用于检测花生过敏的肽和方法与流程

[0001]
本公开部分涉及用于诊断花生过敏并且用于确定过敏受试者是否有可能随着长大而摆脱过敏的肽生物标记，包括使用它们的方法和试剂盒。


背景技术：

[0002]
食物过敏是成人和儿童中的常见问题，并且症状的范围可从轻度口腔瘙痒到潜在危及生命的过敏性休克。目前通过皮肤点刺测试或口服激发并且测量特异性ige以及在一些情况下其他血清抗体(例如igg4)的血清水平来诊断食物过敏。尽管这些测试指示了临床反应的可能性，但它们不区分食物过敏的不同表型或提供预后信息。目前的过敏测试还对患者造成了一定程度的风险。目前的ige测试与患者实际临床灵敏度之间的关系很弱，通常将其定义为反应严重程度与引起反应的过敏原的量的组合。目前的测试的另一局限是不能确定儿科患者是否将随着长大而摆脱儿童期时的过敏。在这种情况下，特异性ige水平与临床过敏持续时间之间存在正但较弱的相关性。
[0003]
最近已提出，对食物过敏原的临床反应性可能在表位识别水平上与过敏原特异性ige更好地相关。已报道，患有持续性或更严重的过敏反应的患者识别较大量的ige表位，表明表位作图为过敏诊断和预测的另一种工具。斑点膜基免疫测定法(spot membrane-based immunoassay)已用于表位作图。在此系统中，在膜上合成肽，并将其与患者血清一起孵育。此过程需要较大量的肽，并且因此是易错、耗时、劳动密集且昂贵的。这种形式的免疫测定法还需要大量的患者血清。
[0004]
食物过敏的临床表现的显著异质性向成功的管理和治疗提出了挑战，并且因此，精准医学策略与改善预防、管理当前病例和开始食物过敏的新疗法高度相关。用于确定食物过敏内型、产生过敏的风险、反应严重程度以及治疗预后的灵敏度且特异性生物标记是通往精准医学道路的基本组分(sicherer等人,j.allergy clin.immunol.,2015,135,357-67)。在过去的十年中，许多研究评估了口服免疫疗法(oit)用于治疗持续性食物过敏的功效(wood等人,j.allergy clin.immunol.,2016,137,1103-1110)。在花生过敏方面，oit已显示具有可接受的安全性并证明了临床益处(bird等人,j.allergy clin.immunol.pract.,2017,5,335-344)。尽管临床反应性有所改善，但oit与显著的不良影响有关，其中一些经历过敏反应，并且15％至20％由于不良反应而被迫中断治疗(bird等人,j.allergy clin.immunol.pract.,2017；keet等人,j.allergy clin.immunol.,2012,129,448-455；longo等人,j.allergy clin.immunol.,2008,121,343-7；meglio等人,pediatr.allergy immunol.,2008,19,412-419；skripak等人,j.allergy clin.immunol.,2008,122,1154-60；staden等人,allergy,2007,62,1261-1269)。除不良反应外，一旦中断治疗，对oit的反应通常便不持续，即患者暂时对过敏原不敏感，但达不到耐受性(wood等人,j.allergy clin.immunol.,2016,137,1103-1110；burks等人,n.engl.j.med.,2012,367,233-243；burks等人,j.allergy clin.immunol.,2008,121,1344-1350；burks,arb.paul ehrlich inst.bundesinstitut impfstoffe biomed arzneim langen hess,
2013,97,122-123；gorelik等人,j.allergy clin.immunol.,2015,135,1283-1292；以及keet等人,j.allergy clin.immunol.,2013,132,737-739)。但是，明显的是，正在取得进展并且新的食物过敏疗法即将得到fda批准。这些治疗方法将得益于诊断和预后测试，所述诊断和预后测试将帮助患者及其医生在进入治疗时了解疾病的严重程度，在治疗的同时监测患者以在不良反应发生之前评估其进展或发作并且一旦中断治疗就跟踪患者状态。
[0005]
针对花生蛋白的ige抗体的产生对于花生过敏的发病机理是至关重要的。尽管已经生成了预测曲线来鉴定95％预测临床反应性的花生特异性ige浓度，但花生ige在较低的ige水平下预测性较差，而在较高的水平下，读数仅为二元的，并且因此难以用于帮助评估治疗的安全性或功效。这可能是由于测量了针对临床上不相关的花生组分的ige抗体。针对ara h 2的ige预测对花生的临床反应性(lieberman等人,j.allergy clin.immunol.pract.,2013,1,75-82)，但是在ara h 2水平类似的个体之间存在大量临床异质性。已经开发出包含覆盖主要过敏原的整个序列表位库的重叠肽的肽微阵列，以测量表位特异性免疫球蛋白应答(lin等人,j.allergy clin.immunol.,2009,124,315-22；和lin等人,j.allergy clin.immunol.,2012,129,1321-1328)。ara h 1、2和3中与ige结合的花生表位的数目预测反应严重程度(flinterman等人,j.allergy clin.immunol.,2008,121,737-743)。作为一种组分解析(component-resolved)诊断方法(immunocap)，针对花生ara h1、ara h2和ara h3的sige的存在指示“真”花生过敏和高的严重反应风险(例如，在诊断过敏中，sige＞0.35ku
a
/l的水平显示75-95％ppv，90％npv；kiernans等人,j.allergy clin.immunol.,2013,131,157-163)。


技术实现要素：

[0006]
历史上认为，人们对特异性蛋白产生出过敏反应，但化学和免疫应答却要细得多。对于整个花生提取物或甚至组分研究ige不能在分子水平上提供真应答的特异性。蛋白质沿其结构包含各种表位，这些表位是抗体在过敏应答期间自身连接的特异性靶标。因此，较高分辨率的过敏测试小组可以鉴定在患者中负责过敏应答的蛋白质内的特定表位。本文描述的方法部分基于以下前提：通过将在花生中发现的蛋白质细分为构成整个蛋白质的较短组分(表位)，可以基于它们如何结合每个表位来对抗体反应性进行分层，从而为每位患者建立表位结合模式并且实现更准确且更具预测性的诊断。
[0007]
如本文所述，所述方法将在花生中存在的蛋白质细分为较小的肽或由两个或多个氨基酸组成的化合物。然后将作图的肽分别与珠粒偶联，以允许高通量分析和表位结合评估。检查了患者ige应答的反应性，即那些在血流中充当“点燃过敏免疫应答的火的火柴”的抗体。在反应中，抗体连接到肽偶联的珠粒，并且所述方法被设计成分离并确定每种肽的个性化反应，因此临床医生可以更准确且完整地了解患者过敏概况。将结果用单个肽结果进行“作图”，创建用于分类患者的治疗应答图谱。
[0008]
本公开提供了用于在受试者中诊断花生过敏和/或花生过敏的严重程度的方法，其包括：在足以允许获自所述受试者的血清或血浆中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(aai)与一种或多种花生肽结合的条件下，将所述一种或多种花生肽与所述血清或血浆接触，其中所述一种或多种花生肽与固体支持体偶联，形成一种或多种aai-肽-固体支持体复合物；将aai特异性标记试剂与所述aai-肽-固体支持体复合物结合；以及检测所述aai特异
性标记试剂与每个aai-肽-固体支持体复合物的结合，以鉴定出与所述受试者的所述血清或血浆中的所述aai结合的一种或多种花生肽；其中在所述受试者的所述血清或血浆中的aai对至少一种花生肽的识别表明所述受试者对花生过敏。
[0009]
本公开还提供了用于在对花生过敏的受试者中检测对花生的临床耐受性的产生的方法，其包括：在足以允许获自所述受试者的血清或血浆中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(aai)与一种或多种花生肽结合的条件下，将所述一种或多种花生肽与所述血清或血浆接触，其中所述一种或多种花生肽与固体支持体偶联，形成一种或多种aai-肽-固体支持体复合物；将aai特异性标记试剂与aai-肽-固体支持体复合物结合；检测所述aai特异性标记试剂与每个aai-肽-固体支持体复合物的结合，以鉴定出与所述受试者的所述血清或血浆中的所述aai结合的一种或多种花生肽；以及将所述鉴定的与所述受试者的所述血清或血浆中的所述aai结合的一种或多种花生肽、或所述受试者的所述血清或血浆中所述aai的浓度，与先前鉴定的一组与所述受试者的所述血清或血浆中的所述aai结合的一种或多种花生肽、或所述受试者的所述血清或血浆中所述aai的先前浓度进行比较；其中在以下情况下指示对花生的临床耐受性的产生：所述受试者的所述血清或血浆中的ige aai所识别的花生肽的随后数目和/或所述受试者的所述血清或血浆中aai ige的随后浓度小于所述受试者的所述血清或血浆中的aai ige所识别的花生肽的先前鉴定的数目和/或小于所述受试者的所述血清或血浆中aai ige的先前浓度；并且/或者所述受试者的所述血清或血浆中的igg4 aai所识别的花生肽的随后数目和/或所述受试者的所述血清或血浆中aai igg4的随后浓度大于所述受试者的所述血清或血浆中的aai igg4所识别的花生肽的先前鉴定的数目和/或大于所述受试者的所述血清或血浆中aai igg4的先前浓度。
[0010]
本公开还提供了用于在对花生过敏的受试者中检测对花生过敏的治疗期间的过敏或不良事件的强度随时间的增加的方法，其包括：在足以允许获自所述受试者的血清或血浆中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(aai)与一种或多种花生肽结合的条件下，将所述一种或多种花生肽与所述血清或血浆接触，其中所述一种或多种花生肽与固体支持体偶联，形成一种或多种aai-肽-固体支持体复合物，并且其中所述一种或多种花生肽选自具有来自ara h 1过敏原的8至66位的至少3个连续氨基酸的肽、具有来自ara h 1过敏原的103至152位的至少3个连续氨基酸的肽、具有来自ara h 1过敏原的176至195位的至少3个连续氨基酸的肽、具有来自ara h 2过敏原的5至40位的至少3个连续氨基酸的肽、具有来自ara h 3过敏原的93至115位的至少3个连续氨基酸的肽、具有来自ara h 3过敏原的30至75位的至少3个连续氨基酸的肽和/或具有来自arah 3过敏原的152至167位的至少3个连续氨基酸的肽；将aai特异性标记试剂与所述aai-肽-固体支持体复合物结合；检测所述aai特异性标记试剂与每个aai-肽-固体支持体复合物的结合，以鉴定出与所述受试者的所述血清或血浆中的所述aai结合的一种或多种花生肽；以及将所述鉴定的与所述受试者的所述血清或血浆中的所述aai结合的一种或多种花生肽、或所述受试者的所述血清或血浆中aai的浓度，与先前鉴定的一组与所述受试者的所述血清中的所述aai结合的一种或多种花生肽、或所述受试者的所述血清或血浆中所述aai的先前浓度进行比较；其中在以下情况下指示对花生的过敏应答的强度增加：所述受试者的所述血清或血浆中的aai所识别的花生肽的随后数目或反应性模式、或所述受试者的所述血清或血浆中aai的随后浓度大于所述受试者的所述血清或血浆中的aai所识别的花生肽的先前鉴定的数目或反应性模式，或大于所述
受试者的所述血清或血浆中aai的先前浓度。
[0011]
本公开还提供了使婴儿对一种或多种花生过敏原敏感以诱导对花生的耐受性或非过敏性的方法，其包括向婴儿施用一种或多种花生肽，其中所述一种或多种花生肽衍生自ara h 1过敏原(seq id no:1)、ara h 2过敏原(seq id no:2)和/或ara h 3过敏原(seq id no:3)。
[0012]
本公开还提供了含有过敏原表位的花生肽的组，其包含多种花生肽，所述花生肽包含至少两种衍生自ara h 1过敏原(seq id no:1)、ara h 2过敏原(seq id no:2)和/或ara h 3过敏原(seq id no:3)的肽。
[0013]
本公开还提供了试剂盒，其包含：一种或多种衍生自ara h 1过敏原(seq id no:1)、ara h 2过敏原(seq id no:2)和/或ara h 3过敏原(seq id no:3)的含有过敏原表位的花生肽，其中每种花生肽与固体支持体偶联；以及过敏相关免疫球蛋白(aai)特异性标记试剂；包装在一起并包括使用说明。
附图说明
[0014]
图1显示了与研究开始时的基线访视相比，研究访视期间回避者与食用者之间的ige表位差异的代表性ige应答(v12-v1、v30-v1和v60-v1)。
[0015]
图2显示了与研究开始时的基线访视相比，研究访视期间回避者与食用者之间的igg4表位差异的代表性igg4应答(v12-v1，v30-v1和v60-v1)。
[0016]
图3显示了作为每次访视变化的基础的组之间的代表性ige应答。
[0017]
图4显示了在第60次访视时发生变化的代表性igg4应答。
[0018]
图5显示了在v60时回避者组中的代表性igg4应答。
[0019]
图6显示了与回避者相比，致敏的食用者中的代表性igg4表位扩增。
[0020]
图7显示了与基线访视相比，在1、2.5和5岁时进行的64种花生过敏表位测定和eb得分的代表性结果。
[0021]
图8显示了表位图谱的代表性结果。
[0022]
图9显示了训练结果中的代表性表位模型。
[0023]
图10显示了测试结果中的代表性表位模型。
[0024]
图11显示了表位模型和immunocap的比较的代表性结果。
[0025]
图12显示了表位和表位+sige的cv的代表性auc。
[0026]
图13显示了测试中表位模型准确性的代表性结果。
[0027]
图14显示了cofar2中性能的roc曲线图。
