0D值)。
[0039] 采用已建立的间接ELISA法，将牛乳和其它主要食物的蛋白粗提掖(花生、鸡蛋、 鱼、虾、腰果、小麦、大豆)按100 ng蛋白/孔加入到孔中，4°C包被过夜，加封闭液200 yL/ 孔封闭，于37°C温育2h，洗板；加入单克隆抗体100 yL /孔，以免疫前小鼠的正常血清为 阴性对照，于37°C温育1 h，洗板；加入稀释的羊抗鼠IgG-HRP 100 y L/孔，37°C温育45 min，洗板；加TMB 37°C避光显色10 min ;显色后加入质量浓度12. 5% H2S04 50 y L /孔终 止反应，波长450nm处测定吸光值（0D值)。
[0040] 6、主要抗原表位肽链的Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定 Tricine胶的配方如表1所示。将合成的四段多肽进行Tricine-SDS-PAGE电泳，鉴定 分子量大小及纯度。
[0041]表1、Tricine胶配方
1)、多肽片段与单克隆抗体特异结合的ELISA检测 取上述合成的多肽分别用ELISA包被缓冲液稀释至10 y g ? ml/1，加入100 y L/孔，以 CNs、LG蛋白分别作为阴性、阳性对照，4°C包被过夜。弃去蛋白包被液后，洗板。加入200 y L/孔封闭液，37°C封闭2h，洗板。分别加入浓度为1 y g 的不同单抗100 y L/孔， 37°C育温lh。洗板，加HRP标记羊抗鼠IgG lOOyL/孔，37°C孵育45 min，洗板。加入TMB 37°C避光显色10 min，显色后加入终止液质量浓度为12.5% H2S04 50 yL/孔终止反应，测 450nm的吸光值。
[0042] 2)、多肽片段与单克隆抗体特异结合的Immuno dot-blotting检测 取上述合成的多肽分别用PBS稀释至20 y g ? mL'以CNs、LG蛋白分别作为阴性、 阳性对照，滴加100 U L到硝酸纤维素膜，自然晾干后，用封闭液封闭2h，用TBST洗涤液漂 洗后，分别与浓度为1 U g ? ml/1的单抗在37°C育温lh。用TBST洗涤液漂洗后加HRP标记 羊抗小鼠IgG，37°C育温45min。用洗涤液漂洗后，DAB显色。
[0043] 7、单克隆抗体生物素标记 分别将已知抗原表位的1H8,1G5和4C3与活化的生物素（NSH-Biotin)按比例混合避 光反应30min，通过50kDa的超滤膜柱去除未参与标记的NSH-Biotin。
[0044] 8、检测牛乳主要过敏原0 LG双单抗夹心免疫胶体金法 1)、胶体金-抗牛乳总蛋白抗体结合物的制备 将氯金酸(质量浓度为〇. 01%) 100°C煮沸后，加入柠檬酸三钠水溶液(质量浓度为1%) (按每100 mL氯金酸加入1.5 mL柠檬酸三钠水溶液的比例加入)，继续煮沸15 min。冷却 后，加入K2C03 (0. 2mol 调pH至8. 2 ;加入抗牛乳过敏原0 LG的最佳包被单抗1 mg并 快速搅拌15min。加入OVA 200mg，快速搅拌5 min，加入NaCl (质量浓度10%)溶液使NaCl 最终浓度为1 %，2000 rpm离心10 min，弃沉淀，上清液再以10000 rpm离心1 h ;弃上清 液，所获得的沉淀物即为纯化的抗牛乳过敏原0 LG的包被单克隆抗体-胶体金结合物。
[0045] 2)、免疫层析测试条的制备 胶体金测试条包括吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分。吸水纤维部分喷抗牛 乳0 LG的包被单克隆抗体-胶体金结合物，硝酸纤维素膜上的用100 y g ? ml/1的抗牛乳 过敏原0 LG (用PBS稀释）的检测单抗（喷涂在检测线1上）和羊抗鼠IgG (用PBS稀释） (喷涂在对照线2上)包被成两条约1 mm宽的线条，风干后用含0VA的PBS封闭。干燥后依 次粘在支持物上，切成〇.2cmX8 cm的条。结果判定：反应在室温下进行，以测试条纤维素 膜上出现两条红色线为阳性结果，如图1中测试条4为阳性结果，仅出现一条红色线（靠近 吸水滤纸端，对照线）为阴性结果，如图1中测试条3为阴性结果，如果无红色线条出现则 视为检测失效。
[0046] 综上所述，本发明提供的一种快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，利用两株已 知表位的高效价的抗牛乳0 LG的单克隆抗体，通过制备双抗体夹心的胶体金试纸条，即 可实现快速简便的检测牛乳主要过敏原0LG。本发明的免疫胶体金法检测灵敏度约为 0. 2ng ?mL4,用时短（l~5min左右)，且快速检测。同时操作简单，对操作人员无专业方面的 要求，可广泛应用与牛乳过敏原的检测。
[0047] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可 以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保 护范围。
