(s-g2-m)(#474)bm细胞(左)来鉴定细胞周期阶段的设门策略和所示亚群中各阶段的代表性比例(还参见图14h)。(i)嗜中性粒细胞亚群的体外增殖测定的分析。数据表示为数量的倍数变化±sd(n＝3)，并且代表四次独立的实验。＊＊＊＊，p＜0.0001(单向anova)(还参见图14)。图8preneu是定向于嗜中性粒细胞谱系。(a)来自gmp和嗜中性粒细胞和单核细胞亚群的基因表达数据的pca。(b)gmp和bm嗜中性粒细胞亚群(n＝3)中s100a8的相对表达(log2cpm)。(c)遗传细胞命运图谱策略(左)和在所示群体中的重组频率(右)。结果表示为平均值±sd(n＝3)并且代表两个独立的实验。(d)将分选的lyz2-gfp+preneubm内转移至野生型接受体中。顶部行：不同细胞群的鉴定策略。中间行及底部行：黑点代表转移后第1天(中间行)和第2天(底部行)的转移的细胞。数据代表五只独立的小鼠中的一只。(e)单次brdu脉冲后，嗜中性粒细胞亚群中brdu掺入的动力学。数据表示为平均值±sd(每个时间点n≥3)，并且代表两个实验。(f)使用5-fu进行bm细胞群的骨髓损耗。数据表示为平均值±sd(每时间点n≥3)并且代表两个实验(还参见图s15)。图9嗜中性粒细胞发育过程中的功能成熟。(a-b)在gmp和嗜中性粒细胞亚群中评估的编码(a)骨髓发育相关tf和(b)颗粒产生的基因的表达(z-评分标准化)。(c)gmp和嗜中性粒细胞亚群中ros生物合成过程相关的基因。(d)通过使用二氢罗丹明123(dhr)的流式细胞术评估嗜中性粒细胞亚群的ros产生。数据显示为几何平均值±sd(n＝3)，并且代表两个独立的实验。＊＊，p＜0.01(单向anova)。(e)gfp+大肠杆菌的吞噬作用，表示为gfp+细胞的百分比±sd(n＝3)，并且代表两个独立的实验。＊，p<0.05；＊＊＊，p＜0.001(单向anova)。(f)gmp和嗜中性粒细胞亚群中吞噬作用相关的基因表达。(g)趋化性相关基因及其在gmp和嗜中性粒细胞亚群中的相应表达。(h)(顶部)激光诱导的无菌损伤模型的实验装置。(底部)来自延时的最大z投影快照，其显示嗜中性粒细胞亚群向激光灼伤(灰色正方形)迁移(左下)并具有相应的细胞轨迹(右下)。比例尺＝100μm。时间，h：min。数据代表三个独立的实验。图10c/ebpε缺陷损害preneu和下游嗜中性粒细胞群体的发育。(a-b)wt和cebpe-/-小鼠中bm髓样细胞亚群的绝对计数，表示为平均值±sd(n＝5)，并且代表两个独立的实验。(c)(顶部)实验设置和(底部)各种造血细胞由wtcd45.1+或cebpe-/-cd45.2+细胞的贡献百分比，表示为平均值±sd(n＝5)，并且代表两个独立的实验。(d)浸润的皮肤嗜中性粒细胞的绝对计数。(e)(左)显示rpa诱导的渗漏的代表性(n＝3)照片。插图，像素分类：有渗漏，白色；无泄漏，黑色。(右)小鼠耳中总伊文思蓝染料的测量。将两次实验的结果合并，表示为平均值±sem(n＝9-12每组)。＊＊，p<0.001(学生t检验)。(f)wt和cebpe-/-小鼠的血液和腹膜中成熟嗜中性粒细胞的绝对计数。(g)中级clp后24小时血液和腹膜液的细菌cfu定量。结果以平均值±sd表示(n＝4-10每组)，并且代表两个实验。＊＊＊，p＜0.001(学生t检验)。图11未成熟嗜中性粒细胞可通过cd101表达与成熟嗜中性粒细胞区分开来，并与肿瘤进展有关。(a-b)盲肠结扎穿孔(clp)中级败血症时bm(a)和脾(b)中preneu扩增的绝对计数。结果表示为平均值±sem(n＝3-5每个条件)。＊＊＊，p＜0.001(学生t检验)并且代表两个实验。(c-d)在荷瘤小鼠的bm(c)和脾(d)中preneu扩增的绝对计数。合并三次实验的结果，并表示为平均值±sem(n＝15-16每个条件)。＊＊＊＊，p＜0.0001(学生t检验)，代表三个实验。(e)bm、血液和胰腺原位肿瘤中总嗜中性粒细胞(lin-cd115-siglecf-gr1+cd11b+)中的cxcr2表达。数据代表三个独立的实验。(f)bm嗜中性粒细胞亚群中cd101的基因表达(log2cpm)。结果表示为平均值±sd(n＝3)。＊＊＊＊，p＜0.0001(单向anova)。(g)bm、脾和血液中未成熟的(红色)和成熟的neu(橙色)的代表性facs图。直方图代表相应的cxcr2表达。谱系标记物包括：b220、nk1.1、cd90.2、cd115、siglec-f和mhcii。(h-i)存在于初始小鼠和荷瘤小鼠的血液(h)和胰腺(i)中的未成熟的和成熟的neu的绝对数目。数据表示为平均值(n＝15-16每组)。＊＊＊，p＜0.001,＊＊＊＊，p＜0.0001(单向anova)(还参见图16)。(j)显示血液和胰腺未成熟嗜中性粒细胞之间的相关性的图。从三个独立实验汇集数据。通过pearson相关性检验测定显著性。(k-m)基于中值肿瘤重量将荷瘤小鼠分为两组。(k-l)初始小鼠和携带低或高肿瘤负荷的小鼠中血液和胰腺的未成熟和成熟neu的代表性facs图。(m)将携带原位肿瘤的小鼠的胰腺质量分成两组：顶部50％的胰腺质量被认为是高肿瘤负荷，而底部50％的胰腺质量被认为是低肿瘤负荷。合并三次独立实验的结果。(n)携带低或高肿瘤负荷的小鼠之间的血液未成熟和成熟neu的绝对数量。(o)显示荷瘤小鼠的血液未成熟neu和胰腺重量之间的相关性的图。从三个独立的实验汇集数据。通过pearson相关性检验确定显著性。图12(与图5相关)：质谱细胞术揭示了具有独特的表型特征的增殖性髓样细胞。(a)idu+和idu-嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和ly6chi单核细胞的表面标记物表达水平。箭头指示差异表达的表面标记物。图13(与图6相关)：通过其增殖活性鉴定过渡期的前单核细胞(tpmo)。(a)对fucci-(s-g2-m)(#474)小鼠的bmly6chi单核细胞设门，并基于七种标记物的表达进行t-sne降维。(b)由蓝色(低表达)到红色(高表达)颜色绘制的fucci-(s-g2-m)(#474)的表达水平图。(c)通过相对于cd11b的cxcr4作图(中间)和所示标记物的覆盖直方图(右)表示的fucci-(s-g2-m)+(绿色)fucci-(s-g2-m)-(灰色)簇的差异表达水平(左)。图14(与图7相关)：转录组学分析揭示了嗜中性粒细胞发育期间的不同表达特征。(a)bmgmp和嗜中性粒细胞亚群(preneu、未成熟的和成熟的neu)的设门策略。(b)脾嗜中性粒细胞亚群(preneu、未成熟的和成熟的neu)的设门策略。(c-d)(c)bm或(d)脾嗜中性粒细胞亚群的绝对计数。(e)bm和脾嗜中性粒细胞亚群之间的相对表面标记物表达水平的热图。(f)火山图描绘了差异表达的基因的数目以及gmp与preneu之间、preneu与未成熟的neu之间、未成熟的与成熟的neu之间以及成熟的与血液neu之间的log2倍数变化相对于-log10fdr。(g)gmp和嗜中性粒细胞亚群中的细胞周期相关基因表达。(h)使用fucci-(g0-g1)(#639)/fucci-(s-g2-m)(#474)bm细胞来鉴定细胞周期阶段的设门策略(左)和(i)在所示亚群中各阶段的代表性比例(右)。(j)分选的bmgmp和嗜中性粒细胞亚群用指定细胞因子补充的集落形成测定。结果代表三个独立的实验。比例尺＝50μm。图15(与图8相关)：preneu是定向于嗜中性粒细胞谱系。(a)使用最佳叶排序(olo)算法计算确定发育路径，其以gmp开始并以作为最成熟群体的血液neu结束。(b)所示亚群中的s100a8的基因表达水平(log2cpm)。(c)所示亚群中lyz2的基因表达水平(log2cpm)。(d)在所指示的亚群中命运图谱重组频率。结果表示为平均值±sd(n＝3)，并且代表两个独立的实验。(e-k)健康人骨髓的无监督分析。(e)人bm的t-sne显像，其显示样品中各种鉴定的免疫亚群。(f)总嗜中性粒细胞中的idu掺入的代表图和(g)idu+和idu-嗜中性粒细胞之间差异表达的标记物(由黑色箭头指示)。(h)人bm嗜中性粒细胞亚群的设门策略。(i)嗜中性粒细胞亚群的wright-giemsa染色(比例尺＝10μm)。(j)健康人全血中嗜中性粒细胞亚群的代表性双轴图。(k)人bm嗜中性粒细胞亚群的表面标记物表达水平。数据表示为中值强度。图16(与图11相关)：未成熟嗜中性粒细胞在炎症期间是可移动且活动的。(a-b)在clp诱导的败血症后2周(a)和原位肿瘤移植(b)模型后3周内的bm和脾preneu扩增的代表性facs图。(c)g-csfcx刺激后24小时未成熟的和成熟的neu的代表性facs图。(d)g-csfcx施用后未成熟的和成熟的neu的运动动力学。结果表示为平均值±sd(每个时间点n＝4)。＊，p<0.05；＊＊＊＊，p＜0.0001(单向anova)，并且代表两个独立的实验。(e)(顶部)激光诱导的无菌损伤模型的实验装置。(底部)来自延时的最大z投影快照，其显示嗜中性粒细胞亚群向激光灼伤(灰色正方形)迁移(左下)并具有相应的细胞轨迹(右下)。比例尺＝100μm。时间，h：min。数据代表三个独立的实验。(f-g)图显示了血液(f)成熟neu或(g)ly6chi单核细胞与荷瘤小鼠胰腺重量之间的相关性。从三个独立实验汇集数据。通过pearson相关性检验测定显著性。图17小鼠嗜中性粒细胞前体的增殖潜力。(a)使用小鼠骨髓的流式细胞术分析的嗜中性粒细胞前体和亚群的代表性设门策略。(b)6天内所示嗜中性粒细胞前体的集落形成单位(cfu)测定。黑色比例尺＝20μm。白色比例尺＝100μm。数据代表三个独立实验。(c)4天内所示嗜中性粒细胞前体的增殖测定。数据表示为平均值(n＝3)并且代表三个独立的实验。＊＊＝p＜0.01(mann-whitney检验)。(d)分选的gfp+proneu#2的体内转移。根据(a)中所示的设门策略分选细胞。然后将分选的细胞股骨内转移并如所示的随时间追踪。数据代表至少三个独立实验。图18人中相应的嗜中性粒细胞前体的鉴定。使用人(a)脐带血、(b)胎儿骨髓和(c)成人骨髓的流式细胞术分析的嗜中性粒细胞前体和亚群的代表性设门策略。所有样品以相同的方式处理和染色。将样品在1xrbc裂解缓冲液(ebioscience)中裂解5分钟，并用人fc阻断剂预孵育20分钟，然后用荧光团偶联的抗体染色。数据代表(a)＞10个供体，(b)1个供体，(c)3个供体。图19preneus的体内增殖和分化潜力。(a)在3天内将分选的gfp+preneus体内转移到野生型小鼠中。根据图17所示的设门策略分选细胞。然后将分选的细胞股骨内转移，并如所示的随时间跟踪。数据代表至少三个独立的实验。图20嗜中性粒细胞前体的转录调节。(a)由所示亚群表达的前10个可变的基因。数据获自281个单细胞rna-seq(smart-seq2)并使用seraut分析。(b)已知的对嗜中性粒细胞/单核细胞命运决定关键的转录因子的小提琴图。数值以原始umi计数表示。(c)已知嗜中性粒细胞相关基因及其按比例的表达值的热图。以浅色字体突出显示的基因(即gfi1、far2、per3、camp、s100a8、s100a9、ngp、ltf和wfdc21)表示其相应嗜中性粒细胞前体群体的专有基因和转录因子。发明详述现在将参考附图描述本公开的示例。本文所用的术语仅是为了描述示例的目的，而非限制本公开的范围。另外，除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。嗜中性粒细胞是人外周血中最丰富的免疫细胞类型，并且它们在无菌性侵害和微生物侵害期间充当第一反应者。它们引起强大的效应子功能以消除外来威胁并在组织重塑中起关键作用。嗜中性粒细胞是短寿命的，估计在人类中半衰期为19小时。因此，由于嗜中性粒细胞的产生和迁移中的损害导致嗜中性粒细胞减少症和威胁生命的疾患，必须不断地补充嗜中性粒细胞。历史上，利用组织学染色和电子显微镜，已将嗜中性粒细胞的形成基于大小、细胞核形态和胞质溶胶着色定义了各个阶段。成熟后，嗜中性粒细胞通过cxcr4趋化因子受体信号传导而保留在骨髓中，而cxcr2信号传导驱动它们释放进入循环。在炎症期间，增加量的粒细胞集落刺激因子(g-csf)可以增强嗜中性粒细胞从骨髓的动员，这通过降低其释放阈值和增加动员信号(即cxcl1)的量。据信，嗜中性粒细胞由同质群体组成。然而，由于越来越多的嗜中性粒细胞异质性的报道，这种观点正在快速发展。值得注意的是，本领域的研究主要集中在循环嗜中性粒细胞的表型而非其个体发育。因此，在早期成熟阶段的功能性异质群体仍然是不确定的。髓系细胞的发育开始于共同髓系祖细胞(cmp)，其产生粒细胞-单核细胞祖细胞(gmp)。gmp也显示产生共同dc祖细胞(cdp)和共同单核细胞祖细胞(cmop)，它们分别只形成dc或单核细胞。然而，从gmp到功能成熟的嗜中性粒细胞的发育轨迹仍然没有被充分确定。为了解决这个问题，在本公开中利用多参数分析技术来研究稳定和炎症状态中的嗜中性粒细胞亚群的分化途径和功能性质。定义如本文所用的，术语“约”可以指所述值的+/-5％，或所述值的+/-4％，或所述值的+/-3％，或所述值的+/-2％，或所述值的+/-1％，或所述值的+/-0.5％。在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”或其变化形式如“包括”(comprises)或“包括”(comprising)将理解为暗示包括所述的整数或整数的组，但不排除任何其它整数或整数的组。在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”或其变化形式如“包括”(includes)或“包括”(including)将理解为暗示包括所述的整数或整数的组，但不排除任何其它整数或整数的组。生物标记物或其组分包括但不限于多肽(例如细胞表面蛋白)和多核苷酸(例如dna和rna)。如本文所用的，术语“处理”、“治疗”和“疗法”及其同义词是指治疗性处理和防护性或预防性措施，其中目的是预防、减缓(减轻)或治愈医学病状，其包括但不限于疾病(例如自身免疫性疾病或癌症)、症状和病症。医学病状还包括身体对疾病或病症例如炎症的反应。需要这种治疗的那些患者包括已经患有医学病状的那些患者以及易于患有医学病状的那些患者或其医学病状待预防的那些患者。如本文所用，术语化合物的“治疗有效的量”将是能够预防或至少减缓(减轻)医学病状(例如自身免疫性疾病、炎症和癌症)的活性药剂的量。本公开的化合物、组合物和制剂的剂量和施用可由临床药理学或药代动力学领域的普通技术人员确定。参见，例如，mordentiandrescigno,(1992)pharmaceuticalresearch.9:17-25；morenti等人,(1991)pharmaceuticalresearch.8:1351-1359；和mordentiandchappell,“theuseofinterspeciesscalingintoxicokinetics”intoxicokineticsandnewdrugdevelopment,yacobi等人(编辑)(pergamonpress:ny,1989),第42-96页。治疗上使用的本公开的活性药剂的有效量将取决于例如治疗对象、施用途径和患者的状况。因此，治疗师可能需要滴定剂量并根据需要改变给药途径以获得最佳治疗效果。如本文说明书中所用的，术语“受试者”包括患者和非患者。术语“患者”指患有或可能患有医学病状的个体，而“非患者”指未患有或可能未患有医学病状的个体。“非患者”包括健康个体。术语“受试者”包括人和动物。动物包括鼠类等。“鼠类”指来自鼠科的任何哺乳动物，如小鼠、大鼠等。如本文说明书中所用的，本公开中用于检测生物标记物的试剂是指发挥功能去检测本公开中的生物标记物的存在/不存在和/或其表达或水平的任何化合物、分子和/或系统。