具体实施方式
[0028]
本文使用的术语只用于描述特定实施方案的目的，而不意图是限制性的。
[0029]
在描述若干示例性实施方案之前，应当理解，实施方案不限于在以下描述中阐述的构造或方法步骤的细节。本文描述的实施方案能够进行修改并且能够以各种方式实践或进行。
[0030]
本公开通篇对“一些实施方案”或其派生词的提及意味着结合所述实施方案描述的特定特征、结构、材料或特性包括在至少一个实施方案中。因此，在本公开通篇各处出现
的诸如“在一些实施方案中”的短语不一定指代同一实施方案，而是通常可以归属于任何其他实施方案。此外，具体特征、结构、材料或特性可以任何合适方式在一个或多个实施方案中加以组合。
[0031]
如本文所用，术语“过敏相关免疫球蛋白”和“aai”是指血清中介导对花生过敏原的超敏反应的免疫球蛋白。这些包括ige、iga、igm和igg(包括igg4)中的一种或多种。
[0032]
如本文所用，术语“反应性(reactive)”、“反应性(reactivity)”、“识别”等是指过敏相关免疫球蛋白结合含有过敏原表位的肽的能力。反应性水平表明血清或血浆中aai的浓度，其中高反应性与较高aai浓度相关并且较低反应性与较低aai浓度相关。相对aai浓度(即相对血清或血浆反应性)由测定中检测到的信号量来确定。aai对含有过敏原表位的肽的反应性水平还表明了过敏应答的强度(即较高反应性与较强过敏反应相关)。
[0033]
如本文所用，术语“临床耐受性”是指过敏受试者由于暴露于过敏原而产生的对花生过敏原的免疫耐受性(即，由于免疫疗法而产生的耐受性)。
[0034]
如本文所用，术语“天然耐受性”是指过敏受试者由于在一生当中自然暴露于过敏原或不存在暴露而随时间以生化过程的形式产生的对花生过敏原的免疫耐受性。
[0035]
本公开提供了含有过敏原表位的花生肽的组，其包含多种花生肽，所述花生肽包含至少两种衍生自ara h 1过敏原(seq id no:1)、ara h 2过敏原(seq id no:2)和/或ara h 3过敏原(seq id no:3)的肽。
[0036]
在一些实施方案中，所述多种花生肽选自：具有来自ara h 1过敏原的8至66位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 1过敏原的103至152位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 1过敏原的176至195位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 2过敏原的5至40位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 3过敏原的93至115位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 3过敏原的30至75位的至少3个连续氨基酸的肽；和/或具有来自ara h 3过敏原的152至167位的至少3个连续氨基酸的肽。
[0037]
在一些实施方案中，所述多种花生肽包含具有选自seq id no:4-67中任何一个或多个的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，所述多种花生肽包含具有选自seq id no:7、13、16、17、25、27、30、36、39、45、65和66中任何一个或多个的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，所述多种花生肽包含具有选自seq id no:39、45和66中任何一个或多个的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，所述多种花生肽包含具有选自seq id no:5、6、10、13、14、34、36、39、40、42、49、61、65和66中任何一个或多个的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，所述多种花生肽包含具有选自seq id no:5、6、9、34、36、39和40中任何一个或多个的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，所述多种花生肽包含具有选自seq id no:29、39、42、44、45、51和63中任何一个或多个的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，所述多种花生肽包含具有选自seq id no:7、8、29、31、39、45和61中任何一个或多个的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，所述多种花生肽包含具有选自seq id no:39和40中任何一个或多个的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，所述多种花生肽包含具有氨基酸序列seq id no:39的肽。在一些实施方案中，所述多种花生肽包含具有氨基酸序列seq id no:40的肽。
[0038]
在一些实施方案中，每种花生肽包含约3个氨基酸至约60个氨基酸、约4个氨基酸至约60个氨基酸、约6个氨基酸至约30个氨基酸、约7个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约16个氨基酸或约10个氨基酸至约15个氨基酸。在一些实施方案中，每种花生肽包含
15个氨基酸。
[0039]
在一些实施方案中，所述多种花生肽包括至少2种花生肽、至少3种花生肽、至少5种花生肽、至少10种花生肽、至少15种花生肽、至少20种花生肽、至少25种花生肽、至少30种花生肽、至少35种花生肽、至少40种花生肽、至少45种花生肽、至少50种花生肽、至少55种花生肽、至少60种花生肽或至少64种花生肽。在一些实施方案中，所述多种花生肽包括约2至约64种花生肽、约2至约60种花生肽、约2至约55种花生肽、约2至约50种花生肽、约2至约45种花生肽、约2至约40种花生肽、约2至约35种花生肽、约2至约30种花生肽、约2至约25种花生肽、约2至约20种花生肽、约2至约15种花生肽或约2至约10种花生肽。在一些实施方案中，所述多种花生肽包括约2至约64种花生肽、约5至约64种花生肽、约10至约64种花生肽、约15至约64种花生肽、约20至约64种花生肽、约25至约64种花生肽、约30至约64种花生肽、约35至约64种花生肽、约40至约64种花生肽、约45至约64种花生肽、约50至约64种花生肽或约55至约64种花生肽。
[0040]
应当理解，尽管本文公开的含有过敏原表位的肽被描述为具有特定氨基酸序列的特定实施方案，但是本领域的技术人员将认识到，每种这样的肽可以在其所来源的蛋白质的n末端或c末端方向上移位，以获得仍然含有相关表位但其中相关表位侧接与指定不同的氨基酸的相关肽序列。因此，在所有实施方案中，含有过敏原表位的肽可具有与公开的肽序列重叠2、4、6或8个或更多个连续氨基酸的氨基酸序列。
[0041]
还应认识到，对通过seq id no:4-67表示的所有64种肽的分析对于在本文所述的方法中获得有用的结果来说并不总是必需的。有可能使用足够数量的选自通过seq id no:4-67表示的肽的肽以提供统计学上可靠的结果。例如，如果受试者的花生过敏状态未知，则通常需要分析较大量选自通过seq id no:4-67表示的肽的含有过敏原表位的肽，以确保可检测到可能涉及与仅一些通过seq id no:4-67表示的肽的反应性的轻度至中度花生过敏。相反，如果已知受试者患有高强度花生过敏，则较少选自通过seq id no:4-67表示的肽的含有过敏表位的肽可能足以检测过敏强度的变化或临床耐受性的产生，因为较大量通过seq id no:4-67表示的肽将最初便具有反应性。但是，由于过敏强度的变化和临床耐受性的产生是通过与血清具有反应性的肽的数目的变化以及与特定肽具有反应性的血清ige浓度的变化来证明的，所以特别需要在测定中包括足够大的一组选自通过seq id no:4-67表示的肽的肽，以确保不遗漏相对于对特定受试者进行诊断的肽的变化。因此，用于本文所述的任何方法的所述多种选自通过seq id no:4-67表示的肽的含有过敏原表位的肽可表示seq id no:4-67的所有64种肽、20-25种肽的子组、15-20种肽的子组、10-15种肽的子组、5-10种肽的子组或2-5种肽的子组。
[0042]
本公开还提供了用于在受试者中诊断花生过敏和/或花生过敏的严重程度的方法，其包括：在足以允许获自所述受试者的血清或血浆中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(aai)与一种或多种花生肽结合的条件下，将所述一种或多种花生肽与所述血清或血浆接触，其中所述一种或多种花生肽与固体支持体偶联，形成一种或多种aai-肽-固体支持体复合物；将aai特异性标记试剂与所述aai-肽-固体支持体复合物结合；以及检测所述aai特异性标记试剂与每个aai-肽-固体支持体复合物的结合，以鉴定出与所述受试者的所述血清或血浆中的所述aai结合的一种或多种花生肽；其中在所述受试者的所述血清或血浆中的aai对至少一种花生肽的识别表明所述受试者对花生过敏。
[0043]
在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽衍生自ara h 1过敏原(seq id no:1)、ara h 2过敏原(seq id no:2)和/或ara h 3过敏原(seq id no:3)。
[0044]
在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽选自：具有来自ara h 1过敏原的8至66位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 1过敏原的103至152位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 1过敏原的176至195位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 2过敏原的5至40位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 3过敏原的93至115位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 3过敏原的30至75位的至少3个连续氨基酸的肽；和/或具有来自ara h 3过敏原的152至167位的至少3个连续氨基酸的肽。
[0045]
在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:4-67中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:7、13、16、17、25、27、30、36、39、45、65和66中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:39、45和66中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:5、6、10、13、14、34、36、39、40、42、49、61、65和66中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:5、6、9、34、36、39和40中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:29、39、42、44、45、51和63中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:7、8、29、31、39、45和61中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:39和40中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含氨基酸序列seq id no:39。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含氨基酸序列seq id no:40。
[0046]
在一些实施方案中，每种花生肽包含约3个氨基酸至约60个氨基酸、约4个氨基酸至约60个氨基酸、约6个氨基酸至约30个氨基酸、约7个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约16个氨基酸或约10个氨基酸至约15个氨基酸。在一些实施方案中，每种花生肽包含15个氨基酸。
[0047]
在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括至少2种花生肽、至少3种花生肽、至少5种花生肽、至少10种花生肽、至少15种花生肽、至少20种花生肽、至少25种花生肽、至少30种花生肽、至少35种花生肽、至少40种花生肽、至少45种花生肽、至少50种花生肽、至少55种花生肽、至少60种花生肽或至少64种花生肽。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括约2至约64种花生肽、约2至约60种花生肽、约2至约55种花生肽、约2至约50种花生肽、约2至约45种花生肽、约2至约40种花生肽、约2至约35种花生肽、约2至约30种花生肽、约2至约25种花生肽、约2至约20种花生肽、约2至约15种花生肽或约2至约10种花生肽。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括约2至约64种花生肽、约5至约64种花生肽、约10至约64种花生肽、约15至约64种花生肽、约20至约64种花生肽、约25至约64种花生肽、约30至约64种花生肽、约35至约64种花生肽、约40至约64种花生肽、约45至约64种花生肽、约50至约64种花生肽或约55至约64种花生肽。
