一种快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金 法。
【背景技术】
[0002] FA0/WH0认定的导致人类食物过敏的八大类食品中，牛乳及其制品就是其中之 一。在欧美的食品标签法中也规定了牛乳是必须标示的食物过敏原成分。乳球蛋白 (0-lactoglobulin，0LG)是牛乳中的主要过敏原，牛乳过敏原0LG的检测方法目前主要 是针对牛乳中特异性过敏原蛋白质或编码过敏原的DNA片段。以DNA片段为检测目标的 检测的手段，依赖聚合酶链式反应（PCR)来扩增特定的DNA片段，检测食品中过敏原基因的 DNA残留，这种技术是把编码过敏原蛋白的DNA作为食物过敏物质的检测目标而不是检测 过敏原蛋白本身。这类方法目前应用比较广泛是定性PCR和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)。Real-time PCR可以利用特异性探针提高检测的特异性。目前，PCR技术已用于不同 食品过敏原的检测。但食物过敏反应主要是由于食物中过敏原蛋白所引起，并不是蛋白对 应的基因本身，PCR出现阳性结果也不能说明食物中含有对应的过敏原蛋白。因此，以检测 过敏原基因为基础的方法并不是理想的检测方法，在实际检测中应用较少。
[0003] 检测食物中特异性过敏原蛋白质的方法主要是基于蛋白与特异抗体的免疫反 应性。制备高效价的特异性抗体是过敏原蛋白检测的关键。在牛乳过敏原的免疫检测 中就是利用抗原和抗体的特异结合的原理。目前，最主要的免疫检测方法就是ELISA法 (Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。有两种半定量的 ELISA 方法：分别是双 抗体夹心法（Double antibody sandwich method ELISA，S_ELISA)和竞争法（Competitive ELISA，C-ELISA)，其中双抗体夹心法灵敏高，也最为常用。ELISA的蛋白检测方法主要是检 测食品中的牛乳总蛋白或牛乳主要过敏原（0 LG，CNs，BSA)，S-ELISA的检出限（L0D) -般 是约为2. 5ppm，C-ELISA的L0D -般约为lppm。ELISA的检测所用时间大约2h~4h。纯化 的抗0LG多克隆抗体已经用于双抗体夹心法检测婴幼儿奶粉和人乳中低剂量的0LG，其 检出限可达到0.002 mg* mL'目前，基于抗0LG单克隆抗体的双抗体夹心法也用于检测 天然或变性的0LG，可检测热处理后变性的牛乳及其制品。抗酪蛋白多克隆抗体和单克隆 抗体也已用于牛乳中酪蛋白的检测，主要用于评价水解婴幼儿奶粉蛋白的免疫反应性。近 年来，双抗体夹心法还用于检测不含牛乳成分的食品中的牛乳过敏原，如果汁、饼干和巧克 力中是否含有酪蛋白成分，其检出限可达到5 mg*kg'但是，ELISA的方法耗时，耗力；需 要专业的设备，并且检测人员需经一定的专业培训才能操作。
[0004] 除了 ELISA方法外，电泳法（SDS-PAGE)、质谱法（LC/MS/MS)，免疫印迹法（Western Blotting)也用于水解牛乳中牛乳过敏原的检测。但与传统的ELISA方法相比，这些方法的 灵敏度不高，对低剂量的过敏原检测不出或成本太高。
[0005] 基于抗0 LG多克隆和单克隆抗体酶链免疫检测牛乳主要过敏原0 LG牛乳的研宄 也有研宄报道。虽然酶链免疫检测方法具有高特异性和高灵敏度的优点，但是，这些方法用 于食品过敏原的检测上，需要较长的时间和较大的工作量，还需要一定的实验条件和专业 技术人员进行操作。
[0006] 因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0007] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速检测牛奶过敏原的免 疫胶体金法，旨在解决现有检测方法耗时耗力，灵敏度低，且需专业人员才能操作的问题。
[0008] 本发明的技术方案如下： 一种快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其中，包括步骤： A、 以牛乳0 LG作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞； B、 通过杂交瘤细胞，制备单克隆抗体； C、 对单克隆抗体进行鉴定，并得到单克隆抗体的表位信息； D、 选取两株不同表位的单克隆抗体分别作为包被单抗和检测单抗制备胶体金测试纸 条，所述胶体金测试纸条包括吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分，其中，吸水纤维 部分喷抗牛乳0LG的包被单克隆抗体-胶体金结合物，硝酸纤维素膜上喷涂抗牛乳0LG 的检测单抗；放于室温下进行反应，得到检测结果。
[0009] 所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其中，所述步骤A具体包括：4-6周 龄BALB/c小鼠作为免疫动物，经免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与克隆，得到杂交瘤细 胞克隆株。