这样的试剂能够直接或间接地检测和/或结合生物标记物。在本公开中，可能需要另外的部分以增强生物标记物的检测，例如，通过/经由放大光学衍射。试剂和另外的部分的实例包括但不限于蛋白质(例如抗原结合蛋白，如抗体或其片段，酶，如辣根过氧化物和碱性磷酸酶等)，多核苷酸(例如适体)，和小分子(例如金属纳米颗粒)。如本文所用的，“表达”指本公开中生物标记物的基因型以及表型表达。“生物标记物”指分子，例如蛋白质、碳水化合物结构、糖脂、糖蛋白(包括细胞表面糖蛋白)或基因(或编码该基因的核酸)，其在源自受试者(如哺乳动物组织)的细胞(或样品)之中或之上的表达可通过本领域的标准方法(以及本文公开的那些)检测。在一些实例中，生物标记物可以是可充当所关注的靶标的识别物(即标记物)的任何分子。因此，在一些实例中，生物标记物可以是细胞表面糖蛋白、转录因子等。在一些实例中，生物标记物可以是细胞表面糖蛋白，例如但不限于cd标记物。本文所用的“cd标记物”指与细胞相关的生物标记物，如抗体的组(如表1和2中所示例的)所识别的，其可用于鉴定、检测、选择、分选和/或分离细胞类型、分化阶段和细胞的活性状态。在一些实例中，当生物标记物是细胞表面标记物或糖蛋白时，可以根据公知常识中已知的可接受的表示法来表示标记物的表达。例如，对于细胞表面糖蛋白cd10，cd10+指细胞阳性表达cd10，cd10-指细胞不表达可检测的cd10，cd10lo指细胞表达低cd10，cd10int指细胞表达中度的cd10，cd10hi指细胞表达高cd10。本公开提供了抗原结合蛋白，包括但不限于，多克隆和/或单克隆抗体及其片段，以及其免疫结合等同物，其能够特异性地结合靶标(例如多肽靶标)及其片段。因此，这样的抗原结合蛋白包括，例如但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、fab片段和fab表达文库。如本文所用的，“抗体”指包含基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一个或多个多肽的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们又分别定义免疫球蛋白种类igg、igm、iga、igd和ige。抗体可以是对特定抗原特异性的。“单克隆抗体”指以下抗体，其仅具有一种能够与特定抗原发生免疫反应的抗体联合位点的抗体种类。因此，单克隆抗体通常对与其免疫反应的任何抗原都表现出单一的结合亲和力。因此，单克隆抗体可以含有具有多个抗体联合位点的抗体分子，每个抗体联合位点对不同的抗原具有免疫特异性；例如双特异性(嵌合)单克隆抗体。如本文说明书中所用的，术语“固定化的”指直接或间接结合到例如装置的表面，包括通过共价结合或非共价结合(例如氢键、离子相互作用、范德华力或疏水相互作用)的附接。如本文的说明书中所使用的，嗜中性粒细胞包括原嗜中性粒细胞(或也称为“proneu”)、前嗜中性粒细胞(或也称为“preneu”)、未成熟嗜中性粒细胞和成熟嗜中性粒细胞。本公开的方法包括但不限于体内、体外和离体方法。在整个本公开中，可以以范围形式来公开某些示例。应当理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对所公开范围的限制。因此，范围的描述应被认为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围如1至6的描述应被认为已经具体公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。范围不限于整数，并且可以包括十进制测量。这与范围的宽度无关。本公开的实例本公开寻求提供将嗜中性粒细胞分类/表征为嗜中性粒细胞亚型并分开和/或分离/富集嗜中性粒细胞亚型的方法。本公开还试图提供与嗜中性粒细胞亚型相关的试剂盒以及治疗、诊断和预后方法。根据本发明的一个方面，提供了表征和/或分开嗜中性粒细胞的方法，该方法包括根据cd101在嗜中性粒细胞上的表达表征嗜中性粒细胞和/或将嗜中性粒细胞分开为包含增殖性嗜中性粒细胞的第一嗜中性粒细胞群和包含成熟嗜中性粒细胞的第二嗜中性粒细胞群。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是原嗜中性粒细胞和前嗜中性粒细胞。如本文所用的，术语“增殖性”指细胞分裂并因此产生更多相同或更加分化的类型的细胞的能力。因此，增殖性嗜中性粒细胞指已定向为嗜中性粒细胞谱系但仍保留其分裂和产生更多相同细胞(即，更多原嗜中性粒细胞和/或前嗜中性粒细胞)或更加分化的类型(即，未成熟嗜中性粒细胞和/或成熟嗜中性粒细胞)的能力的造血细胞。在一些实例中，第一群体表达cd101-，而第二群体表达cd101+。如实验部分中所示，当嗜中性粒细胞是人嗜中性粒细胞(比如来自从人受试者获得的细胞群的嗜中性粒细胞)时，该方法可进一步包括根据cd10在嗜中性粒细胞上的表达将嗜中性粒细胞表征或分开成嗜中性粒细胞亚型，其中包含增殖性嗜中性粒细胞的第一群体是cd10-cd101-，而包含成熟嗜中性粒细胞的第二群体是cd10+cd101+。同时，在人类中，第二嗜中性粒细胞群体还包含未成熟嗜中性粒细胞。在人类中，未成熟嗜中性粒细胞是cd10-cd101+。本公开的发明人惊讶地发现了能够在适宜的条件下增殖的嗜中性粒细胞的两种亚型。这些增殖性嗜中性粒细胞在本公开中称为原嗜中性粒细胞(也称为“proneu”)和前嗜中性粒细胞(也称为“preneu”)。因此，在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞包括原嗜中性粒细胞和前嗜中性粒细胞。在一些实例中，(人)原嗜中性粒细胞和/或前嗜中性粒细胞是cd10–cd101–。因此，本文所描述的方法可进一步包括将增殖性嗜中性粒细胞(或原嗜中性粒细胞和/或前嗜中性粒细胞)表征为cd10–cd101–。如在实验部分中所例示的，原嗜中性粒细胞可以通过它们的增殖能力以及它们的生物标记物的表达来表征，所述生物标记物例如但不限于cd101、cd10、cd16、cd34、cd66b、cd15、cd71、cd49d、cd11b、cxcr2等。在一些实例中，原嗜中性粒细胞可以表达一种或多种生物标记物，例如但不限于cd101-、cd10-、cd16-、cd34-、cd66b+、cd15+、cd71+、cd49d+、cd11b-、cxcr2-等。在一些实例中，原嗜中性粒细胞可以表达cd34-cd66b+cd15+cd71+cd4d+cd101-cd11b-或以其为特征。可表征原嗜中性粒细胞的其它生物标记物包括在本公开的实验部分中讨论的任何其它生物标记物。因此，在一些实例中，所述方法可以进一步包括根据一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离原嗜中性粒细胞(即proneu)，所述生物标记物例如但不限于cd101、cd10、cd16、cd34、cd66b、cd15、cd71、cd49d、cd11b、cxcr2等。在一些实例中，该方法可进一步包括基于原嗜中性粒细胞的cd101-、cd10-、cd16-、cd34-、cd66b+、cd15+、cd71+、cd49d+、cd11b-、cxcr2-等中的一种或多种的表达来表征和/或分离原嗜中性粒细胞。在一些实例中，本公开的实验部分中使用的其他生物标记物可以包括在如本文所述的方法中。前嗜中性粒细胞也可以通过它们的增殖能力以及它们的生物标记物的表达来表征，所述生物标记物例如但不限于cd101、cd10、cd16、cd34、cd66b、cd15、cd71、cd49d、cd11b、cxcr2等。在一些实例中，前嗜中性粒细胞可以表达一种或多种生物标记物，例如但不限于cd101-、cd10-、cd16-、cd34-、cd66b+、cd15+、cd71+、cd49d+、cd11b+、cxcr2-等。在一些实例中，前嗜中性粒细胞可以表达cd66b+cd15+cd71+cd4d+cd101-cd11b+或以其为特征。可表征前嗜中性粒细胞的其它生物标记物包括在本公开的实验部分中讨论的任何其它生物标记物。因此，在一些实例中，该方法可进一步包括根据一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离前嗜中性粒细胞，所述生物标记物例如但不限于cd101、cd10、cd16、cd34、cd66b、cd15、cd71、cd49d、cd11b、cxcr2等。在一些实例中，该方法可进一步包括基于前嗜中性粒细胞的一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离前嗜中性粒细胞，所述生物标记物的表达例如但不限于cd101-、cd10-、cd16-、cd34-、cd66b+、cd15+、cd71+、cd49d+、cd11b+、cxcr2-等。在一些实例中，本公开的实验部分中使用的其它生物标记物可以包括在如本文所述的方法中。在一些实例中，可以基于转录因子(或基因)的表达来表征和/或分离增殖性嗜中性粒细胞(比如原嗜中性粒细胞和前嗜中性粒细胞)，所述转录因子(或基因)例如但不限于gfi1、far2、per3、camp、s100a8、s100a9、ngp、ltf、wfdc21等。在一些实例中，可用于区分原嗜中性粒细胞和/或前嗜中性粒细胞与未成熟嗜中性粒细胞和/或成熟嗜中性粒细胞的转录因子(或基因)包括但不限于，与细胞周期和/或颗粒(如初级颗粒)相关的转录因子(或基因)。与细胞周期和/或颗粒(如初级颗粒)相关的转录因子(或基因)的实例包括但不限于如本文图20a中公开的转录因子和/或基因。在一些实例中，转录因子(或基因)可以包括但不限于elane、ms4a3、mpo、srgn、ctsg、prtn3、s100a9、lcn2、cd177、camp、ltf、s100a8、chil3、ngp、anxa1、hmgn2、arhgdib、fcnb、actb、lyz2、lgals3、psap、ftl1、ly6c2等。在一些实例中，转录因子(或基因)可包括但不限于elane、mpo、srgn、ctsg、prtn3等。在一些实例中，未成熟的和/或成熟嗜中性粒细胞可以基于它们的与末端粒细胞生成、嗜中性粒细胞效应功能相关的转录因子的表达来表征和/或分离，所述嗜中性粒细胞效应功能例如但不限于活性氧类(ros)的产生、嗜中性粒细胞颗粒的产生、吞噬作用、趋化性等。例如，成熟嗜中性粒细胞可以表达转录因子，例如但不限于cd101、cebpd、spi1(pu.1)，图9中所述的转录因子等。在一些实例中，成熟嗜中性粒细胞可基于其转录因子(或基因)诸如但不限于cd101的表达来表征和/或分离。在一些实例中，成熟嗜中性粒细胞可以基于其与ros生物合成过程相关的转录因子的表达来表征和/或分离，所述转录因子例如但不限于akt1、tlr4、foxo3、tlr2、hdac4、ptk2b、stat3、itgb2、cybb、klf2、tlr5、ptgs2、slc25a33、il1b、clu等。在一些实例中，未成熟的和/或成熟嗜中性粒细胞可基于其与三级明胶酶颗粒相关的转录因子的表达来表征和/或分离，所述转录因子例如但不限于mmp25、itgam、mmp9、mmp8、cfp、adam8、slc11a1等。在一些实例中，成熟嗜中性粒细胞可以基于其与吞噬作用相关的转录因子的表达来表征和/或分离，所述转录因子例如但不限于syk、cdc42se1、cd300a、fgr、sirpa、fcgr3、gsn、nckap1l、dock2、dnm2、rab7、hck、abr、siglece、pip5k1c、slc11a1、atg7、fcer1g、camk1d、abca1、coro1a等。在一些实例中，成熟嗜中性粒细胞可以基于其与趋化性相关的转录因子的表达来表征和/或分离，所述转录因子例如但不限于lyst、ptk2b、trem1、sema4d、pip5k1c、lgals3、arrb2、cxcr2、ccr1、c5ar1、prkcd、nckap1l、dock2、bin2、syk、cmtm6、rac2、itgb2、tnfsf14、alcam、itgb3、gpsm3、l1cam、ccrl2、pla2g7、amica1、ccl6、retnlg、fpr1、ager、cxcr3、ccl3、ccl4等。在人类中，未成熟嗜中性粒细胞可以通过一种或多种生物标记物的表达来表征，例如但不限于cd101、cd10、cd16、cd34、cd66b、cd15、cd71、cd49d、cd11b、cxcr2等。在一些实例中，未成熟嗜中性粒细胞可以表达一种或多种生物标记物，例如但不限于cd101+、cd10-、cd16-、cd34-、cd66b+、cd15+、cd71-、cd49dlo、cd11b+、cxcr2-等。可以表征未成熟嗜中性粒细胞的其它生物标记物包括在本公开的实验部分中讨论的任何其它生物标记物。因此，在一些实例中，该方法可进一步包括根据一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离未成熟嗜中性粒细胞，所述生物标记物例如但不限于cd101、cd10、cd16、cd34、cd66b、cd15、cd71、cd49d、cd11b、cxcr2等。在一些实例中，该方法可以进一步包括基于未成熟嗜中性粒细胞的一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离未成熟嗜中性粒细胞，所述生物标记物的表达例如但不限于cd101+、cd10-、cd16-、cd34-、cd66b+、cd15+、cd71-、cd49dlo、cd11b+、cxcr2-等。在一些实例中，本公开的实验部分中使用的其它生物标记物可以包括在如本文所述的方法中。在人类中，成熟嗜中性粒细胞可以通过一种或多种生物标记物的表达来表征，例如但不限于cd101、cd10、cd16、cd34、cd66b、cd15、cd71、cd49d、cd11b、cxcr2等。在一些实例中，成熟嗜中性粒细胞可以表达一种或多种生物标记物，例如但不限于cd101+、cd10+、cd16+、cd34-、cd66b+、cd15+、cd71-、cd49dlo、cd11b+、cxcr2+等。可表征成熟嗜中性粒细胞的其它生物标记物包括本公开的实验部分中讨论的任何其它生物标记物。因此，在一些实例中，该方法可进一步包括根据一种或多种生物标记的表达来表征和/或分离成熟嗜中性粒细胞，所述生物标记物例如但不限于cd101、cd10、cd16、cd34、cd66b、cd15、cd71、cd49d、cd11b、cxcr2等。在一些实例中，该方法可进一步包括基于成熟嗜中性粒细胞的一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离成熟嗜中性粒细胞，所述生物标记物的表达例如但不限于cd101+、cd10+、cd16+、cd34-、cd66b+、cd15+、cd71-、cd49dlo、cd11b+、cxcr2+等。在一些实例中，本公开的实验部分中使用的其它生物标记物可以包括在如本文所述的方法中。如实验部分所示，当嗜中性粒细胞是鼠嗜中性粒细胞(例如来自从鼠受试者获得的细胞群的嗜中性粒细胞)时，该方法可进一步包括检测ckit在嗜中性粒细胞上的表达并根据ckit在嗜中性粒细胞上的表达将嗜中性粒细胞表征为嗜中性粒细胞亚型，其中包含增殖性嗜中性粒细胞的第一群体是ckithicd101–或ckitintcd101–或ckitlocd101–且包含成熟嗜中性粒细胞的第二群体是ckit–cd101+(即，ckit(阴性)cd101+)，同时，在鼠中，第一嗜中性粒细胞群还包含未成熟嗜中性粒细胞。在啮齿动物(例如鼠或小鼠)中，未成熟嗜中性粒细胞是ckitlocd101–。