[0048]
在一些实施方案中，确定受试者对花生过敏还考虑以下中的一项或多项的结果：总花生特异性ige(sige)、花生组分ara h 1ige、花生组分ara h 2ige、花生组分ara h 3ige、总花生特异性igg4(sigg4)、花生组分ara h 1igg4、花生组分ara h 2igg4、花生组分
ara h 3igg4、皮肤点刺测试结果、临床或家族史和/或来自患者或临床医生问卷的数据。在一些实施方案中，确定受试者对花生过敏还考虑以下中的一项或多项的结果：花生组分ara h 1ige、花生组分ara h 2ige和/或花生组分ara h 3ige。
[0049]
在一些实施方案中，花生组分ara h 1ige结果包括来自包含选自seq id no:7、13、16、17、25、27、30和36，或者选自seq id no:5、6、10、13、14、34和36，或者选自seq id no:5、6、9、34和36，或者选自seq id no:7、8、29和31，或者选自seq id no:29的氨基酸序列的花生肽的结果；花生组分ara h 2ige结果包括来自包含选自seq id no:39，或者选自seq id no:39、40、42和49，或者选自seq id no:39和40，或者选自seq id no:39、42、44、45和51，或者选自seq id no:39和45，或者选自seq id no:39和40，或者选自seq id no:40的氨基酸序列的花生肽的结果；并且/或者花生组分ara h 3ige结果包括来自包含选自seq id no:65，或者选自seq id no:61、65和66，或者选自seq id no:63，或者选自seq id no:61的氨基酸序列的花生肽的结果。
[0050]
在一些实施方案中，确定受试者对花生过敏还考虑以下中的一项或多项的结果：包含氨基酸序列seq id no:39的花生肽ige、包含氨基酸序列seq id no:45的花生肽igg4和包含氨基酸序列seq id no:66的花生肽igg4；包含氨基酸序列seq id no:39的花生肽ige、包含氨基酸序列seq id no:45的花生肽igg4和皮肤点刺测试；包含氨基酸序列seq id no:39的花生肽ige、包含氨基酸序列seq id no:45的花生肽igg4、包含氨基酸序列seq id no:66的花生肽igg4和sige；以及包含氨基酸序列seq id no:39的花生肽ige、包含氨基酸序列seq id no:45的花生肽igg4、包含氨基酸序列seq id no:66的花生肽igg4和花生组分ara h 2。
[0051]
在一些实施方案中，确定受试者对花生过敏包括：确定受试者的sige≥0.03ku
a
/l，这表明受试者可能对花生过敏，或者确定受试者的sige＜0.03ku
a
/l，这表明受试者对花生不过敏；以及当受试者的sige≥0.03ku
a
/l时，则确定包含氨基酸序列seq id no:39的花生肽ige、包含氨基酸序列seq id no:45的花生肽igg4和包含氨基酸序列seq id no:66的花生肽igg4的组合是＜0.20，这表明受试者对花生不过敏，还是≥0.20，这表明受试者对花生过敏。
[0052]
在一些实施方案中，当确定受试者是否对花生过敏时，还考虑皮肤点刺测试(spt)。例如，在单阈值测试中，如果sige≤0.10、或spt≤t1、或h2.008≤0.8、或h2.010≤t2，则受试者不过敏；否则，受试者过敏。在双阈值测试中，如果sige≤0.10、或spt≤t1、或h2.008≤0.8、或h2.010≤t2，则受试者不过敏；否则，如果h2.010≥t3，则受试者过敏。t1、t2和t3是各种阈值。这些阈值由用户选择作为算法的一部分，并基于最佳性能度量(例如auc、npv和ppv)进行评估。
[0053]
在一些实施方案中，每种花生肽包含用于偶联至固体支持体的接头。在一些实施方案中，接头是-peg12-生物素。在一些实施方案中，接头可包含3、6、9或12个碳。在一些实施方案中，可以用点击化学接头(例如叠氮化物-dbco、胺-nhs酯、硫醇-苹果酰胺、腙等)代替生物素。
[0054]
在一些实施方案中，固体支持体是微球珠粒、玻璃阵列、硅氧烷阵列、膜或微量滴定板。在一些实施方案中，每个固体支持体(例如珠粒、微量滴定板孔或色谱材料上的离散位置)被单种肽占据。然后在适合于血清或血浆中的抗肽aai(如果存在的话)与每个固体支
持体或固体支持体上的离散位置上的肽的特异性结合的条件下，使固体支持体与获自受试者的血清或血浆接触以在固体支持体上形成肽-aai复合物。然后，通过使每个固体支持体或固体支持体上的离散位置上的复合物与特异性结合所述复合物的标记试剂接触(通常通过结合固定的血清或血浆aai抗体)来检测在固体支持体上形成的任何肽-aai复合物。单一标记试剂通常将用于所有复合物的通用检测。然后可以通过在微量滴定板或色谱支持体上的位置来鉴定特异性肽-aai复合物。当与每种肽缀合的固体支持体具有不同的光谱性质时，一旦通过来自与复合物结合的标记试剂的可检测信号鉴定了复合物的存在，也可以通过分析与肽-aai复合物缔合的固体支持体的光谱性质来鉴定特异性肽-aai复合物。例如，在微量滴定板的每个孔中存在或不存在肽-aai复合物可以通过将缀合报告部分的抗人aai抗体与复合物结合来确定，所述报告部分例如荧光染料、显色染料、酶标记或放射性标记。替代地，抗人aai抗体可以与不可直接检测的报告部分缀合，因此第二可直接检测的报告部分与标记试剂的特异性结合对于结合分析来说是必要的。
[0055]
在一些实施方案中，aai是igg、igm、iga和/或ige。在一些实施方案中，igg是igg4。
[0056]
在一些实施方案中，aai特异性标记试剂是可检测标记的抗人igg4抗体、可检测标记的抗人igm抗体、可检测标记的抗人iga抗体和/或可检测标记的抗人ige抗体。在一些实施方案中，可检测标记选自藻红蛋白、荧光染料、辣根过氧化物酶(hrp)和碱性磷酸酶。在一些实施方式中，标记试剂可以与可直接检测的第一报告部分缀合，例如荧光染料、放射性标记或有色染料。在一些实施方案中，藻红蛋白(pe)分子可以直接与抗过敏相关免疫球蛋白偶联并用于检测。替代地，第一报告部分可以是可间接检测的报告部分(例如，显色染料的酶标记)，并且第一报告部分的特异性结合伴侣可以与可直接检测的标记(第二报告部分)缀合。例如，生物素缀合的抗aai抗体可以与链霉亲和素缀合的荧光染料组合使用，以用于检测生物素缀合的抗aai。在一些实施方案中，可通过银染、量子点或折射方法观察可检测标记。
[0057]
在一些实施方案中，通过用于流式细胞术分析的多重肽珠测定或侧向流测定来进行aai特异性标记试剂与每种aai-肽-固体支持体复合物的结合的检测。任何前述实施方案可以是微阵列免疫测定的形式，其中所述多种含有过敏原表位的肽中的每一种与微量滴定板的单独的孔结合并与血清反应以结合aai。通过结合aai特异性标记试剂，例如缀合至报告分子(例如荧光标记)的抗aai抗体，来检测结合的aai。结合的标记试剂的荧光表明血清或血浆中存在针对与孔结合的肽中所含有的过敏原表位的抗体。所述多种含有过敏原表位的肽也可以用于侧向流免疫测定形式，其中每种肽固定在多孔或色谱支持体上的离散区域中，并且血清或血浆通过支持体被芯吸以与肽接触从而使aai与肽结合。在这项测定中，aai特异性标记试剂可包含与抗aai抗体缀合的发色团或染料。标记试剂还通过支持体被芯吸以与肽-aai复合物接触从而使标记试剂与复合物结合，这表明血清或血浆中存在或不存在针对固定于支持体的每个离散位置的肽中所含有的过敏原表位的抗体。
[0058]
任何前述实施方案也可以是流式细胞术测定的形式，其中将每种含有过敏原表位的肽缀合至适于通过流式细胞术分析的可单独鉴定的固体支持体，例如珠粒。通常，通过与固体支持体上的肽特异性捕获抗体结合或通过化学键合至固体支持体来将肽与固体支持体缀合。在一些实施方案中，使具有缀合的含有过敏原表位的肽的珠粒与受试者的血清或血浆接触，以结合通过肽与珠粒结合的任何肽特异性aai，从而在珠粒上形成肽-aai复合
物。然后将包含例如荧光报告部分的aai特异性标记试剂与肽-aai复合物结合，并通过流式细胞术对珠粒进行定量或定性分析。这检测了来自与缀合了含有过敏原表位的肽的每个珠粒缔合的结合的标记试剂的荧光，从而鉴定了所述肽以及在血清中与其反应的aai的存在。对多种含有过敏原表位的肽中的至少一种具有反应性的aai的存在表明受试者对花生过敏，并且反应性肽的数目随时间的变化或者对一种或多种肽具有反应性的aai的浓度随时间的变化表明在此时间段内过敏强度增加、过敏强度降低或临床耐受性的产生。
[0059]
在一些实施方案中，流式细胞术测定可以是多重测定，例如luminex xmap技术，其使用微球阵列平台来定量和检测肽和蛋白质。所述多种含有过敏原表位的肽中的每一种与一组具有不同光谱性质的珠粒结合，这可用于通过流式细胞术鉴定缔合的含有过敏原表位的肽。然后将所述组珠粒与受试者的血清或血浆接触，以使识别肽的aai结合至每个珠粒以在珠粒上形成肽-aai复合物，以及包括例如与复合物的aai结合的荧光报告部分的aai特异性标记试剂。通过监测每个珠粒的光谱性质以及来自结合的标记试剂的相关荧光的量来分析珠粒。这个过程允许鉴定珠粒上的肽，以及与其具有反应性的血清或血浆aai的存在或不存在。如本文讨论来解释测定结果。
[0060]
用于本文所述的任何方法的特别有用的定量测定是用于流式细胞术分析的多重肽-珠粒测定，例如luminex exmap多重珠粒测定，它是elisa的高通量替代。在这项测定中，将染有不同比例的红色和近红外荧光团的聚苯乙烯珠粒(微球)用作固体支持体。可以将肽化学连接至珠粒或通过包被在珠粒上的肽特异性捕获抗体与其结合。荧光团的比例为每个珠粒群体限定了“光谱地址(spectral address)”，其可以通过流式细胞仪使用数字信号处理来鉴定。第三荧光色的检测用于测量与珠粒结合的标记试剂的报告部分的荧光强度。通过将每种肽结合到具有特定“光谱地址”的珠粒上，可以同时检测多种分析物。将珠粒与含有对与其结合的肽具有特异性的aai的血清或血浆接触，然后加入与报告部分缀合的抗人aai抗体。在一些实施方案中，抗人aai的报告部分是生物素，并且与藻红蛋白(pe)缀合的链霉亲和素的结合提供了用于检测的荧光信号。结合标记试剂后，在基于双激光流的检测仪器(例如luminex 200或bio-rad bio-plex分析仪)上对珠粒进行分析。一种激光对珠粒进行分类，并鉴定与其结合的肽。第二激光测定报告部分来源信号的强度，所述强度与结合的血清或血浆aai的量成正比。
[0061]
一种替代的测定形式是侧向流或免疫色谱测定。在这样的测定中，将选定的含有过敏原表位的肽固定在多孔支持体上，并且将含有aai的血清或血浆芯吸成与肽接触以形成免疫复合物。免疫复合物通过多孔支持体的进一步迁移使其与特异性捕获试剂接触，以便使用适当的检测试剂检测免疫复合物。
[0062]
在一些实施方案中，在暴露于花生过敏原之后，当至少一种肽与血清或血浆aai具有中度或高度反应性(s/n>2)并且一种或多种反应性肽的反应性在约6个月内不降低至少2倍时，受试者被诊断为患有花生过敏。
[0063]
在一些实施方案中，用于诊断花生过敏的方法是定性方法(即，仅基于对每种选定的肽具有反应性的aai的存在或不存在)。与任何选定的肽具有中度或高度反应性的aai的存在可被认为指示一定程度的花生过敏，前提条件是反应性在短时间(例如约6个月)内大致上不减弱。所述方法也可以是半定量的(即，与受试者的血清或血浆具有反应性的肽的数目越多，过敏的强度就相对越强，并且反之，反应性肽的数目越少，过敏的强度就相对越
低)。血清或血浆与5-15种肽的反应性可能指示轻度至中度花生过敏，其反应性在通常表征为轻度花生过敏的此范围的下限内。血清与16-30、16-25、16-20、16-18或全部64种肽的反应性可能指示中度至重度花生过敏，其反应性在通常表征为中度花生过敏的此范围的下限内。在中间范围内，血清与10-20、12-18或14-16种肽的反应性可能通常被认为指示中度花生过敏。肽的一个特别有用的特征是，通常不超过约8-10种与非过敏个体的血清或血浆具有高度反应性(s/n>10)，因此，与常规测定相比，在诊断测定的结果中提供了更高的置信水平。
[0064]
在一些实施方案中，为了分析与个别花生肽的结合，如果结合值≥0.1、≥0.2或≥0.3，则血清或血浆中aai对肽的识别是显著的。
[0065]
在一些实施方案中，用于诊断花生过敏的方法是定量方法(基于对每种选定的肽的aai反应性水平的定量)。在一些实施方案中，反应性水平与结合至肽-aai复合物的标记试剂的量相关，其中来自报告部分的信号水平更高，表明血清或血浆中特定肽特异性aai的浓度更高。为了获得与特定肽-aai复合物结合的报告部分的量或浓度，来自荧光染料的荧光的量、来自有色或显色染料或来自酶标记的颜色强度或者来自放射性标记的放射性的量与复合物中结合的aai的量及因此其浓度正相关。用于测量这些参数的方法是本领域已知的。与任何肽具有反应性的aai的相对量都可以被认为指示花生过敏的程度或强度。即，多种选定的肽或选定的肽内的一种或多种肽的反应性水平越高，过敏的强度越强。相反，多种选定的肽或选定的肽内的一种或多种肽的反应性水平越低，过敏的强度越弱。
[0066]
与过敏强度较强的个体的血清或血浆相比，轻度过敏的个体的血清或血浆与较少的肽具有反应性。因此，本公开不仅提供了用于诊断花生过敏的方法，还提供了用于测定过敏强度的方法以及用于测定过敏强度随时间的变化的方法，包括检测对花生的临床耐受性的产生。
[0067]
在一些实施方案中，与过敏受试者的血清或血浆具有反应性的含有过敏原表位的肽的数目与过敏应答的强度呈正相关，即与较少肽的反应性表明对花生的过敏性应答较温和，并且与较多肽的反应性表明受试者对花生的过敏性较高。在一些实施方案中，血清ige与肽的结合强度(例如，血清或血浆中ige浓度的量度)与过敏应答的强度相关(即，与所有肽或所有肽的子组的较弱反应性指示与所有肽或肽的子组的较强反应性相比更适度的过敏应答)。