[0010] 所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其中，通过有限稀释法对杂交瘤细 胞孔进行克隆。
[0011] 所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其中，所述步骤B具体包括：取 BALB/c小鼠，腹腔内注射石蜡油，1~2周后注射杂交瘤细胞；7-9天后，收集腹水，离心，吸取 上清，然后对收集的上清进行抗体纯化，得到抗牛乳0 LG的单克隆抗体。
[0012] 所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其中，所述步骤C还包括：对单克隆 抗体的纯度及免疫印迹、单克隆抗体的亚类、单克隆抗体的效价及单克隆抗体的交叉性进 行鉴定。
[0013] 所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其中，所述单克隆抗体的效价为：以 间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价，同时以NS-1细胞融合细胞腹水作为阴性对照，以 P/N值> 2. 1单克隆抗体最大稀释度作为单克隆抗体的效价。
[0014] 所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其中，所述步骤C中，所述鉴定通过 合成多肽，然后将合成的多肽与单克隆抗体特异结合，采用ELISA和Immuno dot-blotting 检测出单克隆抗体的表位信息。
[0015] 所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其中，所述步骤D中，所述单克隆抗 体-胶体金结合物的制备步骤具体包括： 将氯金酸煮沸后，加入柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸l〇~20min ;冷却后，加入1(20)3调 pH至8. 0~8. 5 ;加入抗牛乳过敏原0 LG的包被单抗并快速搅拌；加入0VA并快速搅拌，加 入NaCl溶液，离心，弃沉淀，上清液再离心；弃上清液，得到单克隆抗体-胶体金结合物。 [0016] 所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其中，所述步骤D中，所述胶体金测 试纸条的制备步骤具体包括：胶体金测试纸条包括吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三 部分；其中，吸水纤维部分喷抗牛乳0LG的包被单克隆抗体-胶体金结合物，硝酸纤维素膜 上喷涂抗牛乳0 LG的检测单抗和羊抗鼠IgG包被成两条0. 8~1. 2mm宽的线条，风干后用含 OVA的PBS封闭，干燥后依次粘在支持物上，切成0. 2 cm X 8 cm的条。
[0017] 所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其中，所述步骤D中，牛乳的检测结 果包括：以测试条纤维素膜上出现两条红色线为阳性结果，仅出现一条红色线为阴性结果， 无红色线条出现则视为检测失效。
[0018] 有益效果：本发明利用制备的已知表位的高效价的抗牛乳0 LG的单克隆抗体，然 后通过制备的双抗体夹心的胶体金测试纸条，即可快速简便的检测出牛乳主要过敏原蛋白 0 LG〇
【附图说明】
[0019] 图1为实施例1胶体金测试条的测试结果示意图。
【具体实施方式】
[0020] 本发明提供一种快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，为使本发明的目的、技术 方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体 实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0021] 本发明提供一种快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其包括步骤： A、 以牛乳0 LG作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞； B、 通过杂交瘤细胞，制备单克隆抗体； C、 对单克隆抗体进行鉴定，并得到单克隆抗体的表位信息； D、 选取两株不同表位的单克隆抗体分别作为包被单抗和检测单抗制备胶体金测试纸 条，所述胶体金测试纸条包括吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分，其中，吸水纤维 部分喷抗牛乳0LG的包被单克隆抗体-胶体金结合物，硝酸纤维素膜上喷涂抗牛乳0LG 的检测单抗；放于室温下进行反应，得到检测结果。
[0022] 本发明利用制备的已知表位的高效价的抗牛乳0 LG的单克隆抗体，然后通过制 备的双抗体夹心的胶体金测试纸条，即可快速简便的检测出牛乳主要过敏原蛋白0LG。本 发明的免疫胶体金检测牛乳主要过敏原0LG的方法，检测灵敏度约为0.2ng*mL'相比 于其他方法，本发明的免疫胶体金检测最大的优势在于用时少（l~5min左右)，可快速检测。 同时操作简单，对操作人员无专业方面的要求，可广泛应用与牛乳过敏原的检测。