在鼠类中，原嗜中性粒细胞可以是ckithicd101–，而前嗜中性粒细胞可以是ckitlocd101–或ckitintcd101–。因此，本文所述的方法可进一步包括将增殖性嗜中性粒细胞(或原嗜中性粒细胞和/或前嗜中性粒细胞)表征和/或分开为ckithicd101–、ckitintcd101–或ckitlocd101–。如在实验部分中所示例的，(鼠)原嗜中性粒细胞可以通过它们增殖的能力以及它们的生物标记物的表达来表征，所述生物标记物例如但不限于cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1、cxcr4等。在一些实例中，原嗜中性粒细胞可表达一种或多种生物标记物，例如但不限于cd101-、ckithi、ly6c+、cd106+、siglecf-、cd115-、cd205-、cd11blo、gr1lo、cxcr4hi等。在一些实例中，原嗜中性粒细胞可由ckithily6c+cd106+cd115-cd205-cd11blogr1lo表征。可表征原嗜中性粒细胞的其它生物标记物包括在本公开的实验部分中讨论的任何其它生物标记物。因此，在一些实例中，所述方法可进一步包括根据一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离原嗜中性粒细胞(即proneu)，所述生物标记物例如但不限于cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1、cxcr4等。在一些实例中，该方法可进一步包括基于原嗜中性粒细胞的cd101-、ckithi、ly6c+、cd106+、siglecf-、cd115-、cd205-、cd11blo、gr1lo、cxcr4hi等中一种或多种的表达来表征和/或分离原嗜中性粒细胞。在一些实例中，本公开的实验部分中使用的其它生物标记物可以包括在如本文所述的方法中。在一些实例中，(鼠)前嗜中性粒细胞也可通过它们的增殖能力以及它们的生物标记物的表达来表征，所述生物标记物例如但不限于cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1、cxcr4等。在一些实例中，前嗜中性粒细胞可表达一种或多种生物标记物，例如但不限于cd101-、ckitlo或ckitint、ly6c+、cd106++、siglecf-、cd115-、cd205+、cd11bhi、gr1hi、cxcr4hi等。在一些实例中，前嗜中性粒细胞可由ckitloly6c+siglecf-cd115-cd205+cd11bhigr1hicxcr4hi表征。可表征前嗜中性粒细胞的其它生物标记物包括在本公开的实验部分中讨论的任何其它生物标记物。因此，在一些实例中，该方法可进一步包括根据一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离前嗜中性粒细胞，所述生物标记物例如但不限于cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1、cxcr4等。在一些实例中，该方法可进一步包括基于前嗜中性粒细胞的一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离前嗜中性粒细胞，所述生物标记物例如但不限于cd101-、ckitlo或ckitint、ly6c+、cd106++、siglecf-、cd115-、cd205+、cd11bhi、gr1hi、cxcr4hi等。在一些实例中，本公开的实验部分中使用的其它生物标记物可以包括在如本文所述的方法中。在一些实例中，(鼠)未成熟嗜中性粒细胞可通过一种或多种生物标记物的表达来表征，所述生物标记物例如但不限于cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1、cxcr4等。在一些实例中，未成熟嗜中性粒细胞可表达一种或多种生物标记物，例如但不限于cd101-、ckitlo或ckitint、ly6c+、cd106+、siglecf-、cd115-、cd205+、cd11bhi、gr1hi、cxcr4lo等。可以表征未成熟嗜中性粒细胞的其它生物标记物包括在本公开的实验部分中讨论的任何其它生物标记物。因此，在一些实例中，所述方法可进一步包括根据一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离未成熟嗜中性粒细胞，所述生物标记物例如但不限于cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1、cxcr4等。在一些实例中，该方法可进一步包括基于未成熟嗜中性粒细胞的一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离未成熟嗜中性粒细胞，所述生物标记物的表达例如但不限于cd101-、ckitlo、ly6c+、cd106+、siglecf-、cd115-、cd205+、cd11bhi、gr1hi、cxcr4lo等。在一些实例中，本公开的实验部分中使用的其它生物标记物可以包括在如本文所述的方法中。在一些实例中，(鼠)成熟嗜中性粒细胞可通过一种或多种生物标记物的表达来表征，所述生物标记物例如但不限于cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1、cxcr4等。在一些实例中，成熟嗜中性粒细胞可表达一种或多种生物标记物，例如但不限于cd101+、ckit-、ly6c+、cd106lo、siglecf-、cd115-、cd205+、cd11bhi、gr1hi、cxcr4lo等。可表征和/或分离成熟嗜中性粒细胞的其它生物标记物包括本公开的实验部分中讨论的任何其它生物标记物。因此，在一些实例中，该方法可进一步包括根据一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离成熟嗜中性粒细胞，所述生物标记物例如但不限于cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1、cxcr4等。在一些实例中，该方法可进一步包括基于成熟嗜中性粒细胞的一种或多种生物标记物的表达来表征和/或分离成熟嗜中性粒细胞，所述生物标记物的表达例如但不限于cd101+、ckit-、ly6c-、cd106lo、siglecf-、cd115-、cd205+、cd11bhi、gr1hi、cxcr4lo等。在一些实例中，本公开的实验部分中使用的其它生物标记物可以包括在如本文所述的方法中。根据本公开的另一个方面，提供了用于分开嗜中性粒细胞的试剂盒。在一些实例中，该试剂盒可以包含用于检测嗜中性粒细胞上cd101的表达的试剂。在一些实例中，该试剂盒可进一步包括分离器，用于根据嗜中性粒细胞上cd101的表达分离包含增殖性嗜中性粒细胞的第一群体和包含成熟嗜中性粒细胞的第二群体。在一些实例中，第一群体可以表达cd101-并且第二群体可以表达cd101+。在一些实例中，试剂盒可用于分开人嗜中性粒细胞，并且试剂盒可进一步包含用于检测人嗜中性粒细胞上cd10表达的试剂。在一些实例中，分离器可适应于根据嗜中性粒细胞上cd10的表达分开嗜中性粒细胞，其中第一群体可包含增殖性嗜中性粒细胞，其可为cd10-cd101-，而第二群体可包含成熟嗜中性粒细胞，其可为cd10+cd101+。在一些实例中，第二群体还可以包含未成熟嗜中性粒细胞，其可为cd10-cd101+。在一些实例中，检测cd10的表达的试剂可为适应于靶向cd10的抗体。在一些实例中，用于检测cd101表达的试剂可以是适应于靶向cd101的抗体。在一些实例中，所述试剂盒可以进一步包含用于检测嗜中性粒细胞上一种或多种生物标记物表达的试剂，所述生物标记物选自下组：cd49d、cd16、cxcr2、cd34、cd66、cd15、cd71和cd11b。因此，在一些实例中，分离器还可以适应于根据嗜中性粒细胞上cd49d、cd16、cxcr2、cd34、cd66、cd15、cd71和cd11b中的一种或多种的表达分开嗜中性粒细胞。在这样的实例中，各种嗜中性粒细胞亚型(即，增殖性嗜中性粒细胞，包括原嗜中性粒细胞和前嗜中性粒细胞，未成熟嗜中性粒细胞和成熟嗜中性粒细胞)的特征可以如上文和实验部分中所述。在一些实例中，试剂盒可以用于分开鼠嗜中性粒细胞。在这类实例中，分离器可进一步适应于根据cd101和/或ckit的表达分开嗜中性粒细胞。在一些实例中，第一群体可以包括增殖性嗜中性粒细胞，其可以是ckithicd101–、ckitintcd101–或ckitlocd101–中的任何一种，而第二群体可以包括成熟嗜中性粒细胞，其可以是ckit-cd101+。在一些实例中，第一群体还包含未成熟嗜中性粒细胞，其可以表达ckitlocd101+。在一些实例中，用于检测cd101和/或ckit表达的试剂可以是适应于靶向cd101和/或ckit的抗体。在一些实例中，试剂盒可进一步包含用于检测选自cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1和cxcr4的一种或多种生物标记物在嗜中性粒细胞上的表达的试剂。在这样的实例中，分离器可适应于根据嗜中性粒细胞上cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1和/或cxcr4的表达分开嗜中性粒细胞。在这样的实例中，各种嗜中性粒细胞亚型(即，增殖性嗜中性粒细胞，包括原嗜中性粒细胞和前嗜中性粒细胞，未成熟嗜中性粒细胞和成熟嗜中性粒细胞)的特征可以如上文和实验部分中所述。根据本公开的另一个方面，提供了分离和/或富集期望的嗜中性粒细胞的方法。在一些实例中，该方法可以包括：根据嗜中性粒细胞上cd101的表达将样品中的嗜中性粒细胞分类为包含增殖性嗜中性粒细胞的第一群体以及包含成熟嗜中性粒细胞的第二群体。在一些实例中，所述方法还可包括从第一群体和/或第二群体分离和/或富集一种或多种嗜中性粒细胞。在一些实例中，样品可以从人类受试者获得。在这样的实例中，该方法可进一步包括根据嗜中性粒细胞上cd10的表达分类嗜中性粒细胞。在一些实例中，第一群体可以包含增殖性嗜中性粒细胞并且可以是cd10–cd101–，而第二群体可以包含成熟嗜中性粒细胞并且可以是cd10+cd101+。在一些实例中，第二群体还可以包含未成熟嗜中性粒细胞并且是cd10–cd101+。在一些实例中，该方法可包括用适应于靶向cd10和/或cd101的试剂检测cd10和/或cd101的表达。在一些实例中，分离一种或多种嗜中性粒细胞可包括通过适应于靶向cd10和/或cd101的试剂固定化所述一种或多种嗜中性粒细胞。在一些实例中，所述方法可进一步包括通过检测一种或多种生物标记物的表达来验证第一和/或第二群中嗜中性粒细胞的步骤，所述生物标记物选自cd49d、cd16、cxcr2、cd34、cd66、cd15、cd71和cd11b。在这样的实例中，各种嗜中性粒细胞亚型(即，增殖性嗜中性粒细胞，包括原嗜中性粒细胞和前嗜中性粒细胞，未成熟嗜中性粒细胞和成熟嗜中性粒细胞)的特征可以如上文和实验部分中所述。在一些实例中，样品可以从鼠受试者获得，并且其中包含增殖性嗜中性粒细胞的第一群体是cd101-，而包含成熟嗜中性粒细胞的第二群体是cd101+。在一些实例中，第一群体还可以包含呈cd101-的未成熟嗜中性粒细胞。在一些实例中，该方法可以包括用适应于靶向cd101的试剂检测cd101的表达。在一些实例中，分离一种或多种所需的嗜中性粒细胞亚型可以通过本领域已知的方法进行。例如，一种或多种所需嗜中性粒细胞亚型可以通过经由适应于靶向cd101的试剂固定化一种或多种所需的嗜中性粒细胞亚型来分离。在一些实例中，所述方法可进一步包括通过检测一种或多种生物标记物的表达来验证所需嗜中性粒细胞亚型的步骤，所述生物标记物选自cd101、ckit、ly6c、cd106、siglecf、cd115、cd205、cd11b、gr1和cxcr4。在这样的实例中，各种嗜中性粒细胞亚型(即，增殖性嗜中性粒细胞，包括原嗜中性粒细胞和前嗜中性粒细胞，未成熟嗜中性粒细胞和成熟嗜中性粒细胞)的特征可以如上文和实验部分中所述。在一些实例中，所述方法还可包括向受试者施用能够从骨髓动员嗜中性粒细胞、造血干细胞和祖细胞，刺激嗜中性粒细胞和/或诱导粒细胞生成的药剂。在一些实例中，在从受试者获得细胞群之前，所述药剂可包括但不限于普乐沙福、粒细胞集落刺激因子(g-csf)和/或白介素3(il-3)中的一种或多种。在一些实例中，所需嗜中性粒细胞亚型可以是增殖性嗜中性粒细胞，比如原嗜中性粒细胞和/或前嗜中性粒细胞。在一些实例中，所述方法可进一步包括用一种或多种生长因子扩增增殖性嗜中性粒细胞(例如原嗜中性粒细胞和/或前嗜中性粒细胞)的步骤。如本文所用的，“生长因子”可包括能够促进或诱导细胞(比如嗜中性粒细胞)进入细胞周期的细胞分裂期(即，细胞周期的s期)的任何生物活性分子。例如，一种或多种生长因子可以包括但不限于白介素6(il-6)、白血病抑制因子(lif)、干细胞因子(scf)、g-csf、il-3等。根据本公开的另一方面，提供了包含增殖性嗜中性粒细胞的组合物。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是cd10-cd101-。根据本公开的另一方面，提供了包含治疗有效量的增殖性嗜中性粒细胞的组合物用于治疗。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是cd10-cd101-。在一些实例中，所述组合物可用于治疗患者中的免疫缺陷相关疾病和/或病症。根据本公开的另一方面，提供了一种用于增强受试者的免疫系统和/或维持受试者中的免疫应答的组合物，其包含治疗有效量的增殖性嗜中性粒细胞。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是cd10-cd101-。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以包括原嗜中性粒细胞和/或前嗜中性粒细胞。如本文所述，原嗜中性粒细胞可以是cd101-cd10-cd16-cd34-cd66b+cd15+cd71+cd49d+cd11b-cxcr2-和/或前嗜中性粒细胞是cd101-cd10-cd16-cd34-cd66b+cd15+cd71+cd49d+cd11b+cxcr2-。根据本公开的另一方面，提供了增殖性嗜中性粒细胞在制备用于治疗患者中的免疫缺陷相关疾病和/或病症的药物中的用途。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是cd10-cd101-。根据本公开的另一方面，提供了治疗患者中免疫缺陷相关疾病和/或病症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的增殖性嗜中性粒细胞。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是cd10-cd101-。在一些实例中，免疫缺陷相关疾病和/或病症可与癌症和/或感染有关。在一些实例中，患者可以是免疫受损的。在一些实例中，所述方法可包括根据需要向患者施用治疗有效量的增殖性嗜中性粒细胞。例如，患者可能需要每1天至每7天、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周(或一个月)一次、每月一次、每两个月一次等施用增殖性嗜中性粒细胞。在一些实例中，患者可能需要每两(2)至六(6)天或每三(3)至五(5)天施用增殖性嗜中性粒细胞。