[0068]
基于花生蛋白中肽表位的分析的针对花生过敏的先前已知的测定是竞争性免疫测定，其依赖于ige和igg4与表位结合的相对亲和力的分析。据信，抗体结合的亲和力与受试者是否将产生对花生的临床耐受性有关。相反，在一些实施方案中，本文所述的方法部分基于一组花生蛋白表位中与每种单独肽结合的aai的存在或不存在的分析，所述分析与花生过敏的诊断、与过敏应答的强度以及基于受试者血清或血浆中ige所结合的表位(即肽)的数目而与患者产生耐受性或经历过敏应答增加的可能性相关。在一些实施方案中，本文所述的方法部分基于血清或血浆中与每种含有过敏原表位的肽具有反应性的aai的浓度的分析，这也与过敏应答的强度有关。
[0069]
如本文所用，提及与含有过敏原表位的肽的“非反应性”或“阴性”反应性是指测定中的信噪比(s/n)小于约2。典型的背景信号(n)是由来自非过敏原个体的血清或血浆池生成的。替代地，可以将阴性肽用作建立背景信号的基础。如本文所用，提及与含有过敏原表
位的肽的“弱”或“中度”反应性意指s/n为约2-10，但是这个值可根据肽和过敏而变化。如本文所用，提及与含有过敏原表位的肽的“高”或“强”反应性意指s/n大于约10。
[0070]
可用于诊断花生过敏或对其的耐受性以及检测过敏强度增加和降低的方法的肽还可包括含有花生蛋白的非反应性表位的肽。这些肽可用作阴性对照。
[0071]
在一些实施方案中，标记试剂与每种肽-aai复合物的结合的分析可以包括结合程度的分析，其指示血清或血浆中每种肽特异性aai的浓度。与所有肽或其子组的低至中度血清或血浆反应性指示血清中肽特异性aai的浓度较低以及轻度至中花生过敏，而与所有肽或其子组的高血清或血浆反应性指示血清中肽特异性aai的浓度较高以及更严重的花生过敏。用于诊断花生过敏的结合分析可以采用与血清或血浆具有反应性的肽的数目、血清或血浆aai与肽的结合程度或两者。
[0072]
本公开还提供了用于在对花生过敏的受试者中检测对花生的临床耐受性的产生的方法，其包括：在足以允许获自所述受试者的血清或血浆中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(aai)与一种或多种花生肽结合的条件下，将所述一种或多种花生肽与所述血清或血浆接触，其中所述一种或多种花生肽与固体支持体偶联，形成一种或多种aai-肽-固体支持体复合物；将aai特异性标记试剂与aai-肽-固体支持体复合物结合；检测所述aai特异性标记试剂与每个aai-肽-固体支持体复合物的结合，以鉴定出与所述受试者的所述血清或血浆中的所述aai结合的一种或多种花生肽；以及将所述鉴定的与所述受试者的所述血清或血浆中的所述aai结合的一种或多种花生肽、或所述受试者的所述血清或血浆中所述aai的浓度，与先前鉴定的一组与所述受试者的所述血清或血浆中的所述aai结合的一种或多种花生肽、或所述受试者的所述血清或血浆中所述aai的先前浓度进行比较；其中在以下情况下指示对花生的临床耐受性的产生：所述受试者的所述血清或血浆中的ige aai所识别的花生肽的随后数目和/或所述受试者的所述血清或血浆中aai ige的随后浓度小于所述受试者的所述血清或血浆中的aai ige所识别的花生肽的先前鉴定的数目和/或小于所述受试者的所述血清或血浆中aai ige的先前浓度；并且/或者所述受试者的所述血清或血浆中的igg4 aai所识别的花生肽的随后数目和/或所述受试者的所述血清或血浆中aai igg4的随后浓度大于所述受试者的所述血清或血浆中的aai igg4所识别的花生肽的先前鉴定的数目和/或大于所述受试者的所述血清或血浆中aai igg4的先前浓度。
[0073]
在一些实施方案中，经历小组鉴定(例如，初始、任何随后和/或最终)的受试者的年龄可以是约2岁至约50岁。
[0074]
在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽如本文所述。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含至少两种衍生自ara h 1过敏原(seq id no:1)、ara h 2过敏原(seq id no:2)和/或ara h 3过敏原(seq id no:3)的肽。
[0075]
在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽选自：具有来自ara h 1过敏原的8至66位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 1过敏原的103至152位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 1过敏原的176至195位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 2过敏原的5至40位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 3过敏原的93至115位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 3过敏原的30至75位的至少3个连续氨基酸的肽；和/或具有来自ara h 3过敏原的152至167位的至少3个连续氨基酸的肽。
[0076]
在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:4-67中任何一个
或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:7、13、16、17、25、27、30、36、39、45、65和66中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:39、45和66中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:5、6、10、13、14、34、36、39、40、42、49、61、65和66中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:5、6、9、34、36、39和40中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:29、39、42、44、45、51和63中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:7、8、29、31、39、45和61中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:39和40中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含氨基酸序列seq id no:39。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含氨基酸序列seq id no:40。
[0077]
在一些实施方案中，每种花生肽包含约3个氨基酸至约60个氨基酸、约4个氨基酸至约60个氨基酸、约6个氨基酸至约30个氨基酸、约7个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约16个氨基酸或约10个氨基酸至约15个氨基酸。在一些实施方案中，每种花生肽包含15个氨基酸。
[0078]
在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括至少2种花生肽、至少3种花生肽、至少5种花生肽、至少10种花生肽、至少15种花生肽、至少20种花生肽、至少25种花生肽、至少30种花生肽、至少35种花生肽、至少40种花生肽、至少45种花生肽、至少50种花生肽、至少55种花生肽、至少60种花生肽或至少64种花生肽。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括约2至约64种花生肽、约2至约60种花生肽、约2至约55种花生肽、约2至约50种花生肽、约2至约45种花生肽、约2至约40种花生肽、约2至约35种花生肽、约2至约30种花生肽、约2至约25种花生肽、约2至约20种花生肽、约2至约15种花生肽或约2至约10种花生肽。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括约2至约64种花生肽、约5至约64种花生肽、约10至约64种花生肽、约15至约64种花生肽、约20至约64种花生肽、约25至约64种花生肽、约30至约64种花生肽、约35至约64种花生肽、约40至约64种花生肽、约45至约64种花生肽、约50至约64种花生肽或约55至约64种花生肽。
[0079]
在一些实施方案中，确定受试者对花生过敏还考虑以下中的一项或多项的结果：总花生特异性ige(sige)、花生组分ara h 1ige、花生组分ara h2 ige、花生组分ara h 3ige、皮肤点刺测试结果、临床或家族史和/或来自患者或临床医生问卷的数据。
[0080]
在一些实施方案中，每种花生肽包含用于偶联至固体支持体的接头。在一些实施方案中，接头是-peg12-生物素。在一些实施方案中，接头可包含3、6、9或12个碳。在一些实施方案中，可以用点击化学接头(例如叠氮化物-dbco、胺-nhs酯、硫醇-苹果酰胺、腙等)代替生物素。在一些实施方案中，固体支持体是微球珠粒、玻璃阵列、硅氧烷阵列、膜或微量滴定板。在一些实施方案中，固体支持体如本文所述。
[0081]
在一些实施方案中，aai是igg、igm、iga和/或ige。在一些实施方案中，igg是igg4。
[0082]
在一些实施方案中，aai特异性标记试剂是可检测标记的抗人igg4抗体、可检测标记的抗人igm抗体、可检测标记的抗人iga抗体和/或可检测标记的抗人ige抗体。在一些实施方案中，可检测标记选自藻红蛋白、荧光染料、辣根过氧化物酶(hrp)和碱性磷酸酶。在一
id no:39和40中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含氨基酸序列seq id no:39。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含氨基酸序列seq id no:40。
[0087]
在一些实施方案中，每种花生肽包含约3个氨基酸至约60个氨基酸、约4个氨基酸至约60个氨基酸、约6个氨基酸至约30个氨基酸、约7个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约16个氨基酸或约10个氨基酸至约15个氨基酸。在一些实施方案中，每种花生肽包含15个氨基酸。
[0088]
在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括至少2种花生肽、至少3种花生肽、至少5种花生肽、至少10种花生肽、至少15种花生肽、至少20种花生肽、至少25种花生肽、至少30种花生肽、至少35种花生肽、至少40种花生肽、至少45种花生肽、至少50种花生肽、至少55种花生肽、至少60种花生肽或至少64种花生肽。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括约2至约64种花生肽、约2至约60种花生肽、约2至约55种花生肽、约2至约50种花生肽、约2至约45种花生肽、约2至约40种花生肽、约2至约35种花生肽、约2至约30种花生肽、约2至约25种花生肽、约2至约20种花生肽、约2至约15种花生肽或约2至约10种花生肽。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括约2至约64种花生肽、约5至约64种花生肽、约10至约64种花生肽、约15至约64种花生肽、约20至约64种花生肽、约25至约64种花生肽、约30至约64种花生肽、约35至约64种花生肽、约40至约64种花生肽、约45至约64种花生肽、约50至约64种花生肽或约55至约64种花生肽。
[0089]
在一些实施方案中，确定受试者对花生过敏还考虑以下中的一项或多项的结果：总花生特异性ige(sige)、花生组分ara h 1ige、花生组分ara h2 ige、花生组分ara h 3ige、皮肤点刺测试结果、临床或家族史和/或来自患者或临床医生问卷的数据。
[0090]
在一些实施方案中，每种花生肽包含用于偶联至固体支持体的接头。在一些实施方案中，接头是-peg12-生物素。在一些实施方案中，接头可包含3、6、9或12个碳。在一些实施方案中，可以用点击化学接头(例如叠氮化物-dbco、胺-nhs酯、硫醇-苹果酰胺、腙等)代替生物素。在一些实施方案中，固体支持体是微球珠粒、玻璃阵列、硅氧烷阵列、膜或微量滴定板。在一些实施方案中，固体支持体如本文所述。
[0091]
在一些实施方案中，aai是igg、igm、iga和/或ige。在一些实施方案中，igg是igg4。
[0092]
在一些实施方案中，aai特异性标记试剂是可检测标记的抗人igg4抗体、可检测标记的抗人igm抗体、可检测标记的抗人iga抗体和/或可检测标记的抗人ige抗体。在一些实施方案中，可检测标记选自藻红蛋白、荧光染料、辣根过氧化物酶(hrp)和碱性磷酸酶。在一些实施方案中，可通过银染、量子点或折射方法观察可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记如本文所述。
[0093]
在一些实施方案中，通过用于流式细胞术分析的多重肽珠测定或侧向流测定来进行aai特异性标记试剂与每种aai-肽-固体支持体复合物的结合的检测。在一些实施方案中，检测测定如本文所述。
[0094]
因为可以对每种肽特异性aai与固体支持体上的肽-aai复合物的结合程度进行定量，所以选自通过seq id no:4-67表示的肽的多种肽也可用于检测在诊断为花生过敏的受试者中花生过敏强度随时间的增加或在最初诊断为非过敏的受试者中花生过敏随时间的产生的方法。如本文所述对选自seq id no:4-67的多种肽进行初始测定，以提供反应性肽
