高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒。1）食物过敏原蛋白偶联磁珠，所述的食物过敏原包括但不限于水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白；2）构建标准曲线：梯度稀释抗食物过敏原的IgG抗体标准品与食物过敏原蛋白偶联磁珠进行免疫反应，然后利用抗人IgG二抗进行信号放大反应，根据平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；3）筛查食物过敏原，利用食物过敏原蛋白偶联磁珠与过敏患者的血清进行免疫反应，然后利用抗人IgG二抗进行信号放大反应，然后确定食物过敏原的种类及对应的抗体的浓度。本发明灵敏度范围不高于2pg/mL，可适用于转基因食品的过敏原检测。
【专利说明】高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及食物安全及过敏检测领域，尤其涉及一种高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]过敏性疾病影响全世界近四分之一的人口，被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。食物过敏医学上也称变态反应，是指机体受抗原(包括半抗原)刺激后，产生相应的抗体或致敏淋巴细胞，当再次接触同一种抗原后在体内引起体液或细胞免疫反应，由此导致组织损伤或机体生理机能障碍。它是一种复发率很高的疾病。据食品过敏或过敏性反应网络统计，约有90%的过敏反应是由花生、果仁、鱼、贝类、鸡蛋、牛奶、大豆、鱼虾、蘑菇和小麦等食物引起(以花生引起的过敏最为严重)，10%的过敏是由170多种其他食物引起。根据流行病学调查，近年来过敏症发病率呈逐年上升的趋势。据调查西方大概有20-25%的人受过过敏原的袭扰，我国大约有5-10%的人受过敏原的袭扰。上海、浙江、广东等沿海地区收过敏原袭扰的人群已超过10%，随着工业的快速发展，生活水平的提高，饮食的改善，受过敏原袭扰的人群每年以1.5%的速度增加。美国每年约有29T2.5%的人发生食物过敏，儿童及婴幼儿的发病率约59T8%。据不完全统计，我国的发病率高于发达国家。目前，随着科技进步和经济的发展，产生了诸多新的食品资源，以及食品生产、流通、消费方式的改变，传统的食物过敏的地域性打破，并且随着转基因作物的大量出现，许多新的转基因食品大量涌现，也使得食物过敏更具备了潜在的危险性。食物过敏在相当大的程度上危害着过敏人群的健康，保护消费者食品安全已经成为食品安全管理部门及食品生产企业所面临的重要问题。
[0003]许多人在直接或者间接接触这些过敏原之后，会因过敏而患上支气管哮喘、上呼吸道结膜炎、湿疹、皮炎等症，有时甚至产生危及生命的过敏性休克。因此迫切需要从众多食物中筛查出隐藏的过敏原，让易敏者避开含有致敏成分的食物以及治疗过敏反应，同时排除类似过敏症状慢性疾病的误诊。过敏患者由于摄入引发过敏反应的食物过敏原蛋白后，体内嗜碱粒细胞和肥大细胞脱颗粒化引起特异性的IgG沉淀抗体进入血液，使血液中这种特异性IgG抗体水平提高。该特异性IgG抗体在体外能识别其对应的抗原，即食物过敏原蛋白，并与之结合。
[0004]对于过敏原性的检测，体内实验方法可提供最为直接的证据，如双盲食物激发试验和皮肤针刺试验，但由于安全因素等方面的考虑，只有在不得已的情况下在医院进行，而且费用昂贵、风险大；与此相比体外实验方法具有方便、安全的优点，但却存在着准确性差的缺点。随着科技的发展，未来食品过敏原检测将向准确、安全、经济、快速、高通量、高灵敏度的体外检测技术方向发展。
[0005]食物过敏原诊断试剂的种类很多，影响试剂质量的因素也很多，为保证试剂质量需要尽可能的提高技术指标。灵敏度作为一项重要的技术指标，对试剂盒的评价具有重要的意义。因为极少量的分析物可能对界定疾病状态、疾病筛查有重要意义。在食物过敏原检测中体内产生的抗体是十分微量的，而市场上现有技术大多只能达到纳克级，在检测低于此浓度时就变得比较困难，而难以达到预期目的。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒。
[0007]一种高灵敏食物过敏原检测方法，步骤如下:
1)食物过敏原蛋白偶联磁珠，所述的食物过敏原包括但不限于水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白；
2)构建标准曲线:梯度稀释抗食物过敏原的IgG抗体标准品与食物过敏原蛋白偶联磁珠进行免疫反应，然后利用抗人IgG 二抗进行信号放大反应，根据平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；
3)筛查食物过敏原，利用食物过敏原蛋白偶联磁珠与过敏患者的血清进行免疫反应，然后利用抗人IgG 二抗进行信号放大反应，然后根据得到的信号与步骤2)所得的标准曲线确定食物过敏原的种类及对应的抗体的浓度。
[0008]所述的信号放大反应为显色反应。
[0009]所述的步骤3)中确定食物过敏原的种类的cut-off值设定为抗体浓度Ing/mL的值在标准曲线对应的吸光度值。
[0010]所述的步骤I)中，具体方法如下: 1.1)取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸盐缓冲液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min ；
1.2)将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；重复洗涤3次，最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；
1.3)再向其中加入5ug/mL的食物过敏原蛋白500uL，1%牛血清蛋白luL，把离心管置于摇床上，40 °C条件下反应45min ；
1.4)重复1.2)的洗涤步骤；
1.5)加入4.9901^ 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与IOuL 1%BSA溶液，4°C条件下封闭保
存待用。
[0011]所述的步骤3)中，具体方法如下:
3.1)取若干只2mL的离心管，分别加入300uL偶联食物过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次。最后吸干；