在一些实例中，所述方法可包括根据需要向患者施用治疗有效量的增殖性嗜中性粒细胞达至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、至少一个月、至少两个月、至少三个月的时间，或至少达患者为免疫受损的持续时间。在一些实例中，根据患者的免疫状态，患者可能需要间歇地施用增殖性嗜中性粒细胞。如本文所用，“免疫受损”指在人类患者中的一种存在状态，其中患者的免疫系统可能认为不是最佳的。例如，当患者缺乏免疫系统的某些成分时，可认为该人类患者是免疫受损的。在一些实例中，当患者在样品(例如骨髓、脾或血液样品)中不具有与参照未患病(健康或未免疫受损)受试者相同量的总嗜中性粒细胞计数或组成时，可以认为患者是免疫受损的。例如，与参照受试者相比，患者中更高水平的未成熟嗜中性粒细胞可指示炎症。本文所用的“参照受试者”指已知未患病的或至少不具有与患者(即怀疑或证实免疫受损的受试者)相同的病状的一般群体的受试者或个体。根据本公开的另一个方面，提供了一种增强患者的免疫系统的方法，所述方法可以包括以下步骤：(a)获得包含嗜中性粒细胞的细胞群。在一些实例中，所述方法还包括步骤(b)根据嗜中性粒细胞上的cd10和/或cd101表达从细胞群中分离增殖性嗜中性粒细胞。在一些实例中，所述方法还包括步骤(c)向患者施用治疗有效量的增殖性嗜中性粒细胞。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是cd10–cd101–。在一些实例中，步骤(b)可进一步包括用适应于靶向cd10和/或cd101的试剂检测cd10和/或cd101的表达。在一些实例中，该方法可进一步包括在步骤(c)之前扩增前嗜中性粒细胞的步骤。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以用一种或多种生长因子扩增。在一些实例中，生长因子可以是本领域已知的激发或促进或诱导嗜中性粒细胞增殖的生长因子。在一些实例中，生长因子可包括但不限于白介素6(il-6)、白血病抑制因子(lif)、干细胞因子(scf)、g-csf和il-3。在一些实例中，步骤(a)可包括从患者获得包含嗜中性粒细胞的细胞群。在一些实例中，包含嗜中性粒细胞的细胞群可以从患者的骨髓和/或脐带血获得。根据本公开的另一方面，提供了一种用于诊断或预后患者中的医学病状的方法。在一些实例中，该方法可包括步骤(a)测试从患者获得的包含嗜中性粒细胞的样品，以检测嗜中性粒细胞上cd10和/或cd101的表达。在一些实例中，所述方法可包括(b)测量样品中增殖性嗜中性粒细胞、未成熟嗜中性粒细胞和/或成熟嗜中性粒细胞的水平，其中增殖性嗜中性粒细胞是cd10–cd101–，未成熟嗜中性粒细胞是cd10–cd101+，而成熟嗜中性粒细胞是cd10+cd101+。在一些实例中，所述方法可进一步包括步骤(c)将样品中增殖性嗜中性粒细胞、未成熟嗜中性粒细胞和/或成熟嗜中性粒细胞的水平与对照中的参照水平进行比较以确定医学病状的不存在或存在，或预测医学病状的进程。在一些实例中，样品可以是骨髓样品和/或脾样品。在一些实例中，当样品是骨髓样品和/或脾样品时，样品中的增殖性嗜中性粒细胞的水平高于对照中的参照水平可指示患者具有炎性医学病状。在一些实例中，炎性医学病状可以与自身免疫性疾病、败血症和/或癌症有关。在一些实例中，样品中未成熟嗜中性粒细胞的水平高于对照中的参照水平可指示患者患有医学病状。在一些实例中，未成熟嗜中性粒细胞的水平可与医学病状的进展相关。在一些实例中，样品可以是血液样品或肿瘤样品。在一些实例中，所述医学病状可以是癌症。例如，所述癌症可包括但不限于肺癌、膀胱癌、头和/或颈癌、乳腺癌、食管癌、口腔癌、舌癌、牙龈癌、皮肤癌(例如黑素瘤、基底细胞癌、卡波西肉瘤等)、肌肉癌、心脏癌、肝癌、支气管癌、软骨癌、骨癌、胃癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫癌、胰腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、淋巴瘤癌、脾癌、胸腺癌、甲状腺癌、脑癌、神经元癌、间皮瘤、胆囊癌、眼癌(例如角膜癌、葡萄膜癌、脉络膜癌、斑性癌、玻璃体液癌等)、关节癌(例如滑膜癌)、成胶质细胞瘤、白细胞癌(例如淋巴瘤、白血病等)、遗传性非息肉病癌(hnpc)、结肠炎相关癌等。在一些实例中，癌症可以是胰腺癌。根据本公开的另一方面，提供了用于检测和/或预测患者中的炎症的试剂盒。在一些实例中，试剂盒可包括用于检测cd10在嗜中性粒细胞上表达的试剂和/或用于检测cd101在嗜中性粒细胞上表达的试剂以测量取自患者的样品中增殖性嗜中性粒细胞的水平。在一些实例中，增殖性嗜中性粒细胞可以是cd10–cd101–。在一些实例中，试剂盒可进一步包含用于比较增殖性嗜中性粒细胞的测量水平的参照水平。在一些实例中，样品中的增殖性嗜中性粒细胞的水平高于参照水平可指示患者患有炎性医学病状。根据本公开的另一个方面，提供了一种分离嗜中性粒细胞的方法，所述方法包括以下步骤：根据嗜中性粒细胞上cd101的表达，将嗜中性粒细胞分开为包含增殖性嗜中性粒细胞的第一群体和包含成熟嗜中性粒细胞的第二群体。在一些实例中，提供了一种分离嗜中性粒细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)检测cd101在嗜中性粒细胞上的表达；和(b)根据嗜中性粒细胞上cd101的表达将嗜中性粒细胞分离成嗜中性粒细胞亚型，包括前嗜中性粒细胞、未成熟嗜中性粒细胞和成熟嗜中性粒细胞。在一些实例中，嗜中性粒细胞来自从人受试者获得的细胞群，和其中所述方法进一步包括检测cd10在嗜中性粒细胞上的表达，并且根据cd10在嗜中性粒细胞上的表达将嗜中性粒细胞分离成嗜中性粒细胞亚型，其中前嗜中性粒细胞是cd10–cd101–，未成熟嗜中性粒细胞是cd10–cd101+，并且成熟嗜中性粒细胞是cd10+cd101+。在一些实例中，所述方法还包括根据选自cd49d、cd16和cxcr2的一种或多种生物标记物检测嗜中性粒细胞上的表达并将嗜中性粒细胞分离成嗜中性粒细胞亚型，其中前嗜中性粒细胞是cd49d+cxcr2–，未成熟嗜中性粒细胞是cd16–cxcr2–，和成熟嗜中性粒细胞是cd16+cxcr2+。在一些实例中，该方法包括用适应于靶向cd10和/或cd101的抗体检测cd10和cd101的表达。在一些实例中，嗜中性粒细胞来自从鼠受试者获得的细胞群体，和其中前嗜中性粒细胞和未成熟嗜中性粒细胞是cd101-，而成熟嗜中性粒细胞是cd101+。在一些实例中，所述方法还包括根据选自cxcr4和ckit的一种或多种生物标记物检测在嗜中性粒细胞上的表达并将嗜中性粒细胞分离成嗜中性粒细胞亚型，其中前嗜中性粒细胞是cxcr4hickitint，未成熟嗜中性粒细胞是cxcr4lockitlo，而成熟嗜中性粒细胞是cxcr4–ckit–。在一些实例中，嗜中性粒细胞来自从受试者的骨髓、脾和/或血液获得的细胞群。在一些实例中，提供了用于分离嗜中性粒细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测cd101在嗜中性粒细胞上表达的试剂；以及根据嗜中性粒细胞上cd101的表达将嗜中性粒细胞分离为包括前嗜中性粒细胞、未成熟嗜中性粒细胞和成熟嗜中性粒细胞的嗜中性粒细胞亚型的分离器。在一些实例中，所述试剂盒用于分离人嗜中性粒细胞，并且所述试剂盒还包含用于检测人嗜中性粒细胞上cd10表达的试剂，并且所述分离器适应于根据嗜中性粒细胞上cd10的表达将嗜中性粒细胞分离成嗜中性粒细胞亚型，其中前嗜中性粒细胞是cd10–cd101–，未成熟嗜中性粒细胞是cd10–cd101+，并且成熟嗜中性粒细胞是cd10+cd101+。在一些实例中，用于检测cd10表达的试剂是适应于靶向cd10的抗体，和/或其中用于检测cd101表达的试剂是适应于靶向cd101的抗体。在一些实例中，所述试剂盒还包括用于检测选自cd49d、cd16和cxcr2的一种或多种生物标记物在嗜中性粒细胞上表达的试剂，和其中所述分离器适应于根据嗜中性粒细胞上cd49d、cd16和/或cxcr2的表达将嗜中性粒细胞分离成嗜中性粒细胞亚型。在一些实例中，所述试剂盒用于分离鼠嗜中性粒细胞，和其中所述分离器适应于根据cd101的表达将嗜中性粒细胞分离成嗜中性粒细胞亚型，其中前嗜中性粒细胞和未成熟嗜中性粒细胞是cd101-，并且成熟嗜中性粒细胞是cd101+。在一些实例中，用于检测cd101表达的试剂是适应于靶向cd101的抗体。在一些实例中，所述试剂盒还包含用于检测选自包含cxcr2、ly6g、ckit、cd11b和cxcr4的组的一种或多种生物标记物在嗜中性粒细胞上的表达的试剂，和其中所述分离器适应于根据cxcr2、ly6g、ckit、cd11b和/或cxcr4在嗜中性粒细胞上的表达将嗜中性粒细胞分离成嗜中性粒细胞亚型。在一些实例中，提供了分离和/或富集嗜中性粒细胞亚型的方法，该方法包括：(a)检测细胞群中嗜中性粒细胞上cd101的表达；和(b)根据嗜中性粒细胞上cd101的表达将嗜中性粒细胞分类为嗜中性粒细胞亚型，包括前嗜中性粒细胞、未成熟嗜中性粒细胞和成熟嗜中性粒细胞；和(c)分离和/或富集一种或多种所需的嗜中性粒细胞亚型。在一些实例中，所述细胞群从人受试者中获得，和其中所述方法还包括检测嗜中性粒细胞上cd10的表达，并根据嗜中性粒细胞上cd10的表达将嗜中性粒细胞分类为嗜中性粒细胞亚型，其中前嗜中性粒细胞是cd10–cd101–，未成熟嗜中性粒细胞是cd10–cd101+，并且成熟嗜中性粒细胞是cd10+cd101+。在一些实例中，该方法包括用适应于靶向cd10和/或cd101的抗体检测cd10和cd101的表达。更优选地，分离一种或多种所需嗜中性粒细胞亚型包括经由适应于靶向cd10和/或cd101的抗体固定化一种或多种所需的嗜中性粒细胞亚型。在一些实例中，所述方法还包括通过检测一种或多种生物标记物的表达来验证所需嗜中性粒细胞亚型的步骤，所述生物标记物选自包含cd34、cd15、cd66b、cd49d、cd16、cxcr2和siglec8(或siglecf)的组。在一些实例中，所述细胞群从鼠受试者获得，和其中前嗜中性粒细胞和未成熟嗜中性粒细胞是cd101-，而成熟嗜中性粒细胞是cd101+。在一些实例中，该方法包括用适应于靶向cd101的抗体检测cd101的表达。更优选地，分离一种或多种所需嗜中性粒细胞亚型包括经由适应于靶向cd101的抗体固定化所述一种或多种所需嗜中性粒细胞亚型。在一些实例中，所述方法还包括通过检测一种或多种生物标记物的表达来验证所需嗜中性粒细胞亚型的步骤，所述生物标记物选自包含cxcr2、ly6g、ckit、cd11b和cxcr4的组。在一些实例中，所述方法包括从受试者的骨髓、脾和/或血液获得细胞群。在一些实例中，所述方法包括在从所述受试者获得所述细胞群之前，向所述受试者施用普乐沙福、粒细胞集落刺激因子(g-csf)和/或白介素3(il-3)。在一些实例中，所需嗜中性粒细胞亚型是前嗜中性粒细胞。更优选地，该方法进一步包括用一种或多种选自包含白介素6(il-6)、白血病抑制因子(lif)、干细胞因子(scf)、g-csf和il-3的组的生长因子来扩增前嗜中性粒细胞的步骤。在一些实例中，提供了包含前嗜中性粒细胞的组合物，其中所述前嗜中性粒细胞是cd10–cd101–。在一些实例中，前嗜中性粒细胞是cd10–cd101–cd34–cd15+cd66b+cd49dhisiglec8–(或siglecf-)。在一些实例中，提供了包含治疗有效量的前嗜中性粒细胞的组合物用于治疗，其中所述前嗜中性粒细胞是cd10–cd101–。在一些实例中，所述组合物用于治疗患者中的免疫缺陷相关疾病和/或病症。在一些实例中，免疫缺陷相关疾病和/或病症与癌症和/或感染有关。甚至更优选地，患者是免疫受损的。在一些实例中，存在包含治疗有效量的前嗜中性粒细胞的组合物，用于增强受试者的免疫系统和/或维持受试者中的免疫应答，其中前嗜中性粒细胞是cd10–cd101–。在一些实例中，提供了前嗜中性粒细胞在制备用于治疗患者中免疫缺陷相关疾病和/或病症的药物中的用途，其中所述前嗜中性粒细胞是cd10–cd101–。在一些实例中，免疫缺陷相关疾病和/或病症与癌症和/或感染有关。更优选地，患者是免疫受损的。在一些实例中，提供了治疗患者中免疫缺陷相关疾病和/或病症的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的前嗜中性粒细胞，其中前嗜中性粒细胞是cd10–cd101–。在一些实例中，免疫缺陷相关疾病和/或病症与癌症和/或感染有关。更优选地，患者是免疫受损的。在一些实例中，该方法包括每三(3)至五(5)天向患者施用治疗有效量的前嗜中性粒细胞。在一些实例中，提供了增强患者的免疫系统的方法，所述方法包括以下步骤：(a)获得包含嗜中性粒细胞的细胞群；(b)检测cd10和cd101在嗜中性粒细胞上的表达；(c)从所述细胞群分离前嗜中性粒细胞，其中所述前嗜中性粒细胞是cd10–cd101–；和(d)向患者施用治疗有效量的前嗜中性粒细胞。在一些实例中，步骤(b)包括用适应于靶向cd10和/或cd101的抗体检测cd10和cd101的表达。在一些实例中，该方法进一步包括在步骤(d)之前扩增前嗜中性粒细胞的步骤。在一些实例中，用一种或多种选自包含白介素6(il-6)、白血病抑制因子(lif)、干细胞因子(scf)、g-csf和il-3的组的生长因子来扩增前嗜中性粒细胞。在一些实例中，步骤(a)包括从患者，优选地从患者的骨髓获得包含嗜中性粒细胞的细胞群。在一些实例中，包含嗜中性粒细胞的细胞群获自脐带血。在一些实例中，提供了一种用于诊断或预后患者中的医学病状的方法，所述方法包括以下步骤：(a)测试从患者获得的包含嗜中性粒细胞的样品，以检测嗜中性粒细胞上cd10和cd101的表达；(b)测量所述样品中前嗜中性粒细胞、未成熟嗜中性粒细胞和/或成熟嗜中性粒细胞的水平，其中前嗜中性粒细胞为cd10–cd101–，未成熟嗜中性粒细胞为cd10–cd101+，和成熟嗜中性粒细胞为cd10+cd101+；和(c)将样品中的前嗜中性粒细胞、未成熟嗜中性粒细胞和/或成熟嗜中性粒细胞的水平与对照中的参照水平进行比较，以确定医学病状的存在与否，或预测医学病状的进程。在一些实例中，步骤(a)包括用适应于靶向cd10和/或cd101的抗体检测cd10和cd101的表达。在一些实例中，所述方法是体外方法。在一些实例中，所述样品是骨髓样品和/或脾样品，和其中所述样品中的前嗜中性粒细胞的水平高于对照中的参照水平指示所述患者具有炎性医学病状。在一些实例中，所述炎性医学病状与自身免疫性疾病、败血症和/或癌症有关。在一些实例中，所述医学病状是一种疾病并且所述样品是组织样品，和其中所述样品中未成熟嗜中性粒细胞的水平高于对照中的参照水平指示所述患者患有所述疾病。在一些实例中，未成熟嗜中性粒细胞的水平与疾病的进展相关。在一些实例中，组织样品是血液样品或肿瘤样品，且其中所述疾病是癌症。在一些实例中，癌症是胰腺癌。在一些实例中，提供了用于检测和/或预测患者中的炎症的试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测嗜中性粒细胞上cd10的表达的试剂和用于检测嗜中性粒细胞上cd101的表达的试剂以测量取自患者的样品中前嗜中性粒细胞的水平，其中所述前嗜中性粒细胞是cd10–cd101–；和用于比较前嗜中性粒细胞的测量水平的参照水平，其中样品中前嗜中性粒细胞的水平高于参照水平指示患者患有炎性医学病状。在一些实例中，提供了用于诊断和/或预后患者中的癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：用于检测嗜中性粒细胞上cd10的表达的试剂和用于检测嗜中性粒细胞上cd101的表达的试剂以测量取自患者的样品中未成熟嗜中性粒细胞的水平，其中所述未成熟嗜中性粒细胞是cd10–cd101+；和用于比较未成熟嗜中性粒细胞的测量水平的参照水平，其中样品中未成熟嗜中性粒细胞的水平高于参照水平指示患者患有癌症，和/或其中未成熟嗜中性粒细胞的水平与癌症的进展相关。