的初始数目或每种肽特异性aai的初始浓度。在初始测定之后的时间点，用与初始图谱相同的选自seq id no:4-67的多种肽重复分析，以获得反应性肽的随后数目或肽特异性aai的随后浓度。所述方法可总结如下：提供受试者血清或血浆aai对选自seq id no:4-67的多种肽的反应性的初始图谱，其中初始图谱指示被受试者血清或血浆中的aai识别(结合)的肽的初始数目或受试者血清或血浆中识别(结合)每种肽的aai的初始浓度；在初始图谱之后的时间点，在足以允许血清或血浆中的aai与各固体支持体上的肽结合的条件下，使缀合到可单独鉴定的固体支持体的相同多种肽中的每种肽与受试者血清或血浆接触，形成肽-aai复合物；将aai特异性标记试剂与复合物结合；以及分析标记试剂与每种肽-aai复合物的结合，以鉴定被受试者血清或血浆中的aai识别的肽的随后数目或受试者血清或血清中与每种选定肽反应的aai的随后浓度。
[0095]
用于检测过敏强度的增加的方法可以利用任何适当的测定形式，包括本文所述的那些。可用于分析标记试剂的结合的分析类型的实例也如本文所述。与初始图谱相比，在随后的时间点与aai具有反应性的肽数目的增加(包括与初始图谱中没有与aai具有反应性的肽相比的增加)；或者与初始图谱相比，在随后的时间点aai与任何肽的结合强度的增加(包括从初始图谱中没有与特定肽的结合到随后时间点可检测结合的增加)表明在先前诊断为花生过敏的受试者中花生过敏强度的增加或在先前非过敏受试者中花生过敏的产生。如本文所讨论，将受试者的初始图谱与随后时间点的图谱进行比较可用于预测受试者在特定过敏中严重程度增加或耐受性降低，或预测对过敏原的临床或天然耐受性的产生的可能性。
[0096]
本公开还提供了使婴儿对一种或多种花生过敏原敏感以诱导对花生的耐受性或非过敏性的方法，其包括向婴儿施用一种或多种花生肽，其中所述一种或多种花生肽衍生自ara h 1过敏原(seq id no:1)、ara h 2过敏原(seq id no:2)和/或ara h 3过敏原(seq id no:3)。
[0097]
在一些实施方案中，进行施用(例如，初始施用、任何随后施用和/或最后一次施用)的受试者的年龄可以小于约一岁、小于约2岁、小于约3岁、小于约4岁、小于约5岁或小于约6岁。总肽或单独肽的量可以为每剂约1克或更少。施用可以是口服、舌下、皮内、皮下、吸入或表皮施用。
[0098]
在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽如本文所述。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽选自：具有来自ara h 1过敏原的8至66位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 1过敏原的103至152位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 1过敏原的176至195位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 2过敏原的5至40位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 3过敏原的93至115位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 3过敏原的30至75位的至少3个连续氨基酸的肽；和/或具有来自ara h 3过敏原的152至167位的至少3个连续氨基酸的肽。
[0099]
在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:4-67中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:7、13、16、17、25、27、30、36、39、45、65和66中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:39、45和66中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:5、6、10、13、14、34、36、39、40、42、49、61、65和66中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或
多种花生肽包含选自seq id no:5、6、9、34、36、39和40中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:29、39、42、44、45、51和63中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:7、8、29、31、39、45和61中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:39和40中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含氨基酸序列seq id no:39。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含氨基酸序列seq id no:40。
[0100]
在一些实施方案中，每种花生肽包含约3个氨基酸至约60个氨基酸、约4个氨基酸至约60个氨基酸、约6个氨基酸至约30个氨基酸、约7个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约16个氨基酸或约10个氨基酸至约15个氨基酸。在一些实施方案中，每种花生肽包含15个氨基酸。
[0101]
在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括至少2种花生肽、至少3种花生肽、至少5种花生肽、至少10种花生肽、至少15种花生肽、至少20种花生肽、至少25种花生肽、至少30种花生肽、至少35种花生肽、至少40种花生肽、至少45种花生肽、至少50种花生肽、至少55种花生肽、至少60种花生肽或至少64种花生肽。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括约2至约64种花生肽、约2至约60种花生肽、约2至约55种花生肽、约2至约50种花生肽、约2至约45种花生肽、约2至约40种花生肽、约2至约35种花生肽、约2至约30种花生肽、约2至约25种花生肽、约2至约20种花生肽、约2至约15种花生肽或约2至约10种花生肽。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括约2至约64种花生肽、约5至约64种花生肽、约10至约64种花生肽、约15至约64种花生肽、约20至约64种花生肽、约25至约64种花生肽、约30至约64种花生肽、约35至约64种花生肽、约40至约64种花生肽、约45至约64种花生肽、约50至约64种花生肽或约55至约64种花生肽。
[0102]
在一些实施方案中，临床耐受性产生的初始检测可用于预测患者是否将产生对过敏的天然耐受性或对治疗有应答。在一些实施方案中，在分析初始图谱之前，使过敏受试者暴露于免疫原(免疫疗法)。如果在随后时间点，所有在初始图谱中与肽具有高度反应性的aai的血清浓度均降低至少2倍，则受试者可能产生对花生的临床或自然耐受性。如果在随后时间点，少于所有在初始图谱中与肽具有高度反应性的aai的血清浓度降低至少2倍，则受试者可能仅产生对花生的部分临床或自然耐受性。
[0103]
选自通过seq id no:4-67表示的肽的多种肽也可用于在诊断为花生过敏的受试者中检测对花生蛋白的临床耐受性的产生的方法。在一些实施方案中，通常如本文所述用于检测过敏强度的增加的测定首先在初始时间点进行，以建立血清或血浆aai与选自seq id no:4-67的多种肽的反应性的初始图谱。如本文所讨论，初始图谱是基于血清或血浆与选定的肽的反应性的半定量或定量分析。然后将与固体支持体缀合的选定的图谱肽与在初始之后的时间点从受试者获得的血清或血浆接触，并且如本文所述进行测定，在随后的时间点半定量或定量花生过敏的强度。与初始图谱相比，在随后时间点与aai具有反应性的肽的数目减少；或者与初始图谱相比，在随后时间点aai与任何肽的结合强度降低，特别是降低至少2倍，表明对花生蛋白的临床耐受性的产生。应当理解，在先前诊断为花生过敏的受试者中对花生蛋白的临床耐受性的产生也表明在初始图谱与随后时间点之间的时间段内过敏强度降低，并且所述方法也可用于检测并预测这种过敏强度随时间的降低。
[0104]
治疗过敏的免疫治疗方法主要集中在使用全蛋白或花生提取物以治疗患者和使患者脱敏。肽是一种有吸引力的替代品，其可以代表治疗花生过敏的更集中且更安全的方法。来自ara h 1、ara h 2和ara h 3上重要ige反应性区的特定肽(例如，ara h 1：8-66，ara h 2：5-40和ara h 3 93-115)可单独地、组合地或与其他治疗方法组合用于治疗花生过敏。可以通过口服、舌下、皮内、皮下、吸入或表皮途径施用特定的肽来治疗过敏。
[0105]
本公开还提供了试剂盒，其包含：一种或多种衍生自ara h 1过敏原(seq id no:1)、ara h 2过敏原(seq id no:2)和/或ara h 3过敏原(seq id no:3)的含有过敏原表位的花生肽，其中每种花生肽与固体支持体偶联；以及过敏相关免疫球蛋白(aai)特异性标记试剂；包装在一起并包括使用说明。
[0106]
在一些实施方案中，试剂盒还包含结合缓冲液、洗涤缓冲液和检测缓冲液中的一种或多种。在一些实施方案中，试剂盒还包含与aai特异性标记试剂特异性结合的报告部分。
[0107]
在一些实施方案中，试剂盒中的所述一种或多种花生肽选自：具有来自ara h 1过敏原的8至66位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 1过敏原的103至152位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 1过敏原的176至195位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 2过敏原的5至40位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 3过敏原的93至115位的至少3个连续氨基酸的肽；具有来自ara h 3过敏原的30至75位的至少3个连续氨基酸的肽；和/或具有来自ara h 3过敏原的152至167位的至少3个连续氨基酸的肽。
[0108]
在一些实施方案中，试剂盒中的所述一种或多种花生肽如本文所述。在一些实施方案中，试剂盒中的所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:4-67中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:7、13、16、17、25、27、30、36、39、45、65和66中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:39、45和66中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:5、6、10、13、14、34、36、39、40、42、49、61、65和66中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:5、6、9、34、36、39和40中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:29、39、42、44、45、51和63中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:7、8、29、31、39、45和61中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含选自seq id no:39和40中任何一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含氨基酸序列seq id no:39。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包含氨基酸序列seq id no:40。
[0109]
在一些实施方案中，试剂盒中的每种花生肽包含约3个氨基酸至约60个氨基酸、约4个氨基酸至约60个氨基酸、约6个氨基酸至约30个氨基酸、约7个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约16个氨基酸或约10个氨基酸至约15个氨基酸。在一些实施方案中，每种花生肽包含15个氨基酸。
[0110]
在一些实施方案中，试剂盒中的所述一种或多种花生肽包括至少2种花生肽、至少3种花生肽、至少5种花生肽、至少10种花生肽、至少15种花生肽、至少20种花生肽、至少25种花生肽、至少30种花生肽、至少35种花生肽、至少40种花生肽、至少45种花生肽、至少50种花
生肽、至少55种花生肽、至少60种花生肽或至少64种花生肽。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括约2至约64种花生肽、约2至约60种花生肽、约2至约55种花生肽、约2至约50种花生肽、约2至约45种花生肽、约2至约40种花生肽、约2至约35种花生肽、约2至约30种花生肽、约2至约25种花生肽、约2至约20种花生肽、约2至约15种花生肽或约2至约10种花生肽。在一些实施方案中，所述一种或多种花生肽包括约2至约64种花生肽、约5至约64种花生肽、约10至约64种花生肽、约15至约64种花生肽、约20至约64种花生肽、约25至约64种花生肽、约30至约64种花生肽、约35至约64种花生肽、约40至约64种花生肽、约45至约64种花生肽、约50至约64种花生肽或约55至约64种花生肽。