3.2)向洗涤后的磁珠中加入120uL，含20%甘油，梯度稀释的抗体，室温条件下孵育40min ；
3.3)孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体；
3.4)向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL，含20%甘油，室温条件下孵育40min ；
3.5)重复步骤3.3)； 3.6)向洗涤后的磁珠中加入IOOuL的TMB显色液，避光反应15min ；
3.7)避光反应后，向其中加入IOOuL ImoL/L的盐酸溶液，终止反应，并把液体转移到酶标板上；
3.8)用酶标仪读取吸光度值；
3.9)结果计算。
[0012]所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者无基团,粒径大小在100nnT3um。
[0013]食物过敏原检测试剂盒，它包括但不限于已包被的水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白中的一种或多种的磁性纳米微球、人IgG标准液、辣根过氧化物酶标记二抗、TMB、样品稀释液、洗涤液和终止液，灵敏度范围不高于2pg/mL。
[0014]所述的试剂盒，适用于转基因食品的过敏原检测。
[0015]本发明的有益效果:将磁珠作为固相载体，来代替ELISA检测中的酶标板微孔。此固相载体相比于普通ELISA的酶标板微孔拥有更大的表面负载量，并且可以对目标物质具有更强的富集作用，通过外加磁场和洗涤的过程可以对目标物起到一个浓缩的作用，最终提高食物过敏原检测的灵敏度、准确性和线性范围。灵敏度范围不高于2pg/mL，可适用于转基因食品的过敏原检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是实施例四中试剂线性实验的结果示意图；
图2是实施例试剂线性实验的结果示意图。
【具体实施方式】
[0017]以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
[0018]本发明的食物过敏原检测试剂盒，其组成包括已包被的水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白的磁性纳米微球，人IgG标准液、辣根过氧化物酶标记二抗，TMB，样品稀释液，洗涤液和终止液。
[0019]1、食物过敏原蛋白偶联磁珠
①取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸盐缓冲液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min。
[0020]②将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL 50mMpH6.5的磷酸盐缓冲液；如此重复洗涤3次，最后一次加入4.499mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液。
[0021]③再向其中加入5ug/mL的食物过敏原蛋白500uL，l%牛血清蛋白luL，把离心管置于摇床上，40°C条件下反应45min。
[0022]④重复②的洗涤步骤。
[0023]⑤加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与IOuL 1%BSA溶液，4°C条件下封闭保存。待用。
[0024]2、食物过敏原检测试剂盒的使用方法①取若干只2mL的离心管，分别加入300uL偶联食物过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次。最后吸干。
[0025]②向洗涤后的磁珠中加入120uL (含20%甘油)梯度稀释的抗体,室温条件下孵育 40min。
[0026]③孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体。
[0027]④向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL (含20%甘油)，室温条件下孵育40min。
[0028]⑤重复步骤③。
[0029]⑥向洗涤后的磁珠中加入1OOuL的TMB显色液，避光反应15min。
[0030]⑦避光反应后，向其中加入IOOuL ImoL/L的盐酸溶液，终止反应。并把液体转移到酶标板上。
[0031]⑧用酶标仪读取吸光度值。
[0032]⑨结果计算 取重复孔平行三次的吸光度平均值；以系列标准溶液的平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；计算样品重复孔的平均吸光度值大于CUt-Off值(Ing/mL对应的吸光度)的那个吸光度值从标准曲线中计算出食物过敏原抗体的含量，此含量反应了患者的过敏程度。
[0033]实施例一
I对虾过敏原蛋白偶联磁珠
①取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸盐缓冲液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min。
[0034]②将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL 50mMpH6.5的磷酸盐缓冲液；如此重复洗涤3次，最后一次加入4.499mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液。
[0035]③再向其中加入5ug/mL的对奸过敏原蛋白500uL (对奸过敏原是一种相对分子质量约36Kd的酸性糖蛋白，属肌肉中的原肌球蛋白。蛋白浓度1.5mg/mL，溶于PBS，效价≥1:1000-5000。)，1%牛血清蛋白luL，把离心管置于摇床上，40°C条件下反应45min。
[0036]④重复②的洗涤步骤。
[0037]⑤加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与IOuL 1%BSA溶液，4°C条件下封闭保存。待用。
[0038]2对虾过敏原抗体的检测方法