实验部分将进一步描述本公开的非限制性示例，其不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。实验模型和主题细节小鼠在新加坡a＊star的生物资源中心(brc)中，在特定的无病原体(spf)条件下饲养和维持六至十周龄的c57bl/6小鼠。雄性和雌性都用于实验，但在每个实验中动物尽可能性别和年龄匹配。s100a8cre(b6.cg-tg(s100a8-cre,-egfp)1ilw/j)、lyz2cre/cre(b6.129p2-lyz2tm1(cre)ifo/j)、rosa26mt/mg(stockgt(rosa)26sortm4(actb-tdtomato,-egfp)luo/j、cxcl12dsred/+(stockcxcl12tm2.1sjm/j)、rosa26lsl-yfp(b6.129x1-gt(rosa)26sortm1(eyfp)cos/j)、白化小鼠(b6(cg)-tyrc-2j/j)、cd45.1(b6.sjl-ptprcapepcb/boyj)和cxcr4fl/fl(b6.129p2-cxcr4tm2yzo/j)小鼠从jackson实验室获得。对于命运图谱实验，将s100a8cre和lyz2cre/cre小鼠分别与rosa26lsl-yfp和rosa26mt/mg小鼠内部杂交。fucci-s/g2/m(#474)和双转基因fucci-g1(#639)小鼠获自rikenbioresourcecenter(日本茨城；tomura等，2013)。lyz2gfp/+(lyz2tm1.1graf)由t.graf(西班牙，巴塞罗那，基因组调控中心；(faust等，2000))提供。功能获得性cxcr41013/+(称为cxcr4whim)小鼠由f.bachelerie(法国，克拉马，inserm996；(balabanian等，2012))提供。cebpe-/-小鼠由p.koeffler(新加坡，nus，新加坡癌症科学研究所)(yamanaka等，1997)提供。为了产生c/ebpε-缺陷型的嵌合体，对c57bl/6小鼠进行致死性照射(1100rad)，并用单独的cebpe-/-骨髓细胞或用等比例的wtcd45.1骨髓细胞重建。将s100a8cre小鼠与cxcr4fl/fl内部杂交以生成具有cxcr4缺陷型嗜中性粒细胞的后代。对于嗜中性粒细胞亚群的生态位定位，将fucci-s/g2/m(#474)小鼠与cxcl12dsred+小鼠内部杂交。将所有转基因小鼠保持在c57bl/6背景下，并根据新加坡农业食品与兽医局(ava)和国家实验动物研究咨询委员会(naclar)的指导，在机构动物护理和使用委员会(iacuc)的批准下进行实验。人血、骨髓和脐带血样品所有样品均根据singhealthcirb或a＊star，新加坡免疫学网络的有利伦理意见获得。从已经为不同的研究或医疗原因提供骨髓的健康供体寻求骨髓样品的知情同意。不满足临床等级的脐带血单位获自新加坡脐带血库用于研究。方法细节处理对于5-氟尿嘧啶(5-fu)清髓性处理，小鼠腹膜内一次注射150mg/kg5-fu(sigma-aldrich)或pbs对照。对于g-csf处理，如前所述(rubinstein等，2013)，小鼠腹膜内一次注射1.5μg的g-csf/抗g-csf抗体复合物(g-csfcx)。简言之，通过将g-csf(neupogen)和抗g-csf(bvd11-37g10；southern-biotech)以1:5细胞因子与抗体的比例在37℃温育20分钟生成g-csfcx，然后在注射前用pbs稀释至少10倍。用于流式细胞术和细胞分选的组织制备和数据分析通过在下颌下区域中切口获得血液，然后在红细胞裂解缓冲液(ebioscience)中裂解。对于bm细胞，用23号针在含有2mmedta和2％胎牛血清(fbs)的pbs中冲洗小鼠股骨，并通过70μm尼龙网筛。收获脾脏，并使用70μm尼龙网筛和注射器柱塞均质化成单细胞悬浮液。抗体购自bd，biolengin，ebioscience或r&d。为了鉴定小鼠髓样细胞，用针对ccr2(475301)、cd11b(m1/70)、cd11c(n418)、cd16/32(2.4g2)、cd31(390)、cd45(30-f11)、cd45.1(a20)、cd45.2(104)、cd49f(goh3)、cd62l(mel-14)、cd101(moushi101)、cd115(afs598)、ckit(2b8)、cxcr2(sa044g4)、cxcr4(2b11)、cx3cr1(sa011f11)、f4/80(bm8)、gr1(rb6-8c5)、i-a/i-e(m5/114.15.2)、ly6c(hk1.4)、ly6g(1a8)和siglec-f(e50-2440)，以及包括cd3e(145-2c11)、cd90.2(53-2.1)、b220(ra3-6b2)、nk.1.1(pk136)和sca-1(d7)在内的排除性谱系标记物的偶联有荧光团的抗小鼠抗体染色细胞。在用dapi排除细胞双连体和死细胞后，preneu鉴定为(lin,cd115,siglec-f)-gr1+cd11b+cxcr4hickitintcxcr2-，未成熟的neu鉴定为(lin,cd115,siglec-f)-gr1+cd11b+cxcr4lockitlocxcr2-和成熟的neu鉴定为(lin,cd115,siglec-f)-gr1+cd11b+cxcr4-ckit-ly6g+cxcr2+。为了鉴定hsc和hpc，用cd16/32(2.4g2)、cd34(ram34)、cd48(hm48-1)、cd150(tc15-12f12.2)、ckit(2b8)、flt3(a2f10)、ly6c(hk1.4)和sca-1(d7)以及包括cd3e(145-2c11)、cd11b(m1/70)、cd90.2(53-2.1)、b220(ra3-6b2)、gr1(rb6-8c5)和nk.1.1(pk136)在内的排除性谱系标记物染色细胞。用dapi排除细胞双连体和死细胞后，lt-hsc鉴定为lin-ckit+sca-1+cd150+cd48+，st-hsc鉴定为lin-ckit+sca-1+cd150-cd48-，mpp鉴定为lin-ckit+sca-1+cd150-cd48，cmp鉴定为lin-ckit+sca-1-cd16/32intcd34int，gmp鉴定为lin-ckit+sca-1-cd16/32hicd34hi，mdp鉴定为lin-ckit+sca-1-cd115+flt3+ly6c-和cmop鉴定为lin-ckit+sca-1-cd115+flt3-ly6c+。使用facsdiva软件在5-激光器bdlsrii(bd)上进行流式细胞术采集，随后用flowjo软件(treestar)分析数据。根据制造商的说明书，用计数珠(countbright；lifetechnologies)定量细胞数目。使用bdariaii(bd)进行bm嗜中性粒细胞亚群的分选以达到＞98％的纯度。质谱细胞术(cytof)样品制备、获取和分析对于质谱细胞术分析，从bdbiosciences，biolegen，ebioscience，bioxcell获得纯化的抗体，并使用dn3抗体标记试剂盒(fluidigm)根据制造商的说明书进行缀合。小鼠腹膜内一次注射2mgidu(sigma-aldrich)。2小时后对小鼠实施安乐死，收获股骨，在pbs中冲洗并通过70μm尼龙网筛。bm细胞以每孔5×106个细胞的密度铺板于96孔圆底板中。对于人bm，将抽吸物在含有10％fcs和50μmidu的rpmi中37℃温育1小时。用100μl50μm顺铂(sigma-aldrich)在4℃为存活力染色细胞5分钟。然后用染色缓冲液(1xpbs中4％fbs，0.05％叠氮化钠，2mmedta)洗涤细胞，并与抗-ccr2-apc、抗-cd34-fitc、抗-cd115-pe和抗-flt3-生物素(小鼠组)或cxcr4-生物素、cxcr2-fitc、cd101-apc(人类组)在50μl反应体积中在4℃温育90分钟。用1xrbs裂解缓冲液(ebioscience)裂解红细胞，并用染色缓冲液洗涤细胞。在冰上用50μl金属同位素标记的表面抗体(参见表1和2)染色细胞。30分钟后，用染色缓冲液洗涤细胞两次，用pbs洗涤一次，然后在4℃在含2％多聚甲醛(pfa)(electronmicroscopysciences)的pbs中过夜固定。第二天，使细胞沉淀并重悬于200μl1x透化缓冲液(biolegend)中，并允许在冰上静置5分钟。然后用pbs洗涤细胞一次，并如前所述(becher等，2014)在冰上与细胞条形码一起温育30分钟。随后，用perm缓冲液洗涤细胞一次，并在冰上在染色缓冲液中10分钟。将细胞dna在室温用250nm铱嵌入剂(fluidigm)在2％pfa/pbs中标记。20分钟后，用染色缓冲液洗涤细胞两次。在采集之前，用水洗涤细胞两次，然后在水中最终重悬浮。从所有样品中合并细胞，计数，过滤并稀释至0.6×106细胞/ml的终浓度。使用质量标签条形码化，以便可同时采集所有细胞。在采集之前，将eq四元校准珠(fluidigm)以1％的终浓度加入到合并的样品中。在装备有超取样器流体系统(victorianairship&scientificapparatusllc)的cytof2(fluidigm)上以＜500事件/秒的事件速率采集样品。在质谱细胞术采集之后，以流式细胞术(fcs)格式输出数据，标准化，并且使用负一和零之间的值的均匀分布将具有零值参数的事件随机化。使用flowjo软件(treestar)通过布尔设门对包含两个金属条形码的独特组合的每个样品进行去卷积。随后，进行人工设门以排除残留的珠、碎片和死细胞。使用flowjo对bmcd45+idu+(增殖细胞)和cd45+idu-(非增殖细胞)设门，并作为fcs文件输出。进行无替换的随机二次取样(subsampling)以选择90000个事件。通过使用cytofkitr包(chen等，2016；vandermaaten和hinton，2008)的t-分布式随机邻域嵌入(t-sne)选择表1中列出的标记物，进行cytof数据的降维。使用cytofkit中的flowsom实现产生簇。计算对于每个标记物的每个簇的中值强度值并输出以使用r产生热图。基于每个分别的标记物的表达推断每个簇的身份。表1小鼠cytof组，与star方法相关表2人cytof组，与star方法相关全嵌放(whole-mount)组织制备和免疫染色将新鲜解剖的6-10周龄小鼠的股骨在含有30％蔗糖的1×pbs中的4％pfa中在室温固定3小时，同时轻轻摇动。用1×pbs洗骨3次(30分钟间隔)。接着将股骨在4℃置于含有10％乙二胺四乙酸(edta)的ph＝7的pbs的脱钙溶液中2天。用1xpbs洗涤3次，每次30分钟，之后将股骨包埋在4％琼脂糖中，并使用振动切片机(leicavt1000s)以250μm的厚度切片。将股骨切片在含有10％二甲基亚砜(dmso)和2.5％山羊和驴血清的染色缓冲液中封闭并透化过夜。切片用染色缓冲液中的大鼠抗小鼠s100a9(2b10，abcam)和兔多克隆层粘连蛋白1+2(ab7363，abcam)染色3天。随后用1xpbs洗涤切片3次(1小时间隔)，并用抗大鼠af555igg和抗兔af647igg(lifetechnologies)染色2天。切片在1xpbs中洗涤3次(1小时间隔)，并置于rapiclear1.55(sunjinlab)中至少30分钟以进行折射率匹配。最后将切片在rapiclear1.55中在两个盖玻片之间嵌放，并用真空油脂(dowcorning)密封。股骨切片的多光子图像采集使用装配有水浸物镜(20x放大倍数，1.0na，2mmwd；xlumplfln20xw，olympus)和chameleon脉冲红外激光器(钛宝石；coherent)的lavisiontrimscopeii显微镜(lavisionbiotec)获得股骨切片的三维(3d)拼接图像。进行两种激发波长的采集：990nm和800nm。990nm激发用于fucci-(s-g2-m)阳性细胞(λem＝505nm)、二次谐波产生(shg)(λem＝495nm)、af555(λem＝565nm)和dsred(λem＝580nm)的同时成像。随后，在800nm进行成像以获得af647(λem＝670nm)。使用的过滤器是：494/41、525/50、565/40、620/60和665/40。所用的分色镜是495lp，560lp，620lp，591sh(semrock)和640lp(chromatechnology)。图像是用下列设置获取的：450μm×450μm，517×517像素，600hz线扫描，具有2帧的线平均，使用具有250μm深度的2μmz步长。选择远端骨骺作为成像区域以保持样本之间的一致性。使用fijiisjustimagej(fiji)将3d拼接z栈(stack)图像缝合在一起，随后使用imaris软件(bitplane)进行呈现和分析。af555和dsred之间的光谱溢出(spillover)使用imaris利用通道算术插件去除。使用imaris中的斑点功能工具鉴定s100a9+fucci-(s-g2-m)+和s100a9+fucci-(s-g2-m)-细胞。使用imaris中建立的基于distancetransformmatlab的xtension计算到最近的血管和car细胞的距离。然后输出原始统计数据用于在prism(graphpad)中进一步分析。细胞离心和wright-giemsa染色使用cytospin4细胞离心机(thermoscientific)将分选的嗜中性粒细胞亚群(各1×105个细胞)离心到玻璃载玻片上，干燥20分钟，在甲醇中固定，并根据制造商的方案用hema3手动染色系统(fisherdiagnostics)染色。用配备有100x油浸物镜的olympusbx43获得图像，并用photoshop(adobe)调节图像亮度。转录组学基于图7a和14a中描述的设门策略，分选来自3只不同小鼠的gmp、preneu、未成熟neu、成熟neu和血液neu。从3只不同的小鼠分别分选bm过渡期前单核细胞(tpmo)和bm成熟ly6chi单核细胞为lin(cd3,cd90.2,b220,nk1.1,ly6g)-cd115+flt3-ly6c+cxcr4hicd11blo和lin(cd3,cd90.2,b220,nk1.1,ly6g)-cd115+flt3-ly6c+cxcr4locd11bhi(参见，(chong等，2016)中的设门策略)。随后使用arcturuspicopurerna分离试剂盒根据生产商的方案进行总rna分离。在perkinelmerlabchipgx系统上分析所有小鼠rna用于质量评估，rin＞7.7。使用smartseqv2方案(picelli等，2014)，使用2ng总rna和1μl的1:50000稀释的erccrnaspikeincontrols(ambion)制备cdna文库，只不过进行以下修改：(1)使用20μmtso；和(2)使用250pgcdna与illuminanexteraxt试剂盒的1/5反应物。在perkinelmerlabchip上使用dna高灵敏度试剂试剂盒监测cdna文库的长度分布。全部18个样品在illuminahiseq2500rapid模式上进行2×51个循环的索引pe测序运行。随后使用star比对软件将fastq文件形式的rna-seq数据映射到小鼠基因组构建mm10。