[0111]
在一些实施方案中，试剂盒中的每种花生肽包含用于偶联至固体支持体的接头。在一些实施方案中，接头是-peg12-生物素。在一些实施方案中，接头可包含3、6、9或12个碳。在一些实施方案中，可以用点击化学接头(例如叠氮化物-dbco、胺-nhs酯、硫醇-苹果酰胺、腙等)代替生物素。在一些实施方案中，固体支持体是微球珠粒、玻璃阵列、硅氧烷阵列、膜或微量滴定板。在一些实施方案中，固体支持体如本文所述。
[0112]
在一些实施方案中，aai特异性标记试剂是可检测标记的抗人igg4抗体、可检测标记的抗人igm抗体、可检测标记的抗人iga抗体和/或可检测标记的抗人ige抗体。在一些实施方案中，可检测标记选自藻红蛋白、荧光染料、辣根过氧化物酶(hrp)和碱性磷酸酶。在一些实施方案中，可通过银染、量子点或折射方法观察可检测标记。在一些实施方案中，标记试剂如本文所述。
[0113]
为了方便用户，用于本文所述的任何方法的试剂均可以以试剂盒的形式包装在一起，所述试剂盒包含：选自通过seq id no:4-67表示的肽或任何有用亚组的多种含有过敏原表位的肽；包含与第一报告部分缀合的抗人ige抗体的标记试剂；和任选地(如果需要用于间接检测)与标记试剂特异性结合的第二报告部分。试剂盒通常将包括在本文所述的一种或多种方法中使用这些试剂的说明。
[0114]
在一些实施方案中，试剂盒可以包含抗人aai抗体，其可以与可直接检测的报告部分缀合而提供。可直接检测的报告部分是无需与特异性结合伴侣结合即可被鉴定和/或定量的那些。可以与抗人aai抗体缀合的可直接检测的报告部分的实例包括荧光染料、有色染料、显色染料和可以通过随后的化学反应检测的酶标记以及放射性标记。在一些实施方案中，抗人aai抗体可以与可间接检测的报告部分缀合而提供，即自身不可检测但与包含可直接检测的报告部分的第二报告部分发生反应或相互作用的报告部分，例如与可直接检测的标记缀合的报告部分的特异性结合伴侣。可间接检测的报告部分的实例包括生物素、地高辛和其他半抗原，它们在随后结合被标记用于直接检测的第二抗体(例如抗地高辛)或其他结合伴侣(例如链霉亲和素)时可被检测到。应当理解，这些标记试剂和报告部分中的任一种都可用于本文所述的方法中以合适的测定形式并用作试剂盒的组分。在一些实施方案中，在用于进行本文所述的流式细胞术多重测定的试剂盒中，试剂盒的组分可以包含选自通过seq id no:4-67表示的肽的多种含有过敏原表位的肽、生物素化抗人aai抗体(具有第一报告部分的标记试剂)和与pe缀合的链霉亲和素(第二报告部分)。
[0115]
包含在任何前述试剂盒中的选自seq id no:4-67的多种含有过敏原表位的肽可以表示seq id no:4-67的所有64种肽、20-25种肽的子组、15-20种肽的子组、10-15种肽的子组、5-10种肽的子组或2-5种肽的子组。包含在任何前述试剂盒中的选自seq id no:4-67
的多种含有过敏原表位的肽也可以表示一种或多种相关肽亚组。
[0116]
本文所述的方法可以用作：1)筛选测定(例如，由于花生过敏的家族史而导致的高风险患者，以告知治疗方法/干预(患者可能暴露于过敏原或由于潜在的严重反应而避免)；表现出对花生过敏或敏感的患者，以指导患者饮食和/或随着长大而摆脱的可能性(通过ait开始脱敏疗法))；2)诊断测定(例如，用于诊断疑似花生过敏的患者；基于过敏应答的严重程度、基于暴露水平、基于过敏原的呈递(基于过敏原蛋白变性水平)对患者进行分层；确认反应性是由于花生中的特定蛋白质而不是由于交叉反应性应答(基于组分报告反应性)；3)预测测定(例如，预测治疗结果；确定患者是否对治疗产生应答；预测最佳治疗方法；预测有效起始剂量和/或治疗时长(例如1年相对于3年)；4)预后测定(例如，确定患者是否随着长大而摆脱过敏；确定过敏是否将不依赖于疗法而随时间变得更严重；帮助表征疾病以影响治疗决策并指导患者和药物/剂量选择)；4)监测测定(例如，由于ait引起的不良事件；以及确定特定结果(例如，脱敏、持续无应答性、耐受水平和消退))。
[0117]
花生肽序列包括：athaksspyqkkten(arah 1.008；seq id no:4)、lqscqqepddlkqka(arah 1.015；seq id no:5)、rctkleydprcvydp(arah 1.021；seq id no:6)、kleydprcvydprgh(arah 1.022；seq id no:7)、ydprghtgt tnqrsp(arah 1.025；seq id no:8)、rsppgertrgrqpgd(arah 1.029；seq id no:9)、pgertrgrqpgdydd(arah 1.030；seq id no:10)、pgdydddrrqprree(arah 1.033；seq id no:11)、drrqprreeggrwgp(ara h 1.035；seq id no:12)、agprerereed wrqp(arah 1.040；seq id no:13)、rerereedwrqpred(arah 1.041；seq id no:14)、rqpredwrrpshqqp(arah 1.044；seq id no:15)、redwrrpshqqprki(arah 1.045；seq id no:16)、pshqqprkirpegre(arah 1.047；seq id no:17)、rpegregeqewg tpg(arah 1.050；seq id no:18)、reetsrnnpfyfpsr(arah1.056；seq id no:19)、nnpfyfpsrrfstry(arah 1.058；seq id no:20)、sgfisyilnrhdnqn(arah 1.090；seq id no:21)、smpvntpgqfedffp(arah 1.097；seq id no:22)、rdqssylqgf srntl(ara h 1.103；seq id no:23)、seeegditnpinlre(arah1.130；seq idno:24)、egditnpinlr egep(arah 1.131；seq id no:25)、nnfgklfevkpdkkn(arah 1.137；seq id no:26)、rytarlkegdvfimp(arah 1.167；seq id no:27)、dvfimpaahpvaina(arah 1.170；seq id no:28)、pvainasselhllgf(arah 1.173；seq id no:29)、lhllgfginaennhr(arah 1.176；seq id no:30)、aennhriflagdkdn(arah 1.179；seq id no:31)、nhriflagdkdnvid(arah 1.180；seq id no:32)、vidqiekqakdlafp(arah 1.184；seq id no:33)、kqakdlafpgsgeqv(ara h 1.186；seq id no:34)、kdlafpgsgeq vekl(arah 1.187；seq id no:35)、shfvsarpqsqsqsp(arah 1.194；seq id no:36)、qeeenqggkgpllsi(arah 1.203；seq id no:37)、aahasarqqwelqgd(arah 2.005；seq id no:38)、welqgdrrcqsqler(ara h 2.008；seq id no:39)、rrcqsqleran lrpc(ara h 2.010；seq id no:40)、rpceqhlmqkiqrde(ara h 2.014；seq id no:41)、kiqrdedsyerdpys(arah 2.017；seq id no:42)、rdedsyerdpyspsq(arah 2.018；seq id no:43)、dsyerdpyspsqdpy(arah 2.019；seq id no:44)、pyspsqdpyspspyd(ara h 2.021；seq id no:45)、ccnelnefennqrcm(ara h 2.030；seq id no:46)、elnefennqrcmcea(arah 2.031；seq id no:47)、lqqimenqsdrlqgr(arah 2.036；seq id no:48)、imenqsdrlqgrqqe(arah 2.037；seq id no:49)、nqsdrlqgrqqe qqf(arah 2.038；seq id no:50)、qgrqqeqqfkrelrn(arah 2.040；seq id no:51)、
krelrnlpqqcglra(arah 2.043；seq id no:52)、lpqqcglrapqrcdl(arah 2.045；seq id no:53)、lrrnalrrpfysnap(ara h 3.018；seq id no:54)、hyeephtqgrr sqsq(arah 3.030；seq id no:55)、ephtqgrrsqsqrpp(arah 3.031；seq id no:56)、qgedqsqqqrdshqk(arah3.037；seq id no:57)、nteqeflryqqqsrq(arah 3.060；seq id no:58)、pyspqsqprqeeref(ara h 3.068；seq id no:59)、eggnifsgftpefle(arah 3.079；seq id no:60)、nifsgftpefleqaf(arah 3.080；seq id no:61)、aivtvrg glrilspd(arah3.092；seq id no:62)、tvrgglrilspdrkr(arah 3.093；seq id no:63)、eydedeyeydeedrr(ara h 3.100；seq id no:64)、yeydeedrrrgrgsr(ara h 3.102；seq id no:65)、ianlagensvidnlp(arah 3.152；seq id no:66)和rqlknnn pfkffvpp(arah 3.162；seq id no:67)。
[0118]
这些肽中的任何一种或多种都可以在其羧基末端与例如-peg12-生物素缀合。
[0119]
为了可以更有效地理解本文公开的主题，下文提供了实施例。应理解，这些实施例仅出于说明性目的并且不应视为以任何方式限制要求保护的主题。
[0120]
实施例
[0121]
实施例1：使用表位测定分析leap队列
[0122]
作为背景，先前进行了随机对照试验(rct)(例如，早期了解花生过敏(learning early about peanut allergy；leap))以确定在幼儿中预防花生过敏的最佳策略。leap试验由640名4月龄与11月龄之间的儿童组成，这些儿童被鉴定为具有花生过敏的高风险。将这些儿童分为两组：回避和食用(含花生的零食，大于3餐；每周6g花生蛋白)。这项试验的结果表明，如通过口服食物激发(oral food challenge；ofc)测定的，与食用组相比，回避组中在5岁时产生花生过敏的儿童的比例比高4倍至6倍。leap试验的结果公开于例如toit等人,n.engl.j.med.,2015,372,803-813。因此，试验导致美国花生过敏预防指南的改变。
[0123]
方法：
[0124]
为了评估单独表位、表位组合以及表位与其他临床或诊断方法(例如，皮肤点刺测试、花生特异性ige、患者病史和花生组分ige)的组合的重要性，使用本文所述的表位测试进一步评估了leap患者队列的子组。特别地，选择了341名leap符合方案受试者的子组，所述受试者具有至少2个自leap试验期间的时间点的额外的血浆等分试样。表1显示了341名受试者的诊断分类(即，5年过敏状态-第60次访视)。
[0125]
表1
[0126] 回避者食用者结果n(％)n＝172n＝169过敏38(22.1％)0(0.0％)致敏的84(48.8％)119(70.4％)不过敏50(29.1％)50(29.6％)
[0127]
如下确定诊断分类。“过敏”受试者在第60次访视时在花生ofc后表现出临床过敏症状。“致敏的”受试者是ige致敏的，但不过敏，在前三次访视中具有至少一次花生特异性ige＞0.1ku
a
/l并在第60次访视时通过ofc。“不过敏”受试者(以1:1比率从回避者和食用者随机选择的100名受试者)未致敏也不过敏，皮肤点刺测试(spt)呈阴性，并且前三次访视花生特异性ige≤0.1ku/l*，并在第60次访视时通过ofc。
[0128]
如下所述进行了评估受试者在64个特异性表位处的ige和igg4反应性的测定，以
表位选择、珠粒偶联、样品测定、数据采集和统计分析开始。简短地说，在室温下将含有c末端生物素/peg12接头的化学修饰的合成花生肽(长度为15个氨基酸；表示来自三种主要花生蛋白的50个线性表位，ara h1-27个表位、arah2-13个表位以及arah3-10个表位)在pbs/1％bsa缓冲液中避光恒定温和旋转的情况下以4,000nm的浓度与luminex lumavidin微球偶联30分钟。偶联之前，将储备微球以10,000x g离心2分钟，在水浴超声仪中超声处理，并以中速涡旋以重悬微球。随后合并多瓶制备的微球，并再次沉淀，然后除去上清液并重悬于pbs/1％bsa中以用于偶联。通过离心用pbs-tbn/叠氮化物缓冲液(pbs/0.1％bsa/0.02％tween-20/0.05％叠氮化钠)洗涤偶联的微球两次，重悬于pbs-tbn中，并在玻璃血细胞计数器上计数。
[0129]