①取3只2mL的离心管，分别加入300uL偶联对虾过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次。最后吸干。
[0039]②向洗涤后的磁珠中加入120uL (含20%甘油)的小鼠抗对虾过敏原蛋白单克隆抗体(溶于 PBS，pH7.4 中，蛋白浓度 lmg/mL，含 BSA 等稳定剂，ELISA(1:500)，IHC(1:200)，IP (1:50), WB (1:300)。)，室温条件下孵育 40min。
[0040]③孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体。
[0041]④向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL (含20%甘油)，室温条件下孵育40min。
[0042]⑤重复步骤③。
[0043]⑥向洗涤后的磁珠中加入IOOuL的TMB显色液，避光反应15min。
[0044]⑦避光反应后，向其中加入IOOuL ImoL/L的盐酸溶液，终止反应。并把液体转移到酶标板上。
[0045]⑧用酶标仪读取吸光度值。
[0046]⑨结果计算
取重复孔平行三次的吸光度平均值；以系列标准溶液的平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；计算样品重复孔的平均吸光度值大于CUt-Off值(Ing/mL对应的吸光度)的那个吸光度值从标准曲线中计算出对虾过敏原抗体的含量。特异性达91.3%。
[0047]实施例二:食物过敏原筛查试验
对35例食物过敏患者抽取血液，将其制备血清，来筛查食物过敏原。检测吸光度值，计算抗体浓度，其中值大于cut-off值(Ing/mL对应的吸光度)的判断为阳性。其检测结果如下表1所示:
表1
【权利要求】
1.一种高灵敏食物过敏原检测方法，其特征在于，步骤如下: 1)食物过敏原蛋白偶联磁珠，所述的食物过敏原包括但不限于水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白； 2)构建标准曲线:梯度稀释抗食物过敏原的IgG抗体标准品与食物过敏原蛋白偶联磁珠进行免疫反应，然后利用抗人1gG 二抗进行信号放大反应，根据平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线； 3)筛查食物过敏原，利用食物过敏原蛋白偶联磁珠与过敏患者的血清进行免疫反应，然后利用抗人1gG 二抗进行信号放大反应，然后根据得到的信号与步骤2)所得的标准曲线确定食物过敏原的种类及对应的抗体的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的信号放大反应为显色反应。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中确定食物过敏原的种类的cut-off值设定为抗体浓度1ng/mL的值在标准曲线对应的吸光度值。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中，具体方法如下: .1.1)取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸盐缓冲液、1mL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和1OOuL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min ； .1.2)将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；重复洗涤3次，最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液； .1.3)再向其中加入5ug/mL的食物过敏原蛋白500uL，1%牛血清蛋白luL，把离心管置于摇床上，40 °C条件下反应45min ； .1.4)重复1.2)的洗涤步骤； .1.5)加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与1OuL 1%BSA溶液，4°C条件下封闭保存待用。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中，具体方法如下: .3.1)取若干只2mL的离心管，分别加入300uL偶联食物过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次； 最后吸干； .3.2)向洗涤后的磁珠中加入120uL，含20%甘油，梯度稀释的抗体，室温条件下孵育40min ； .3.3)孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体； .3.4)向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL，含20%甘油，室温条件下孵育40min ； .3.5)重复步骤3.3)； .3.6)向洗涤后的磁珠中加入1OOuL的TMB显色液，避光反应15min ； .3.7)避光反应后，向其中加入1OOuL 1moL/L的盐酸溶液，终止反应，并把液体转移到酶标板上； .3.8)用酶标仪读取吸光度值； .3.9)结果计算。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者无基团，粒径大小在100nnT3um。
7.一种根据权利要求1所述的方法的食物过敏原检测试剂盒，其特征在于，它包括但不限于已包被的水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白中的一种或多种的磁性纳米微球、人IgG标准液、辣根过氧化物酶标记二抗、TMB、样品稀释液、洗涤液和终止液，灵敏度范围不高于2pg/mL。
8.根据权利要 求7所述的试剂盒，其特征在于，适用于转基因食品的过敏原检测。
【文档编号】G01N33/68GK103616520SQ201310645509
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】沈晓亮, 钱兵, 刘意, 宋伟杰, 方序, 叶俊英, 董婧 申请人:浙江天科高新技术发展有限公司, 杭州赛恩生物技术有限公司