然后基于gencodem7注释使用featurecounts(subread程序包的部分)对映射的读段计数。然后将原始计数用于差异基因表达分析(deg)，其使用edger(r3.1.2版)以fdr<0.05和log2fc>2来鉴定在嗜中性粒细胞亚群中差异调节的基因以生成火山图。使用edger(r3.1.2版)由原始计数计算每百万读段的计数(cpm)值。然后将cpm值在r中用log2转换(x-＞log2(1+x))。对于pca、分层聚类和相关矩阵，首先使用前20％可变基因(如通过样品间的标准偏差测量)分离基因表达矩阵，然后使用与细胞群体显著相关的那些(fdr-校正的anova，q值＜0.05)，得到4820个deg。对于分层聚类，使用欧几里得距离和ward聚集标准以及pheatmap程序包来绘制结果为热图。使用pearson相关系数计算相关矩阵。deg的基因本体(go)富集(gobiologicalprocess2015)使用enrichr(chen等，2013)进行。发育路径的计算推断r程序包系列化2(hahsler等，2008)用于寻找gmp、preneu、未成熟neu、成熟neu和血液neu的合适线性顺序。六种不同的系列化(seriation)方法，包括tsp、r2e、arsa、hc、gw和olo.tsp、arsa、gw和olo产生相同的结果，并且在最短路径长度、最小ar事件和最小moore应力方面产生最好的结果。使用所有检测基因的log2cpm值进行系列化分析。体外细胞培养将分选的细胞(每个嗜中性粒细胞亚群3×104)一式三份铺于96孔板上，并在37℃，5％co2下在iscove改良的dulbecco培养基中培养，所述培养基具有25mmhepes和l-谷氨酰胺(chemtron)，含有10％(体积/体积)fbs、1mm丙酮酸钠、青霉素(100u/ml)和链霉素(100ug/ml)。如前所述进行集落形成试验(hettinger等，2013)。简言之，将分选的细胞(每个嗜中性粒细胞亚群3×104个)在iscove改良的dulbecco培养基(sigma)中培养，所述培养基具有上述补充物、1％(wt/vol)甲基纤维素(methocultm3134，stemcelltechnologies)和细胞因子组合(50ng/mlscf、20ng/mllif、10ng/mlil-3、20ng/mlil-6)。用olympusix-81显微镜(olympus)收集代表性菌落图像。用photoshop调节图像亮度。brdu脉冲测定法对于体内测定，在指定的时间点给小鼠腹膜内注射2mg的5-溴-2'-脱氧尿苷(brdu；sigma-aldrich)。为了检测brdu掺入嗜中性粒细胞亚群中，在流式细胞术分析之前，用可固定的活力染料(zombieuv可固定的活力试剂盒；biolegend)对细胞染色，表面染色，固定，渗透，并用缀合有fitc的抗brdu抗体根据制造商的方案(brdu流式试剂盒；bd)，进行细胞内染色。过继性细胞转移如前所述(chong2016)，将分选的lyz2gfp/+preneu(2×105个细胞)bm内转移到野生型接受体中。简言之，用氯胺酮(150mg/kg)/甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉接受体小鼠，并将其右腿剃毛以暴露膝盖骨。将分选的preneu以2×104细胞/μl的浓度重悬浮在1xpbs中，并使用29号胰岛素针将10μl的体积通过膝盖骨使用到胫骨中。在细胞转移后24和48小时，收集胫骨，染色并通过流式细胞术分析。激光诱导的无菌损伤模型如指示的从lyz2gfp/+(gfp)或rosa26mt/mg(tdtomato)转基因小鼠中分选嗜中性粒细胞亚群，并以1:1的比例混合(各2.5×105个细胞)。细胞以0.1×105细胞/μl的浓度重悬。用hamilton注射器(33号，62rn)将2.5μl体积的嗜中性粒细胞悬浮液皮内注射到耳中。在所有实验中，b6(cg)-tyrc-2j/j(b6白化)小鼠用作接受体小鼠。在两到三小时后，准备小鼠进行皮肤多光子成像，然后如前所述进行激光聚焦损伤(li等，2012)。简言之，将麻醉的小鼠置于定制的耳成像平台上以稳定耳朵用于活体成像。为了诱导无菌损伤，将靠近注射部位的选定区域(75μm2)短暂暴露于聚焦激光脉冲(850nm)约5秒。对于图像采集，990nm的激发波长用于同时收集gfp(λem＝510nm)、tdtomato(λem＝580nm)和二次谐波发生(shg)(λem＝495nm)。所用的滤器是494/41、510/20和579/34(semrock)。所用的分色镜是495lp(semrock)、560lp(semrock)和640lp(chromatechnology)。使用z步长为4μm的500μm×500μm的扫描场尺寸来获取40-50μm栈，该栈以每半分钟的间隔获取1小时。用加热垫将小鼠体温保持在37℃，并且在成像期间将小鼠耳朵分别加热到35℃。采集后，使用imaris(bitplane)进行数据校正和分析。必要时，使用fijiisjustimagej(fiji)校正采集期间发生的漂移。使用“spots(斑点)”函数和“自回归运动”算法在imaris中半自动地进行细胞追踪。最后使用imaris产生重建的图像和视频。氧化爆发试验将分选的嗜中性粒细胞(每个细胞亚群5×105个)与2.5μg/ml二氢罗丹明123(dhr)(thermofisher)在rpmi中孵育，并在37℃经受50nm佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)(sigma-aldrich)20分钟。随后用pbs洗涤细胞，并通过流式细胞术测量每个亚群的荧光强度。体外吞噬作用测定表达gfp的dh5α大肠杆菌(e.coli)(chua和wong，2013)在溶原性肉汤(lb)培养基中在37℃过夜培养至600nm处的光密度(od)为1.5-1.8，此时将细菌稀释并培养1-2小时至od600为～0.5，最后用pbs洗涤两次。将分选的嗜中性粒细胞(每个细胞亚群1×105个)与细菌以1:100的比例在37℃孵育2小时。孵育后，用pbs洗涤细胞，用2％pfa固定并通过流式细胞术分析。反向被动arthus(rpa)反应如前所述进行rpa(li等，2016)。简言之，以8μl/g体重，10mg/ml于盐水溶液中的伊文思(evans)蓝染料(sigma-aldrich)静脉内注射小鼠。rpa反应通过皮内注射1.5μl10mg/ml抗bsa(sigma-aldrich)开始，随后腹膜内注射200μl5mg/mlbsa(sigma-aldrich)。为了量化嗜中性粒细胞的数量，如所述(li等，2016)对小鼠耳朵进行组织匀浆和酶消化，然后进行流式细胞分析。为了定量血管渗漏，通过数字照相分析方法获得读数。clp诱导的中度败血症如前所述进行盲肠结扎和穿孔(rittirsch等，2009)。简言之，在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下暴露腹膜腔，取出盲肠。使用不可吸收的7-0缝合线将50％盲肠结扎在回肠盲肠瓣膜的远侧。使用26号针在盲肠远端穿孔，且在重新置于腹膜腔之前将一小滴粪便通过穿孔挤出。封闭腹膜，随后通过皮下注射用盐水和丁丙诺啡(buprenorphine)(5-20mg/kg)处理小鼠。对于假手术对照，暴露腹膜，并在如上所述闭合腹膜之前取出盲肠。在所示的手术后24小时或2周对小鼠实施安乐死并收获。对于细菌cfu测量，24小时后收集血液和腹膜液，并分别在血液-琼脂基板(胰胨大豆琼脂ii；fisherscientific)和lb琼脂板上于37℃培养过夜。原位胰腺肿瘤模型对小鼠施用来源于pdx1cre；lsl-krasg12d/+；lsl-trp53r172h/+(称作kpc)小鼠的fc1242肿瘤细胞(由dannielled.engle博士惠赠，tuvesonlab)的胰腺内注射，如前所述(zambirinis等，2015)。简言之，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉小鼠，剃掉其腹部并用防腐剂擦拭。在皮肤和腹部层中，在胸骨剑突下1cm、中线右侧1cm的点作5mm垂直切口。暴露胰腺，将1×105个肿瘤细胞重悬于1xpbs中，并与matrigel(bd)以1:1的比例混合，并使用29号的胰岛素针将50μl体积注射入胰腺体内，形成可见的圆块。然后将胰腺放回腹腔。用可吸收的5/0缝合线封闭腹部层，而用不可吸收的5/0缝合线封闭皮肤。将强力胶施加在缝合线上以确保它们在手术后不会解开。小鼠用盐水复苏，并在手术后2天皮下施用丁丙诺啡(10mg/kg)和恩诺沙星(baytril，1.5mg/kg)。在手术后第27-30天对小鼠实施安乐死，记录肿瘤重量。定量和统计分析使用prism软件(graphpad)进行统计学分析。进行了学生t-检验或单向方差分析(anova)伴有bonferroni校正。对于相关性分析，使用线性回归产生用于图形表示的最佳拟合线，并进行pearson相关性检验以产生p值。p值＜0.05认为是统计学显著的。结果骨髓细胞的多参数分析鉴定具有独特表型特征的增殖性嗜中性粒细胞细胞增殖是造血作用的关键。经典模型提出了分层次序，其开始于造血干细胞(hsc)的细胞扩增，造血干细胞(hsc)的细胞扩增导致所有血细胞谱系的生成(图5a)(manz和boettcher，2014；orkin和zon，2008)。当缓慢增殖的hsc分化成造血祖细胞(hpc)时，hpc通过降低其自更新能力而定向于其各自的细胞谱系，并广泛增殖以满足成熟的谱系特定的细胞的需求(图5a)。hpc分化成成熟白细胞代表大多数免疫细胞发育的晚期，因此，除了淋巴细胞、dc和组织驻留巨噬细胞以外，成熟白细胞具有很小的自更新或增殖能力(图5a)(ginhoux和jung，2014；manz和boettcher，2014)。为了确定这种造血增殖框架是否可以实验性地描述，使用标记经历细胞周期的s、g2或m期的细胞的fucci-474报告小鼠(称为fucci-(s-g2-m))(sakaue-sawano等，2008；tomura等，2013)分析处于不同发育阶段的各种免疫细胞类型。发现少于10％的hsc和成熟白细胞处于细胞周期中(图5b)。相反，超过40％的gmp参与细胞增殖活性(图5b)，与以前公布的数据一致(yo等，2015)。为了研究循环的白细胞和细胞周期停滞的白细胞之间的表型多样性，利用质谱细胞术通过40种不同的表达标记物分离bm中的主要白细胞谱系(becher等，2014)。cd45+造血细胞首先分开为增殖idu+和非增殖idu-细胞(图5c)。接下来利用t-分布随机邻域嵌入(t-sne)算法在2d图谱上可视化细胞之间的相似性(图5c)，并使用cytofkit产生簇(chen等，2016；vandermaaten和hinton，2008)。使用该方法，证实hpc比如cmp和gmp是高度增殖性的，且仅存在于idu+细胞中。此外，成熟的和终末分化的白细胞仅存在于idu-群中。值得注意的是，嗜中性粒细胞在增殖和非增殖性亚群中形成第二大簇(图5c，绿色)。然而，尽管在增殖性细胞中形成最大簇的b细胞前体是明确的，但是定向于嗜中性粒细胞的前体的鉴定及其随后的发育阶段仍然不清楚。因此，本发明人提取了每种标记物的中值强度，并且为增殖群体和非增殖群体中的每个所鉴定的簇生成热图(图5d)。接下来通过对idu+和idu-嗜中性粒细胞之间表达的标记物进行并列比较来研究嗜中性粒细胞中差异表达的标记物(图5e)。使用这种方法，发现了包括ckit、cxcr2、ly6g、gr1、cd62l和cxcr4的增殖性和非增殖性嗜中性粒细胞之间差异表达的标记物。值得注意地，这种方法不仅对嗜中性粒细胞有效，而且这种方法也能鉴定idu+和idu-嗜碱性粒细胞以及嗜酸性粒细胞和ly6chi单核细胞之间差异表达的标记物(图12)。总之，该方法重新定义了嗜中性粒细胞前体的身份，其通过根据嗜中性粒细胞前体的增殖和分子性质将其成熟阶段分类。fucci-(s-g2-m)报告小鼠揭示了增殖性嗜中性粒细胞前体为鉴定定向的嗜中性粒细胞祖细胞或前体，使用了图5e中鉴定的标记物和fucci-(s-g2-m)小鼠。排除谱系阳性细胞、早期祖细胞(ckithi细胞)、单核细胞(ssclocd115+)、嗜酸性粒细胞(sschisiglecf+)，并对gr1+cd11b+嗜中性粒细胞(图6a)进行设门。使用t-sne的降维揭示了基于fucci-(s-g2-m)表达可区分的两个不同的簇(图6b)。接下来比较增殖性(fucci-(s-g2-m)+)和非增殖性(fucci-(s-g2-m)-)嗜中性粒细胞之间的各种标记物的表达。与质谱细胞术数据一致(图5e)，非增殖性嗜中性粒细胞高度表达ly6g和cxcr2，而增殖性嗜中性粒细胞是ly6glocxcr2-并且对于ckit和cxcr4是阳性的(图6c)。这种“基于fucci”的方法被证明是有力的，因为它在bmly6chi单核细胞中鉴定了增殖性过渡期前单核细胞(tpmo)(图13)，这是本发明人最近表征的(chong等，2016)。总之，基于细胞周期的方法已经鉴定了嗜中性粒细胞谱系中的异质性，并揭示了推定的增殖性嗜中性粒细胞前体，发明人将其称为前嗜中性粒细胞(preneu)。preneu形成与cxcl12丰富的网状(car)细胞紧密接近的簇造血谱系存活和发育需要特化的bm生态位(niche)因子以从hsc和hpc生成成熟的造血细胞(frenette等，2013)。由于preneu表现出增殖活性(图6b和2c)，本发明人接下来研究了它们是否定位在特化的生态位中。放大的股骨区域(图6d)表明，s100a9+fucci-(s-g2-m)+preneu在体内优先在簇中发现，与它们的增殖活性一致(图6d)。此外，preneu位于cxcl12趋化因子表达细胞附近(图6e)。由于car细胞和内皮细胞支持hsc和hpc的生长(anthony和link，2014)，本发明人接下来怀疑preneu是否优先位于紧密接近这些bm生态位细胞处。因此，本发明人定量了preneu(s100a9+fucci-(s-g2-m)+)或嗜中性粒细胞(s100a9+fucci-(s-g2-m)-)与最近的car细胞(cxcl12-dsred+)和内皮细胞(层粘连蛋白+)之间的距离。通过这样做，发现preneu和嗜中性粒细胞都不与bm内皮细胞特定地接触(图6e和6f)。相反地，发现大多数preneu，而不是嗜中性粒细胞，位于距离car细胞＜5μm的簇中(图6e和6f)。由于car细胞产生大量的cxcl12，使用嗜中性粒细胞特异性cxcr4缺陷型小鼠(称为s100a8crecxcr4fl)。通过这样做，本发明人检测到与野生型对照相比s100a8crecxcr4fl中bmpreneu降低50％。相反地，cxcr4功能获得性突变(称为cxcr4whim)显示与野生型对应物相比bmpreneu增加约2倍(图6g)。总之，数据表明，增殖的preneu簇紧密接近car细胞，并且通过cxcr4保留在bm中。嗜中性粒细胞在其整个发育中表达不同的遗传特征虽然基于细胞周期的方法已经鉴定了增殖性preneu，但是它们如何可以安排到嗜中性粒细胞谱系中仍然不清楚。为了解决这个问题，在ckit+cxcr4+preneu排除的情况下分析lin-gr1+cd11b+嗜中性粒细胞级分(图7a和14a)。虽然血液嗜中性粒细胞主要是ly6g+和cxcr2+，bm嗜中性粒细胞对于这两种标记物是异质的，将它们分离成类似血液嗜中性粒细胞的ly6g+cxcr2+嗜中性粒细胞和基于cxcr2的缺乏而似乎未成熟的ly6glo/+cxcr2-嗜中性粒细胞群体(图7a)。为了更好地理解preneu、未成熟嗜中性粒细胞(ly6glo/+cxcr2-；称为未成熟的neu)和成熟嗜中性粒细胞(ly6g+cxcr2+；称为成熟的neu)之间的发育关系，分选这三个亚群，并将它们的形态与分选的gmp和血液嗜中性粒细胞进行比较。