将六十四种不同花生肽偶联的珠粒区合并在一起以形成浓度为1,000珠粒/丛的“64丛”，并进行luminex测定。将人血浆样品的一式三份孔在pbs-tbn(pbs/0.1％bsa/0.02％tween-20)缓冲液中以1:10稀释，并在室温下与肽偶联的微球丛在避光振荡的情况下孵育2小时。随后将板用pbs-tbn洗涤两次，并将由与藻红蛋白直接偶联的小鼠抗人ige或igg4组成的第二检测抗体加入孔中，并在室温下在避光振荡的情况下孵育30分钟。将板用pbs-tbn洗涤3次，重悬于100μl pbs-tbn中，并转移至第二板，然后在针对高rp1和每个区最少计数50个珠粒而设置的luminex-100上读取。每个板含有一式三份运行的包含150名随机选择的患者样品的血浆混合物的板间对照样品(ipc)以及一式三份运行的仅缓冲液(阴性)对照。从表位测定获得的原始数据报告为中值荧光强度(mfi)。使用以下公式对所有数据进行log2转化：表位值＝log2(mfi+0.05)-平均值(log2(缓冲液+0.05))。
[0130]
评估表位随时间的变化：回避者与食用者的比较：
[0131]
为了评估研究组(回避者和食用者)之间的ige表位差异，测定了与研究开始时的基线访视相比，研究访视中各表位值的倍数变化(v12-v1、v30-v1和v60-v1)。结果按表位作图并总结在图1中。观察到与食用者相比，回避者中的19个表位有较大变化。结果表明，ige序列表位特异性抗体在5岁时产生花生过敏的回避者组的儿童中较早产生(第60次访视)。序列的表位特异性ige抗体主要在两个区中产生：ara h 1：008-066和ara h 2：005-040。此外，似乎对ara h 3：93-115的应答较晚。ige特异性结合的后期变化主要在花生回避者组中；它们对两个区具有特异性，并且它们随时间持续使结合增加。观察到在食用者中ige早期(v12)略有增加，但与产生过敏的受试者所观察到的表位不同。总而言之，观察到ige早期在食用者组中产生，但在与产生过敏的患者重叠的区没有产生。这些数据表明，对某些花生表位的ige应答可能是天然的且瞬时的。综上所述，数据表明这些花生特异性蛋白中的某些表位可能指示了ige过敏应答。
[0132]
为了评估研究组(回避者和食用者)之间的igg4表位差异，测定了与研究开始时的基线访视相比，研究访视中各表位值的倍数变化(v12-v1、v30-v1和v60-v1)。结果按表位作图并总结在图2中。在v30时，两组中所有表位均存在igg4，但食用者中更高。食用者很早就对相关的过敏表位产生了igg4而不是ige，而回避者最终却在ige之后产生igg4。回避者还由于非口服暴露而产生igg4，例如与环境暴露相关(例如灰尘和患者问卷中的过敏原)。总之，结果表明igg4在v30时存在于所有表位处，但在食用者组中显示出总体上更强的结合。此外，食用者组很早(vi2)就在重要的ige表位处产生igg4，而回避者仅在已经产生了ige后才在这些相同表位处产生igg4。
[0133]
由于并非所有的回避者都变得过敏，因此比较了那些过敏性回避者和非过敏性回避者之间的表位反应性。结果总结在图3中。在任何访视时，在非过敏组与致敏组之间均未观察到治疗差异。致敏受试者结合的表位主要不同于变得过敏的表位。仅对于致敏受试者来说，很少的肽在治疗随时间的变化方面具有显著差异。总而言之，结果表明，所有的ige表位特异性反应性都归于过敏回避者而不是非过敏回避者。此外，如图3所示，致敏患者只有少数ige表位在v60时改变，并且这些改变与在过敏组中观察到的不同。
[0134]
igg4表位结合的另一项检查总结在图4中。避免食用花生的非过敏受试者比过敏或致敏受试者更早地(v12和v30)产生更多的igg4。致敏和过敏受试者之间无显著差异，表明igg4没有保护作用。在v60时致敏的患者中，食用花生导致更早产生表位特异性igg，特别是在过敏受试者产生ige的两个区中。总而言之，尽管所有组在60岁时都发生了深刻的变化，但非过敏回避者比过敏或致敏患者更早地(v12，v30)产生更多igg4。但是，致敏患者相对于过敏性患者中的igg4应答之间没有总体差异，这表明igg4不太可能具有保护作用。
[0135]
尽管5岁后在v60时的igg4应答似乎没有保护作用，但回避者组中的非过敏患者与过敏或致敏患者相比在早期(v12和v30)产生更多igg4。此外，致敏和过敏患者的igg4应答之间没有显著差异，表明igg4在总体过敏应答中没有保护作用。结果总结在图5中。
[0136]
然而，与回避者相比，食用确实导致了致敏的食用者中的早期(v12和v30)igg4表位扩增，如图6所示。igg4的这种早期扩增尤其在过敏患者中最大观察ige反应性的区处观察到。总之，在v60时致敏的患者中，食用花生导致更早产生表位特异性igg4，特别是在过敏患者产生ige抗体的两个区中。这些结果表明igg4在抵消过敏应答中可能的早期作用。
[0137]
这些数据合在一起表明，在特定肽处的ige应答和可能的igg4应答可能是在通过一种或多种免疫疗法(例如口服、舌下、皮内、皮下、吸入、表皮或方法的组合)治疗的患者中进行诊断或治疗应答监测以评估适当剂量、治疗进展、不良反应和成功的结果的有用工具。数据还表明，治疗后有可能随访患者以确定食物耐受性是否维持或是否需要再次开始治疗。
[0138]
本文所使用的分析是过敏领域的技术人员通常采用的线性回归分析。简而言之，线性回归是建立将观察值(例如，过敏和非过敏病例)与变量(例如，表位和ige测量值)拟合的线性模型的标准统计方法。例如，使用matlab版本r2015b应用线性回归方法得到以下模型建立，其中x1、x2和x3表示ige和igg4表位变量。
[0139]
一般化线性回归模型：
[0140]
logit(y)～1+x1+x2+x3
[0141]
分布＝二项式
[0142]
估计系数：
[0143][0144][0145]
133个观察值，129个误差自由度
[0146]
分散度：1
[0147]
chi
2-统计相对于常数模型：25.2，p值＝1.42e-05
[0148]
选择阈值以优化所得线性回归模型的阴性预测值。ige阈值的单位为(ku/l)。多于一种表位的逻辑回归模型的阈值是无量纲的。
[0149]
实施例2：评估预测花生过敏的表位分类器
[0150]
为了使用此相同的(leap)队列评估ige和igg4表位反应性的诊断适用性，选择了最终诊断通过ofc证实的患者，以开发算法并鉴定用于预测过敏的分类器。
[0151]
使用来自leap试验中招募的341名处于花生过敏高风险的儿童的样品，评估了5年内的ige/igg4表位特异性结合(图7)。ige表位特异性抗体在回避组的患者中产生，并且对5岁时患有花生过敏且主要在两个区中的患者具有特异性(见图7，绿色箭头，左图)。igg4表位特异性抗体在所有患者中均增加，表明在花生回避者中花生暴露是通过非口服途径发生的。特别是，花生食用者早期产生igg4(见图7，右图)，特别是在相关区中(见绿色箭头)，转向“保护性”igg4应答而不是ige，而花生回避者最终除ige之外还产生igg4抗体。所述测定已对花生进行了验证，并且在先前pa患者的cofar队列和leap队列中，针对所有花生特异性表位确定了类似的优良icc值＞0.90(大多数情况下＞0.95)。结果表明，早期食用或避免花生诱导ige表位库的与干预结果相关的变化。
[0152]
具有最佳auc性能的表位：
[0153]
病例和对照分别定义为ofc证实的过敏患者和非过敏患者。然后将所有ige表位单独地作为用于预测过敏或非过敏的分类器进行评估。auc用作性能度量。表2显示了表现最佳的10个表位(过敏性表位)。
[0154]
表2
[0155]
ige分析物auc表位580.73arah 2.008270.68arah 1.047410.67arah 1.167100.65arah 1.022210.65arah 1.040450.64arah 1.176920.64arah 3.102250.64arah 1.045520.64arah 1.194380.64arah 1.131
[0156]
具有最佳auc性能的综合测试：
[0157]
病例和对照分别定义为ofc证实的过敏患者和非过敏患者。将数组ige和/或igg4表位作为用于预测过敏或非过敏的分类器进行评估。auc用作性能度量。此外，还包括还结合了其他临床测量(例如spt结果、特异性花生ige(sige)测量和花生全蛋白组分(ara h2))的组的实例。通过使用标准线性回归方法形成小组。符号[a b c]用于表示通过线性回归将一组表位和/或临床测量a、b和c整合到组中。使用线性回归来评估因子的组合(本文所述的花生肽和/或其他因子)是本领域技术人员众所周知的。这种组合的代表性实例包括但不限于：
[0158]
[ige_ara h 2.008,igg4_arah 2.021,igg4_ara h 3.152]具有auc＝77％
[0159]
[ige_ara h 2.008,igg4_arah 2.021,spt]具有auc＝81％
[0160]
[ige_ara h 2.008,igg4_arah 2.021,igg4_ara h 3.152,sige]具有auc＝81％
[0161]
[ige_ara h 2.008,igg4_ara h 2.021,igg4_ara h 3.152,ara h2]具有auc＝75％
[0162]
通常，花生肽与任何其他因子的任何组合的auc小于50％表示非过敏状态，而auc大于或等于50％表示过敏状态。在一些实施方案中，花生肽与任何其他因子的任何组合的auc小于55％表示非过敏状态，而auc大于或等于55％表示过敏状态。在一些实施方案中，花生肽与任何其他因子的任何组合的auc小于60％表示非过敏状态，而auc大于或等于60％表示过敏状态。在一些实施方案中，花生肽与任何其他因子的任何组合的auc小于65％表示非过敏状态，而auc大于或等于65％表示过敏状态。在一些实施方案中，花生肽与任何其他因子的任何组合的auc小于70％表示非过敏状态，而auc大于或等于70％表示过敏状态。
[0163]
分层综合测试(预示)
[0164]
此实施例中采用的方法与上述部分中相同，不同的是以分层方式执行分类。首先，sige测量用于鉴定非过敏病例。对于那些未通过sige分类的患者，然后使用逻辑回归组[ige_ara h 2.008，igg4_ara h2.021，igg4_ara h 3.152]来将其余患者分类为过敏或非过敏。如果sige≤0.03ku
a
/l，则受试者“不过敏”。如果[ige_ara h 2.008，igg4_ara h 2.021，igg4_arah 3.152]≤0.20，则受试者“不过敏”。否则，受试者为“过敏”。此分层分类器中的阈值用于做出分类决策。此因子的组合在文中用于例如消除假阳性。这些可以变化以实现不同的分类结果。在提供的实施例中，分层分类器的灵敏度和特异性分别为90％和54％。
[0165]
实施例3：试验
[0166]
基于文中提供的有力数据，预期ige/igg4与花生表位的结合模式的信息量很大并且可用于表征患者过敏疾病的严重程度，纵向评估患者以指导最初和研究期间的给药，在研究期间跟踪或预测不良事件(以改善安全性)，在治疗的临床终点确认患者的过敏状态以及监测患者的治疗后以确定是否/何时需要其他治疗以维持治疗应答性。
[0167]
将鉴定患者样品的子组。最低限度地，样品将包括ar101治疗组和安慰剂组，所述组包括以下患者：1)直到临床终点保留在研究中；2)在临床终点后继续监测以评估持续无应答性；3)由于不良反应而退出研究；4)退出研究，而无不良反应；5)具有在研究期间的多个纵向时间点可用的血清组分和ofc数据；以及6)属于不同的给药方案组或在研究期间以不同的速率递增。
[0168]
在oit启动后的不同时间点从试验中所招募的患者取得的血浆或血清样品将在对于与试验相关的临床信息不知情下进行测定。使用本文所述的方法(例如64丛花生(ara h1、h2和h3)表位测试)测定样品的ige、igg4和iga表位结合。
[0169]
表位分析(基于珠粒的表位测定(bbea))：对于表位作图，本方法将特定食物中存在的蛋白质细分为较小的肽或由两个或更多个氨基酸组成的化合物。对于表位区分，将作图的肽分别连接到珠粒上，以允许高通量分析和表位结合评估。对于表位模式确定，确定患者的ige应答的反应性。在反应中，抗体连接到珠粒，并且所述测试被设计成分离并确定每种肽的个性化反应，因此临床医生可以更准确且完整地了解患者过敏概况。将结果用单个
肽结果进行“作图”，创建用于分类患者的治疗应答图谱。
[0170]
简而言之，对于表位测定，将花生肽(cs bio,menlo park,ca,usa)与lumavidin珠粒(luminex corporation,austin,tx)偶联，并储存在pbs-tbn缓冲液(1x pbs+0.02％tween20+0.1％bsa)中。在pbs-tbn缓冲液中制备肽偶联珠粒的主混合物，并将100μl珠粒主混合物添加到过滤板。洗涤珠粒后，将100μl受试者血浆以1:10稀释添加到一式三份孔中。在室温下将板在振荡器上以300rpm孵育2小时。除去过量的血浆，并洗涤板。加入50μl/孔的小鼠抗人ige-pe(thermo-pierce antibodies，克隆be5，1:50稀释于pbs-tbn中)或小鼠抗人igg4 fc-pe(southembiotech，克隆hp6025，1:400稀释于pbs-tbn中)第二抗体，并将板孵育30分钟。最后一次洗涤后，将100μl pbs-tbn缓冲液添加到每个孔中以重悬珠粒，然后将其转移到固定底部的96孔读取板，并在luminex 200仪器(100/200
tm
系统,luminex corporation,austin,tx)上定量。
[0171]
所有样品均一式三份处理。为了消除背景强度，还在每个板中一式三份处理缓冲液样品(pbs-tbn缓冲液)。每个表位和样品的中值荧光强度(mfi)直接从luminex读数器的输出获得。对于每个样品i和表位j，结合测量值b
ij
定义为：
[0172][0173]
其中ns表示非特异性结合(缓冲液)样品。
[0174]
实施例4：研究队列
[0175]
将来自cofar2前瞻性儿科队列的花生非过敏和过敏患者的血浆样品用于分析。将每次访视时的过敏诊断定义为：1)过敏(血清学：花生sige＞14ku
a
/l；证实：ofc+或(令人信服的病史+血清学))；2)非过敏(致敏：耐受，但花生sige＞0.35ku
a
/l；未致敏：耐受且无花生sige的证据)。安排三次访视：1)基线(约0年)；2)第2次访视(约2年)；以及3)第5次访视(约4年以上)。基线信息呈现于表3。