虽然gmp显示出大部分未紧缩的细胞核与未成熟的胞质溶胶，但嗜中性粒细胞逐渐将其细胞核紧缩，从preneu的环形形状至bm成熟的和血液嗜中性粒细胞的多分段形状(图7b)。在脾中也鉴定出preneu和未成熟的neu(图14b和14e)，但数量远少于bm(图14c和14d)，并且这些细胞不存在于血液中(数据未显示)。本发明人接下来通过全转录组测序(rnaseq)确定了这些嗜中性粒细胞前体的分子特征如何不同。所有转录物的主成分分析(pca)揭示了所有亚群之间的不同基因表达谱(图7c)。并且，尽管gmp、preneu和未成熟neu显示不同的基因特征，但使用pearson相关矩阵，bm成熟neu和血液neu显示相似的基因表达谱(图7d)。虽然基于有限的表型分析bm未成熟neu和成熟neu仅通过cxcr2表达是可区分的，但这两个亚群显示具有超过3000个差异表达的基因的巨大转录组学差异(图7d和14f)。接下来将20％的最可变基因绘制在热图上，并鉴定了在嗜中性粒细胞发育期间差异调节的七个不同的基因簇(图7e)。在嗜中性粒细胞发育期间两个基因簇(1和2)上调，并且包括参与趋化作用、嗜中性粒细胞运动性(簇1)和对微生物刺激的反应(簇2)的基因(图7f和7g)。相反地，两个基因簇(5和6)在嗜中性粒细胞发育期间下调，并且由参与细胞周期和基因表达调节的基因组成(图7f和7g)。由于rnaseq分析揭示了在嗜中性粒细胞发育期间细胞周期相关基因表达的进行性降低，本发明人接下来确定了它们在其谱系发育中丧失其增殖能力的精确点。使用双重fucci报告系统474(s-g2-m)/639(g0-g1)(tomura等，2013)，发现preneu显示处于s期细胞的最高量，而未成熟neu突然停滞细胞周期并且在成熟为成熟neu后逐渐进入g0期(图7h和14h)。与这些结果一致，发现gmp到成熟neu之间细胞周期相关基因的下调，包括mki67、cdk1和top2a(图14g)。已经确定这些嗜中性粒细胞亚群参与细胞周期的不同阶段，接下来研究这些差异如何能够转化为生物学功能。为了解决这个问题，进行了两天的preneu、未成熟和成熟neu的体外培养。虽然培养物中未成熟和成熟嗜中性粒细胞数量迅速下降，但发现preneu可以在培养物中扩增(图7h和7i)。集落形成测定也揭示preneu分裂但不形成集落(不像gmp那样)，而未成熟和成熟嗜中性粒细胞根本不分裂(图14j)。总之，本发明人表征了在表型、形态和转录上不同的三个bm嗜中性粒细胞的离散的亚群。preneu定向于嗜中性粒细胞谱系虽然当前结果提出了从preneu到未成熟neu和成熟neu的成熟过程，但是preneu是否完全定向于嗜中性粒细胞谱系仍然不清楚。为了解决这个问题，本发明人首先比较了嗜中性粒细胞和单核细胞谱系成员以及gmp的转录组学特征(图8a)。所有转录物的pca表明，preneu与嗜中性粒细胞谱系的成员例如未成熟的neu，比它们与单核细胞谱系的成员更相似(图8a)。为了进一步理解嗜中性粒细胞亚群的发育连续性，使用来自这些亚群的基因表达数据，并通过最佳叶排序(olo)进行分层聚类。通过该方法获得的树状图确定了从gmp到preneu、未成熟neu、成熟neu和最终到血液嗜中性粒细胞的发育顺序(图15a)。本发明人通过设计基于cre的命运图谱策略以跟踪preneu及其后代的发育来验证该结果。发明人将他们的策略基于s100a8的表达，因为发现该基因仅从preneu阶段选择性上调，但在gmp和来自单核细胞谱系的细胞中最低程度地表达，这与先前公布的数据一致(图8b和15b)(passegue等，2004；reber等，2017)。s100a8cre小鼠与rosa26lsl-yfp一起杂交，并在髓样细胞发育期间测定重组率。gmp未显示可检测的重组，而preneu显示～40％的重组率，其在未成熟、成熟和血液嗜中性粒细胞中逐渐增加，达到～80％的重组(图8c)。使用基于lyz2cre的策略发现了类似的结果(图15c和15d)。相反地，其它髓样细胞如单核细胞和嗜酸性粒细胞显示＜10％的重组率(图8c)。总之，这些结果表明preneu仅产生未成熟的和成熟嗜中性粒细胞。接下来通过将gfp+preneu转移到野生型接受体的bm中来体内验证这些结果，其在一天后产生未成熟neu并且在一天后分化成成熟neu(图8d)。重要的是，preneu没有产生单核细胞、嗜酸性粒细胞或其它细胞谱系，这进一步证实了命运图谱分析(图8d)。为了进一步建立preneu在体内的发育时间表，将其固有的高增殖能力用作标志物(图3h和s3h)。使用仅掺入活跃分裂细胞如preneu的5-溴-2'-脱氧尿苷(brdu)，从而允许如先前用于单核细胞的那样跟踪它们随时间的分化(yona等，2013)。如所预期的，在施用2小时后，只有preneu是brdu+(图8e)。使用这种方法，发现preneu在24小时后逐渐分化成未成熟neu，在48小时后分化为成熟neu，并且在72小时后最终排出到循环中(图8e)。此外，用抑制胸苷合成并引起分裂细胞经历凋亡的化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fu)处理，触发gmp、preneu、未成熟和成熟neu的连续丧失(图8f)。此外，通过采用图5c中进行的类似工作流程来确认preneu在人中的存在。为了检测人bm中的推定的嗜中性粒细胞前体(图15e)，人工设门cd15+cd66b+总嗜中性粒细胞，并鉴定了增殖性(idu+)和非增殖性(idu-)嗜中性粒细胞之间差异表达的标记物，包括cd10、cd16、cd49d和cd101(图15f和15g)。使用这种策略，鉴定了preneu、未成熟和成熟neu的人等同物(图15h-k)。类似于小鼠，血液中几乎不存在preneu和未成熟neu，从而验证了该工作流程(图15j)。总之，结果提供了证据表明preneu在小鼠和人中都作为嗜中性粒细胞谱系的增殖前体。preneu向成熟neu的发育伴随着与成熟相关的功能改变。迄今为止，数据表明发育过程发生在从preneu到未成熟neu和最终到成熟neu。为了进一步了解在这种成熟过程中发生的功能过程，分析了在髓样细胞发育的不同阶段涉及的转录因子(tf)的基因表达(图9a)。如所预期的，多能gmp高表达cebpa，其是粒细胞生成启动所必需的，以及参与其它髓系谱系发育的tf如irf8、gata1和gata2(fiedler和brunner，2012；yaniz等，2015)。相反地，preneu高表达gfi1和cebpe，这两种tf对早期嗜中性粒细胞分化至关重要(hock等，2003；yamanaka等，1997)。最后，成熟和循环的嗜中性粒细胞显示cebpd和spi1(pu.1)的高表达，这与它们在终末粒细胞生成中的作用一致(borregaard，2010)(图9a)。来自c/ebp家族的tf促进颗粒相关酶的表达。具体而言，c/ebpα诱导初级颗粒酶(如mpo)的表达(ford等，1996)，而c/ebpε和c/ebpδ分别促进次级(如ltf)和三级颗粒酶(如mmp8)(gombart等，2003)。由于观察到这些tf跨嗜中性粒细胞谱系的高度协调表达(图9a)，接下来确定该模式是否与颗粒表达相关。实际上，尽管初级颗粒主要在gmp阶段表达，但次级颗粒大多数在preneu和未成熟neu中形成，而三级颗粒与成熟neu相关，从而与c/ebpα、c/ebpε和c/ebpδ的表达模式相匹配(图9a和9b)。接着确定在分化的不同阶段发生的功能差异。为此，观察了参与活性氧种类(ros)产生、吞噬作用和趋化作用的关键基因(图9c、9f和9g)。在成熟neu中发现这些基因的最高表达(图9c、9f和9g)。这与成熟neu相比于嗜中性粒细胞谱系的其它群体在佛波醇豆蔻酸酯乙酸酯(pma)刺激时产生ros(图9d)和吞噬细菌(图9e)的优越能力有关。此外，发现preneu具有降低的迁移能力，因为成熟neu迅速地向坏死的核心群聚，而preneu响应于无菌损伤而不动(图9h)。总之，本发明人发现嗜中性粒细胞谱系在发育期间的进行性功能成熟，其中成熟neu具有全范围的嗜中性粒细胞效应器功能。c/ebpε缺陷损害preneu和下游嗜中性粒细胞群体的发展。c/ebpε是在小鼠和人中产生次级颗粒的关键tf(gombart等，2003；yamanaka等，1997)。然而，c/ebpε在嗜中性粒细胞发育中的确切参与仍然不清楚。由于在preneu群体中检测到cebpe表达的强烈上调(图9a)，本发明人假设c/ebpε可能参与gmp向preneu的转变。为了对此进行检查，在cebpe-/-和wt动物之间比较bm中的gmp、preneu、未成熟和成熟neu数目(图10a)。观察到preneu和下游群体严重减少，而gmp在cebpe-/-小鼠中积累，这支持了cebpe对于gmp向preneu的转变是重要的(图10a)。相反，在cebpe-/-小鼠中发现tpmo和ly6chi单核细胞数量的增加(图10b)，这可能表明gmp异常分化为单核细胞命运。为了证实c/ebpε在竞争环境中在嗜中性粒细胞发育中的作用，产生了具有cd45.1+wt和cd45.2+cebpe-/-bm细胞的等量混合物的bm嵌合体(图10c)。与早期结果一致(图10a)，preneu和下游嗜中性粒细胞群不是来源于cebpe-/-细胞，而是来源于wt细胞。由于preneu的发育在c/ebpε-缺陷动物中受到高度影响，因此接下来研究在炎症反应期间缺乏preneu如何导致功能性后果。使用免疫复合物介导的炎症的嗜中性粒细胞依赖性模型[反向被动arthus(rpa)反应](li等，2016)。在此，观察到反应部位的嗜中性粒细胞浸润减少(图10d)和血管渗漏减少(图10e)。中级盲肠结扎和穿孔(clp)败血症模型也显示c/ebpε-缺陷型小鼠与野生型对照小鼠相比在血液和腹膜腔中具有较差的细菌清除(图10f和10g)。总之，这些数据表明，在cebpe-/-小鼠中不存在preneu导致下游嗜中性粒细胞群体的发育受损。preneu在炎症期间在骨髓和脾中扩增数据(图10)表明，preneu的不存在导致缺乏嗜中性粒细胞介导的应答。由于preneu在稳态下充当增殖性前体，本发明人接下来试图理解preneu在需要增加的髓细胞生成的疾病如败血症和癌症期间是如何受影响的。具体地，在败血症时发现bm和脾中preneu数目增加(图11a-b和16a)。另外，在胰腺癌原位肿瘤模型中观察到类似的效果(图11c-d和16b)。值得注意的是，虽然在这两种模型中检测到bmpreneu数目的2至4倍增加，但是观察到脾preneu数目的显著和急剧＞10倍增加(图11b和d)。总之，这些结果突出了bm和脾preneu在炎性病况期间的扩增，表明髓内和髓外粒细胞生成增加。cd101neg未成熟嗜中性粒细胞与肿瘤进展有关嗜中性粒细胞正日益被认为是肿瘤发生中的重要参与者。然而，相矛盾的证据表明，嗜中性粒细胞可以具有促肿瘤和抗肿瘤特性两者(coffelt等，2016；nicolas-avila等，2017)。据推测，这些相反的观察结果可以由肿瘤中嗜中性粒细胞的不同成熟状态来解释，如其他人最近所提出的(coffelt等，2016)。为了说明该假设，接下来研究是否可以使用cxcr2表达在原位胰腺肿瘤中鉴定未成熟和成熟neu，因为该标记物在bm中这两个群体之间差异表达(图7a)。然而，与bm和血液中不同，发现肿瘤中cxcr2的强烈下调(图11e)。为了克服在肿瘤中分离未成熟和成熟neu的挑战，筛选差异表达的基因(deg)以鉴定能够在肿瘤中清楚地区分这些细胞的标记物。在这些deg中，鉴定出cd101，一种在bm成熟和血液neu中显著上调的表面标记物(图11f)。为了验证，经由如前所示的设门策略鉴定bm、血液和脾中的gr1+cd11b+嗜中性粒细胞(图14a和14b)。重要的是，用cd101分离嗜中性粒细胞允许我们区分匹配cxcr2表达模式的两个嗜中性粒细胞群体，使得未成熟neu可定义为ly6glo/+cxcr2-cd101-，而成熟neu可定义为ly6g+cxcr2+cd101+(图11g)。值得注意的是，cd101-未成熟neu在基线条件下几乎不存在于循环中(图11g)。使用cd101区分未成熟neu，首先确定该方法是否允许在循环中检测它们。将g-csf，一种在癌症期间类似上调的强嗜中性粒细胞动员剂(kowanetz等，2010)施用给小鼠。使用这种刺激，在血液中检测到未成熟的neu，并且在处理后它们的数量在循环中维持长达四天(图16c-d)。由于未成熟的neu能够进入循环，本发明人接下来解决了这些细胞是否具有迁移到组织中的能力。在无菌激光损伤模型中，未成熟和成熟的neu都可以同样地朝向损伤核心群聚(图16e)。这与表现出较差间隙(interstitial)运动性的preneu形成鲜明对比(图9h)，并且表明未成熟neu已经具有功能性迁移机制。已经确定cd101在g-csf刺激过程中将未成熟的neu与成熟的neu分开，这种策略接下来在肿瘤环境中得以验证。与初始小鼠相比，具有胰腺肿瘤的小鼠在血液和胰腺中显示增加数量的未成熟neu(图11h-i)。此外，血液和胰腺中未成熟neu的数目之间的正相关性表明这些细胞从循环中活跃地募集到肿瘤部位(图11j)。为了测试未成熟neu的浸润是否有助于肿瘤进展，将荷瘤小鼠根据它们的肿瘤重量分成两组，并发现具有较高肿瘤负荷的小鼠显示未成熟neu向胰腺中的较高浸润(图11k-m)。另外，具有较高肿瘤负荷的小鼠在循环中具有明显更多的未成熟neu，但成熟neu没有显著差异(图11n)。值得注意的是，血液中未成熟neu的数目与胰腺的重量高度相关(图11o)。相反，循环的成熟neu和ly6chi单核细胞与胰腺重量的相关性较差(图16f-g)，这表明血液中存在未成熟neu的存在可能作为疾病进展的生物标志物。总之，本发明人已经鉴定了区分癌症中未成熟和成熟neu的策略，并揭示了循环的未成熟neu的数目与增加的肿瘤负荷有关。利用增殖活性鉴定人嗜中性粒细胞亚群细胞增殖是造血作用的中心。经典模型提出了分层次序，其开始于造血干细胞(hsc)的细胞扩增，最终导致所有血细胞谱系的产生。当少量缓慢增殖的hsc分化成造血祖/前体细胞(hpc)时，hpc通过降低其自更新能力开始向其各自细胞谱系定向，取而代之的是广泛增殖以满足成熟的谱系特定细胞的需求。在hpc中，粒细胞-单核细胞祖细胞(gmp)产生单核细胞、树突细胞和粒细胞群，例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。最近，已经正式鉴定出gmp下游的定向祖细胞，包括仅能形成单核细胞的共同单核细胞祖细胞(cmop)。然而，从gmp到功能成熟嗜中性粒细胞的发育轨迹仍然没有确定。为了解决这个问题，本发明人采用质谱细胞术并测量40种不同标记的表达以深度表现人骨髓白细胞群体的表型。发明人接下来利用t-分布随机邻域嵌入(t-sne)算法来在2d图上显现细胞之间的相似性(图1a)。通过这样做，可以鉴定所有主要谱系，其中嗜中性粒细胞是频率方面最重要的细胞类型(图1a)。本发明人还使用易于通过质谱细胞术检测的5-碘-2'-脱氧尿苷(idu)来检测处于细胞周期s期的细胞。由于bm祖细胞/前体经历广泛的增殖，本发明人假设推定的嗜中性粒细胞前体将是高度增殖性的，因此将能够掺入idu。因此，本发明人人工鉴定了cd15+cd66+总嗜中性粒细胞，以及设门了idu+增殖性嗜中性粒细胞和idu-非增殖性嗜中性粒细胞(图1b)。然后将这两个群体之间的表面标记物的中值表达绘制在热图上，以鉴定能够将推定的嗜中性粒细胞前体与其它嗜中性粒细胞区分开的标记物(图1c)。使用该方法，本发明人发现了包括cd10、cd16、cd49d和cd101在内的在增殖性和非增殖嗜中性粒细胞之间差异表达的标记物。人嗜中性粒细胞亚群的表型特征在发现增殖性和非增殖性嗜中性粒细胞之间差异表达的标记物后，本发明人接着使用这些标记物来正式鉴定嗜中性粒细胞前体群。为此，本发明人对谱系阴性细胞(cd3/cd19/cd56/cd14)人工设门，排除早期祖细胞(cd34+)和嗜酸性粒细胞(siglec8+或siglecf+)，以获得cd15+cd66b+总嗜中性粒细胞(图2a)。从总的嗜中性粒细胞中，本发明人发现了匹配idu+增殖性嗜中性粒细胞概况的cd49d+cd101-嗜中性粒细胞群体，并将该群体命名为前嗜中性粒细胞(preneu)(图2a)。本发明人还发现了cd49d+cd101-嗜中性粒细胞的另一个群体，并将这个群体命名为原嗜中性粒细胞(proneu)(图17、图18和图19)。尽管据报道血液嗜中性粒细胞显示cd10和cd16的同质表达，但本发明人发现bm嗜中性粒细胞对于这两种标记物是异质的。因此，本发明人将类似于血液嗜中性粒细胞的成熟嗜中性粒细胞定义为cd10+cd16+，并且发现了对这两种标记物都阴性的未成熟嗜中性粒细胞的群体(图2a)。在描绘这三个bm嗜中性粒细胞亚群后，本发明人筛选了39个表面标记物以深度表现这些群体的表型(图2b)。从这些标记物中，本发明人鉴定了cd10和cd101是最具信息性的，并且将preneu定义为cd10-cd101-，未成熟嗜中性粒细胞定义为cd10-cd101+，而成熟嗜中性粒细胞定义为cd10+cd101+(图2c)。在表征人bm嗜中性粒细胞亚群的表型后，本发明人接着研究了它们的组织分布。虽然在bm中发现相对高频率的preneu和未成熟嗜中性粒细胞，但是这些亚群在外周循环中大部分不存在(图3a)。这与嗜中性粒细胞发育的紧密调节一致，使得只有完全成熟嗜中性粒细胞具有在静息条件下离开bm并进入血流的能力。为了理解这些嗜中性粒细胞亚群在组织之间是否相似，发明人使用idu掺入以探测这些细胞的细胞周期状态。这里，本发明人发现preneu在bm和血液中显示相似的idu掺入，表明嗜中性粒细胞亚群在不同组织中显示相似的增殖能力(图3b)。嗜中性粒细胞鉴定策略的应用和分离迄今为止，还没有良好的嗜中性粒细胞发育分类方法。用这种新建立的方法，可以鉴定处于各种发育阶段的嗜中性粒细胞的亚群。当前的方法将允许适当表征循环中或发炎组织/器官(例如肿瘤)中的嗜中性粒细胞的不同亚群的存在，因为嗜中性粒细胞是响应于炎症反应而动员/募集的主要白细胞，因此嗜中性粒细胞的特定亚群的频率可以用作疾病预后/预测标记物。由于preneu显示具有增殖能力，本发明人已经测试了定向于(小鼠)preneu的细胞谱系，以及这些前体在临床前模型中再增殖嗜中性粒细胞的能力(图4)。为此，本发明人观察到转移的preneu特定地分化成成熟的cd10+cd101+嗜中性粒细胞，而不是其他髓样细胞，表明这些前体可以移植到免疫受损的患者，例如化疗患者，以暂时地增加他们血液中的嗜中性粒细胞计数以用于保护免受感染。由于preneu可以被转移和增殖，preneu可以是替代和/或补充日常输注的有价值的治疗选择。preneu而不是成熟嗜中性粒细胞的转移可以延长治疗之间的时间，例如，可以预期preneu的转移有三(3)至五(5)天的周转时间。原嗜中性粒细胞材料和方法用于流式细胞术和facs的细胞处理通过在含有2％胎牛血清(fbs)和2mmedta的pbs中轻轻粉碎骨髓腿节、胫骨、骨盆骨、肱骨和脊柱骨，获得来自野生型小鼠的骨髓细胞。对于人类样品，根据他们各自的机构评审委员会(irb)从取得知情同意的供体获得细胞。然后用1x红细胞(rbc)裂解缓冲液(ebioscience)将样品裂解5分钟，用pbs洗涤，以400g离心5分钟。然后用fc-阻断剂(分别为人或小鼠)对样品染色15分钟，接着在4℃加入适当的缀合有荧光团的抗体达20分钟。然后在使用bdariaii进行细胞分选或使用bdlsrii进行分析之前洗涤细胞。过继性细胞转移如前所述(chong2016)，将分选的ugfp+proneu(1×105个细胞)bm内转移到野生型接受体中。简言之，用氯胺酮(150mg/kg)/甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉接受体小鼠，并将其右腿剃毛以暴露膝盖骨。将分选的proneus以1×104细胞/μl的浓度重悬于1xpbs中，并使用29号胰岛素针将10μl体积通过膝盖骨施用到胫骨中。在细胞转移后24、48和60小时，收集胫骨，染色并通过流式细胞术分析。体外增殖测定将分选的细胞(每个细胞亚群3×104个)一式三份铺于96孔板上，并在37℃、5％co2下在具有25mmhepes和l-谷氨酰胺(chemtron)的含10％(体积/体积)fbs、1mm丙酮酸钠、青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml)的iscove改良的dulbecco培养基中培养。将50ng/mlscf、20ng/mllif、10ng/mlil-3、20ng/mlil-6(全部来自stemcelltechnologies)的组合加入细胞培养基中。然后在4天的时间内分析细胞。集落形成测定将分选的细胞(每个细胞亚群3×104个)一式两份铺板于60mm平皿上，并在37℃、5％co2下在含有25mmhepes和l-谷氨酰胺(chemtron)的含10％(体积/体积)的fbs、1mm丙酮酸钠、青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml)的2％甲基纤维素methoculttm培养基中培养。将50ng/mlscf、20ng/mllif、10ng/mlil-3、20ng/mlil-6(全部来自stemcelltechnologies)的组合加入细胞培养基中。嗜中性粒细胞前体的转录调节将所示的祖细胞亚群相应地单细胞分选到含有10mmdntp和1％bsa的96孔板中。使用1μlrnase抑制剂和19μl0.2％(体积/体积)tritonx-100溶液进行单细胞裂解。将细胞在72℃温育3分钟，然后离心。根据制造商的方案(illumina)进行逆转录和pcr步骤。然后用hiseq2500对dna进行测序。fastq文件形式的rna-seq数据随后使用star比对软件图谱匹配至小鼠基因组构建mm10。然后基于gencodem7注释使用featurecounts(subreak程序包的一部分)对匹配的读段计数。然后使用seurat分析数据。结果表型信息鼠原嗜中性粒细胞(proneu)由ckithily6c+cd106+cd115-cd205-cd11blogr1lo表征。鼠前嗜中性粒细胞(preneu)由ckitloly6c+siglecf-cd115-cd205+cd11bhigr1hicxcr4hi表征。人原嗜中性粒细胞(proneu)由cd34-cd66b+cd15+cd71+cd49d+cd101-cd11b-限定。而人前嗜中性粒细胞(preneu)由cd66b+cd15+cd71+cd49d+cd101-cd11b+表征。这些差异可以在图17a和图18中清楚地看到。与前嗜中性粒细胞的比较除了它们的表型差异之外，原嗜中性粒细胞(proneu)与前嗜中性粒细胞(preneu)相比增殖潜力更高。这可以从图17b和图17c中清楚地看出。正在进行研究以显示人嗜中性粒细胞前体中的这种差异。而且，就嗜中性粒细胞个体发育而言，原嗜中性粒细胞(proneu)与前嗜中性粒细胞(preneu)相比分化更早。这在图17d的体内数据中得到支持，因为1天后原嗜中性粒细胞(proneu)可以分化成前嗜中性粒细胞(preneu)。本领域技术人员还应当理解，可以组合上述特征的变化和组合(不是备选或替代)以形成落入本发明的意图范围内的其它实施方案。嗜中性粒细胞前体的转录调节在单细胞水平上，原嗜中性粒细胞(proneu)在转录上不同于前嗜中性粒细胞(preneu)，如图20a所示。与单核细胞前体(cmop)和前嗜中性粒细胞(preneu)相比，原嗜中性粒细胞(proneu)表达水平高得多的初级颗粒相关基因。此外，在图20b所示的嗜中性粒细胞分化所需的关键已知转录因子的表达水平方面，进一步理解嗜中性粒细胞定向的特化。文献(giladi等，2018，yanez等，2018，olsson等，2016)中描述的常见嗜中性粒细胞相关基因也在图20c中指出。认为这些基因代表前体细胞的一个亚群。然而，本公开中的数据显示了原嗜中性粒细胞(proneu)和前嗜中性粒细胞(preneu)之间专有且共享的基因标签。尽管越来越了解嗜中性粒细胞异质性，但其从多能gmp到成熟嗜中性粒细胞的发育途径和功能性质仍然难以捉摸(silvestre-roig等，2016)。这里，本发明人已经用最新的分析方法建立了一种方法学框架，以鉴定并提供嗜中性粒细胞亚群在其发育途径中的深入功能表征。具体而言，本发明人鉴定了增殖性嗜中性粒细胞前体群，本发明人将其称为原嗜中性粒细胞(proneu)和前嗜中性粒细胞(preneu)，其在bm中产生中间群(未成熟neu)，然后分化成成熟嗜中性粒细胞。所采用的败血症和肿瘤模型进一步揭示了proneu、preneu和未成熟neu的独特作用，其中未成熟neu的数目与肿瘤负荷相关。更重要的是，本发明人还通过将cd101鉴定为在循环和肿瘤部位中将未成熟neu与成熟neu分离的标记物，解决了在炎症期间区分嗜中性粒细胞亚群的持续挑战。因此，该研究通过提供更好地理解嗜中性粒细胞亚群在稳定状态和炎症状态中的功能特征的框架，填补了嗜中性粒细胞发育途径中的长期空白。历史上，嗜中性粒细胞的发育通过密度梯度分离技术然后用giemsa染色对其鉴定来表征(bjeregard等，2003)。虽然这种方法提供了关于嗜中性粒细胞发育和成熟的有用认识，但是它缺乏在单细胞分辨率下描绘嗜中性粒细胞异质性的精确性，并且不允许下游功能和分子表征。这里，使用基于质谱细胞术的分析方法来鉴定增殖的造血细胞上差异表达的表面标记物。然后将这些表面标记物并入随后的fucci-(s-g2-m)小鼠中的流式细胞术分析中，这导致本发明人鉴定了三种bm嗜中性粒细胞亚群，即：preneu、未成熟neu和成熟neu。值得注意的是，这种方法在小鼠和人中都是稳健的，并且也可以应用于其他白细胞群体。在进一步研究中，本发明人还发现了第四种bm嗜中性粒细胞亚群原嗜中性粒细胞(proneu)。虽然多能前体定向于细胞限制性前体分别涉及谱系特定基因和无关基因的上调和沉默(fiedler和brunner，2012)，但是前体如何定向于嗜中性粒细胞谱系仍然不清楚。bm嗜中性粒细胞亚群的转录组学分析揭示了在preneu中irf8、gata1、gata2的tf沉默和gfi1及cebpe的激活。已知gfi1对于多能前体向粒细胞谱系的定向是关键的(hock等，2003)。因此，在proneu和/或preneu中gfi1表达的特定上调进一步表明这些细胞是定向于嗜中性粒细胞谱系的第一前体。本发明人证实了c/ebpε在preneu向下游嗜中性粒细胞群体发展中的重要性，因为在cebpe-/-小鼠中不存在功能成熟嗜中性粒细胞。本发明人还验证了嗜中性粒细胞的发育层级，以证实这样的观点，即，增殖性preneu和/或preneu在分化成功能成熟的neu之前经历未成熟neu的中间发育期。与该发现一致，据信在人体中该轨迹的映射将提供对当前建立的嗜中性粒细胞发育层级的进一步了解。紧急粒细胞生成期间的骨髓前体扩增是满足功能性成熟嗜中性粒细胞的需要所必需的(manz和boettcher，2014)。因此，败血症和肿瘤模型证实了preneu在炎症期间在脾和bm中的扩增。两种可能性可以解释这种现象：脾中髓外粒细胞生成的激活；或将bmpreneu部署到髓外位置以响应炎性刺激。当前的发现排除了后一种可能性，因为preneu在循环中不存在(数据未显示)并且运动不良。增殖性preneu的固着性质符合癌症生物学中的"去或生长(goorgrow)"假说，其假定细胞骨架机制不能同时满足增殖和迁移的需要(garay等，2013)。因此，脾preneu的扩增最可能归因于髓外粒细胞生成提高，其经由脾微环境中gm-csf和il-3的产生增加(weber等，2015)。与proneu和/或preneu相反，未成熟neu是非增殖性的，但是在炎性病况期间可以进入血流。重要的是，未成熟的neu可以与成熟neu一样有效地向损伤部位迁移。因此，这些数据表明，虽然proneu和/或preneu是精细调节嗜中性粒细胞的输出的增殖性前体；未成熟的neu可以作为能替代地部署到炎症部位的储库。目前还不清楚这种未成熟neu“过早”动员到循环和炎症局部部位的含义是什么。然而，肿瘤研究表明循环的未成熟neu数目和肿瘤负荷之间的强相关性，表明它们的数目可用作肿瘤负荷的预后测量。这些发现证实了最近在荷瘤小鼠中观察到具有未成熟或异常核形态的嗜中性粒细胞(coffelt等，2015)，其与疾病结果呈负相关(sagiv等，2015；yang等，2011)。该研究突出了疾病期间未成熟neu的重要作用，并开启了关于未成熟neu和粒细胞髓源抑制细胞(g-mdsc)之间关系的潜在研究主题。总之，该研究通过鉴定确保稳态期间的供应和应激下的早期应答的特化粒细胞群体，提供了对嗜中性粒细胞发育的理解的进步。更重要的是，当前模型也可以作为在生理和疾病状态下粒细胞生成的再检验的基础平台，以及作为用于嗜中性粒细胞相关疾病的新治疗干预的基础。参考文献1.akashi,k.,traver,d.,miyamoto,t.,andweissman,i.l.(2000).aclonogeniccommonmyeloidprogenitorthatgivesrisetoallmyeloidlineages.nature404,193-197.2.anthony,b.a.,andlink,d.c.(2014).regulationofhematopoieticstemcellsbybonemarrowstromalcells.trendsimmunol35,32-37.3.balabanian,k.,brotin,e.,biajoux,v.,bouchet-delbos,l.,lainey,e.,fenneteau,o.,bonnet,d.,fiette,l.,emilie,d.,andbachelerie,f.(2012).properdesensitizationofcxcr4isrequiredforlymphocytedevelop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性粒细胞(proneu)和前嗜中性粒细胞(preneu)群是谱系定向的，并且可以在输注治疗中具有潜在的应用。目前对嗜中性粒细胞减少患者的现有技术治疗(在化疗之前)可以包括粒细胞输注和g-csf注射。这些粒细胞是短寿命的，并且需要大量以赋予任何的保护功能。因此，粒细胞输注通常必须频繁地进行。相反，使用前嗜中性粒细胞可以允许以更有效的方式将嗜中性粒细胞供应给接受体。更进一步地，使用原嗜中性粒细胞可在需要时提供更大的嗜中性粒细胞供应源。例如，增殖性嗜中性粒细胞可从与接受体hla匹配的供体获得/供应。如本领域技术人员所理解的，hla匹配允许移植细胞(即增殖性嗜中性粒细胞)更好的移植和接受。本公开的特征包括：·总嗜中性粒细胞可基于细胞周期活性和通过质谱细胞术鉴定的细胞表面标记物分成4种不同群体。·包含原嗜中性粒细胞(proneu)和前嗜中性粒细胞(preneu)的增殖性群体和包含未成熟嗜中性粒细胞的非增殖性群体主要位于健康患者的骨髓中，与成熟嗜中性粒细胞不同。·这些嗜中性粒细胞亚群可以使用一种或多种表面标记物来描绘，例如：cd101或cd10。·血液循环中原嗜中性粒细胞(proneu)、前嗜中性粒细胞(preneu)和未成熟嗜中性粒细胞的量的变动可用作炎症的生物标记物。·原嗜中性粒细胞(proneu)在某些需要的情况下可以提供更大的嗜中性粒细胞供应来源。当前第1页12当前第1页12