[0176]
表3
[0177][0178]
先前的研究表明，年龄(
↑
较年轻)、性别(
↑
男性)、种族(
↑
非裔美国人)以及过敏反应的程度和病史预测了花生过敏。在本队列中，基线时的那些预测指标中，过敏和非过敏组相当。由于cofar招募有花生过敏高风险的儿科患者，因此两组中ad患病率均很高(90％和98％)。患者的基线信息见表4。
[0179]
表4
[0180][0181]
在基线时，所有过敏患者均为“血清学”[0182]
随着时间的推移，更多的过敏儿童表现出ige与更多数目的表位的结合。在所有访视中，在过敏与非过敏的5名儿童之间均观察到ige表位库的明显差异。在所有结果中，igg4随着年龄而增加，在第5次方式时两组之间的igg4图谱非常相似。图8显示了结果。
[0183]
已经开发了几种关于表位的模型，包括例如随机森林(rf)和交叉验证(cv)。rf模型在交叉验证中表现良好，特别是对于2岁和4岁以上的儿童(参见表5)。rf模型可以在几乎100％的患者中正确预测训练组中的过敏诊断(参见表6)。cv是模型在所有训练迭代中表现如何的度量，并被视为对预测模型的无偏评估(参见图9)。
[0184]
表5
[0185][0186]
表6
[0187][0188]
alg＝过敏
[0189]
表位模型是在实际测试中进行的。测试数据具有：1)v0时的35名(21名过敏)患者；2)v2时的31名(14名过敏)患者；和3)v5时的46名(24名过敏)患者。测试中的auc提供了以下结果：1)0.70-11错误分类-v0；2)0.88-4错误分类-v2；3)0.84-7错误分类-v5；和4)0.84-18错误分类-所有访视。测试中的性能度量如图10所示。
[0190]
将表位模型在测试数据中的性能与基于immunocap数据的过敏诊断进行比较。如果患者对花生、ara h1、ara h2和ara h3具有15个阳性(≥0.35ku
a
/l)sige，则immunocap诊断为“过敏”。对于每次访视(以及所有访视组合)，基于表位的模型优于基于组分的过敏诊断(参见图11)。测试数据中只有10名患者具有ofc证实的诊断，表位和immunocap均正确诊断出8/10名儿童。
[0191]
研究了表位与针对花生的sige之间的关系。与组分蛋白或其线性表位相比，2岁以下的儿童更可能产生针对全花生提取物的抗体。此外，包括针对全花生的sige可能有助于鉴定非常年幼的过敏儿童。图12中描绘了cv中的auc。正如预期的那样，对于0岁模型，sige是最佳预测指标，并且cv中的模型性能得到了改善，auc达到0.98(相比于0.89)。第2次访视和第5次访视的auc保持不变。
[0192]
使用三组预测指标来预测过敏结果：1)表位；2)表位+花生特异性ige；和3)花生特异性+组分特异性ige：针对花生、ara h1、ara h2和ara h3的sige。单独针对表位的ige抗体能够在大多数患者中准确诊断花生过敏，并且好于组分(见表7和图13)。添加针对花生的sige进一步改善表位模型在cv和测试中的性能，正确诊断出95％(107/112)的患者。
[0193]
表7
[0194][0195]
表位图谱显示出作为诊断花生过敏的预测性生物标记的有希望的性能。使用单独表位，任何访视时83％的儿童被准确地鉴定为“过敏”，与之相比使用immunocap标准指南时则为70％。在2岁访视或以后，当鉴定儿童花生过敏时，表位和组分测试都表现更好。将针对全花生的sige添加到表位模型中显著改善诊断模型性能，测试数据的准确性＞95％。
[0196]
实施例5：花生过敏诊断的发现和验证
[0197]
方法
[0198]
发现：对来自leap研究的回避组的133名受试者(31名过敏，102名非过敏)进行测试发现。所有诊断均在5岁时通过ofc确定。获得每个受试者在第2.5年和第5年时的血浆样品。使用上述bbea方法对这些样品进行分析，以获得每个受试者在第2.5年和第5年时的ige和igg4表位水平。通过所有ige(igg4)表位测量的中值将每个受试者的ige(igg4)表位水平归一化。
[0199]
在第5年时对数据进行分析，以确定用于区分过敏和非过敏受试者的表现最佳的ige或igg4表位。具体而言，表现最佳的ige或igg4表位是在通过低于0.1ku/l的花生特异性ige(sige)水平对受试者进行初次分类后，将这些受试者分类为过敏或非过敏的具有最佳auc的表位。然后证实，此相同的ige或igg4表位在第2.5年时也是表现最佳的表位。
[0200]
在鉴定表现最佳的表位和决定阈值后，在验证前将诊断测试完全锁定。
[0201]
验证：对来自cofar2研究的81名受试者(23名过敏，58名非过敏)进行了测试验证。所有诊断均在5岁时通过ofc确定。获得每个受试者在第2年和第5年时的血浆样品。使用上述bbea方法对这些样品进行分析，以获得每个受试者在第2年和第5年时的ige和igg4表位水平。通过所有ige(igg4)表位测量的中值将每个受试者的表位水平归一化。在诊断测试完全锁定之前，所有数据均保持不知情。
[0202]
使用预定义的假设和阈值对诊断测试进行验证。首先，使用卡方检验对于第5年时的受试者的关联，使用sige的阈值0.1ku/l和最佳ige(igg4)表位的阈值0.30进行的诊断测试的性能是统计学显著的。类似地，评估了诊断测试对于第2年时受试者的性能。使用matlab r2015b进行所有数据分析。
[0203]
使用的综合测试算法(其中阈值t的各种值得到验证)包括初始查询：sige≤0.10？如果此初始查询的答案为“是”，则得出结论“不过敏”。如果初始查询的答案为“否”，则要求进行后续查询：ige h2.008≤t？如果此后续查询的答案为“是”，则得出结论“不过敏”。如果对后续查询的回答为“否”，则得出结论“过敏”。sige的单位是ku/l，并且ige h2.008测量值是无量纲的。
[0204]
结果
[0205]
发现：表8呈现了leap队列中前三个ige和/或igg4表位的性能，两者均是单独的并且同样在阈值0.1ku/l下通过分类之后。数据在第2.5年和第5年呈现。
[0206]
表8：单独和与sige结合使用时表现最佳的表位，其中将auc用作度量
[0207][0208]
发现数据表明，表位ige h2.008在第2.5年和第5年时均具有最佳性能。此外，统一
表位在单独和与sige组合时均具有最佳性能。
[0209]
验证：leap和cofar2研究的人口统计学描述于例如toit等人,n.engl.j.med.,2015,372,803-813和万维网“leapstudy.co.uk/”(leap)以及sicherer等人,jaci,2016,137,ab152和万维网“clinicaltrials.gov/ct2/show/nct00356174”(cofar2)。
[0210]
图14呈现了roc曲线图，其比较了组分h1、h2、h3、表位ige h2.008、sige以及与sige组合的性能。
[0211]
表9呈现了单独测量以及与sige结合的测量的性能。给出了阈值t的各种说明性值的综合测试(sige+h2.008)。
[0212]
表9
[0213]
诊断auc灵敏度特异性npvppvh164％78％40％82％34％h274％83％43％86％37％h352％91％9％71％28％ige h2.00884％91％53％94％44％sige77％91％36％91％36％sige+h280％91％40％92％38％sige+h2.008(t＝.30)88％91％79％96％64％sige+h2.008(t＝1.2)88％70％97％89％89％sige+h2.008(t＝2.0)88％48％98％83％92％
[0214]
在此实施例中，综合测试是npv为96％的有力的排除测试(t＝0.30)。相反，综合测试是ppv为92％的有力的划入测试(t＝2.0)。在t＝1.2时，综合测试是有力的划入和排除测试。
[0215]
在第2年时，sige+ige_h2.008的性能稳定，其中auc、灵敏度、特异性、npv和ppv分别为88％、96％、71％、98％和56％。单独或与sige组合的ige h2.008的统计显著性在第2年和第5年时的p值＜0.0001。
[0216]
实施例6：多表位分类器
[0217]
方法
[0218]
根据以下标准评估leap和cofar2样品组中的ige表位：1)在两项研究中均具有可再现的高性能(auc)；以及2)在两项研究中参与大小为2的高性能表位组(使用逻辑回归模型)的频率。
[0219]
结果
[0220]
使用上面列出的标准，下表10中列出的表位是在多个表位组上表现良好的再现性最好的表位。使用逻辑回归拟合呈现了它们作为单变量预测指标以及与ige h2.008组合的性能。
[0221]
表10
[0222][0223]
在形成高性能多表位诊断分类器时，表11中的表位是最佳选择。
[0224]
实施例7：多生物标记分类器
[0225]
方法
[0226]
将leap和cofar2样品组中的ige表位与皮肤点刺测试(spt)和花生特异性ige(sige)相结合，并根据以下标准评估：1)在两项研究中均具有可再现的高性能(auc)；以及2)参与高性能表位组(使用逻辑回归模型)的频率并且spt是相对于风团大小报告的。
[0227]
预期用例：预期用例是在进行spt之后将下令进行的血液测试。spt的结果(风团大小)将在测试请求表上提供。
[0228]
预期用途：血液测试的预期用途是以高概率确定被测受试者是否患有花生过敏。
[0229]
单阈值测试：单阈值测试如下：如果sige≤0.10、或spt≤t1、或h2.008≤0.8、或h2.010≤t2，则受试者不过敏。否则，受试者过敏。
[0230]
本质上，测试表明受试者必须具有构象表位命中(conformational epitope hit)(sige)、阳性spt和多个线性表位命中才能对花生过敏。
[0231]
表11显示了此测试的性能，其取决于t1和t2的选择。
[0232]
表11
[0233]
t1t2灵敏度特异性npvppv01.165％97％88％88％40.7594％91％91％94％
[0234]
双阈值测试：双阈值测试如下，其中t2和t3分别是下阈值和上阈值：如果sige≤0.10、或spt≤t1、或h2.008≤0.8、或h2.010≤t2，则受试者不过敏。否则，如果h2.010≥t3，则受试者过敏。否则，测试结果是未确定的。
[0235]
表12显示了此测试的性能，其取决于t1、t2和t3的选择。
[0236]
表12
[0237]
t1t2t3％未确定*npvppv00.751.265％90％93％00.751.2610％90％100％40.751.102％91％100％
[0238]
应注意，当存在两个阈值时，无法指定测试的灵敏度和特异性。对于大多数人来说，双阈值测试具有挑战性。
[0239]
*未确定的病例的百分比是估计值。
[0240]
实施例8：随机森林分类器
[0241]
方法
[0242]
利用来自cofar自然病史研究的318名受试者队列，测量在3-15个月至8岁的高风险婴儿中ige和igg4与序列过敏原性花生表位的结合，并确定它们预测临床花生过敏的效用。使用基于luminex珠粒的测定评估了与在ara h1-3上发现的序列表位结合的ige和igg4抗体。在基线、第2年和第5年评估来自318名受试者的血清的ige和igg4表位特异性抗体。随机森林和机器学习算法用于建立模型，所述模型可以基于表位结合图谱(ebp)预测其过敏状态的结果。通过重采样方法和使用来自相同队列(原始组的30％)的结合样品的验证来评估模型性能，并且获得准确性、auc、灵敏度和特异性以及置信区间。随机选择二百二十五(225)名受试者进行“模型开发”，并且93名受试者进行“测试”，在第5年时分别共计122名和48名过敏患者。
[0243]
结果
[0244]
使用年龄不可知模型以及对每个年龄的特定模型，发现后者获得更好的结果。ige图谱足以预测ofc结果，而仅具有igg4的模型表现不佳。年龄不可知模型不如年龄特定模型准确。在评估的策略中，具有向下bootstrap重采样的随机森林算法表现最佳，在第0年时的交叉验证中平均auc＞0.87，在第2年和第5年时进行的ofc达到0.99和0.95。然后，在
‘
看不见的
’
测试数据中评估每个年龄组的最终基于ige的模型。在76名患者中准确预测基线时的过敏状态(准确性82％)，在第2年和第5年时过敏状态的准确性更高(分别为91％和87％)。尽管特异性在所有年龄组中均是相当的，但第一年的模型的真阳性率较低。由于较年轻的过敏患者倾向于对非线性构象表位发生反应性，因此还开发了使用花生特异性ige作为分类器的算法。与使用随机森林算法的单独表位相比，包括花生特异性ige(sige)显著改善了模型，并且性能总结在下表13中。
[0245]
表13
[0246][0247][0248]
在表13中，作为随机森林预测指标t1(无sige)和t2(有sige)的一部分出现在至少75％的顶级模型“袋装频率(bagging frequency)”中的表位如下列出：t1表位，按bf顺序：h2.008_ige、h2.008_igg4、h1.021_ige、h1.030_ige、h1.040_ige、h3.102_ige、h1,186_igg4、h1.015_ige、h2.010_igg4、h2.037_igg4、h3.080_ige、h1,194_ige、h1.041_ige、h3.152_igg4、h2.017_ige；t2表位，按bf顺序：h2.008_ige、h2.008_igg4、h1.021_ige、h1.015_ige、h1.029_ige、h2.010_igg4、h1,194_ige、h1,186_igg4。
[0249]
除了本文所述的那些之外，本领域技术人员从前文的描述中将显而易见地知道所述主题的各种修改。所述修改也意欲落入所附权利要求书的范围内。本申请中引用的每个参考文献(包括但不限于期刊文章、美国和非美国专利、专利申请公布、国际专利申请公布、
基因库登录号等)以引用的方式整体并入本文。