【主权项】
1. 一种快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其特征在于，包括步骤： A、 以牛乳0LG作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞； B、 通过杂交瘤细胞，制备单克隆抗体； C、 对单克隆抗体进行鉴定，并得到单克隆抗体的表位信息； D、 选取两株不同表位的单克隆抗体分别作为包被单抗和检测单抗制备胶体金测试纸 条，所述胶体金测试纸条包括吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分，其中，吸水纤维 部分喷抗牛乳0LG的包被单克隆抗体-胶体金结合物，硝酸纤维素膜上喷涂抗牛乳0LG 的检测单抗；放于室温下进行反应，得到检测结果。2. 根据权利要求1所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其特征在于，所述步 骤A具体包括：4-6周龄BALB/c小鼠作为免疫动物，经免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选 与克隆，得到杂交瘤细胞克隆株。3. 根据权利要求2所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其特征在于，通过有 限稀释法对杂交瘤细胞孔进行克隆。4. 根据权利要求3所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其特征在于，所述步 骤B具体包括：取BALB/c小鼠，腹腔内注射石蜡油，1~2周后注射杂交瘤细胞；7-9天后， 收集腹水，离心，吸取上清，然后对收集的上清进行抗体纯化，得到抗牛乳0LG的单克隆抗 体。5. 根据权利要求1所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其特征在于，所述步 骤C还包括：对单克隆抗体的纯度及免疫印迹、单克隆抗体的亚类、单克隆抗体的效价及单 克隆抗体的交叉性进行鉴定。6. 根据权利要求5所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其特征在于，所述单 克隆抗体的效价为：以间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价，同时以NS-I细胞融合细 胞腹水作为阴性对照，以P/N值> 2. 1单克隆抗体最大稀释度作为单克隆抗体的效价。7. 根据权利要求1所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其特征在于，所述步 骤C中，所述鉴定通过合成多肽，然后将合成的多肽与单克隆抗体特异结合，采用ELISA和 Immunodot-blotting检测出单克隆抗体的表位信息。8. 根据权利要求1所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其特征在于，所述步 骤D中，所述单克隆抗体-胶体金结合物的制备步骤具体包括： 将氯金酸煮沸后，加入柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸l〇~20min;冷却后，加入1(20)3调pH至8. 0~8. 5 ;加入抗牛乳过敏原0LG的包被单抗并快速搅拌；加入OVA并快速搅拌，加 入NaCl溶液，离心，弃沉淀，上清液再离心；弃上清液，得到单克隆抗体-胶体金结合物。9. 根据权利要求8所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其特征在于，所述步 骤D中，所述胶体金测试纸条的制备步骤具体包括：胶体金测试纸条包括吸水纤维、硝酸纤 维素膜和吸水滤纸三部分；其中，吸水纤维部分喷抗牛乳0LG的包被单克隆抗体-胶体金 结合物，硝酸纤维素膜上喷涂抗牛乳0LG的检测单抗和羊抗鼠IgG包被成两条0. 8~1. 2mm 宽的线条，风干后用含OVA的PBS封闭，干燥后依次粘在支持物上，切成0.2cmX8cm的 条。10. 根据权利要求9所述的快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法，其特征在于，所述步 骤D中，牛乳的检测结果包括：以测试条纤维素膜上出现两条红色线为阳性结果，仅出现一 条红色线为阴性结果，无红色线条出现则视为检测失效。
【专利摘要】本发明公开一种快速检测牛奶过敏原的免疫胶体金法。本发明利用两株已知表位的高效价的抗牛乳βLG的单克隆抗体，通过制备双抗体夹心的胶体金测试纸条，即可实现快速简便的检测牛乳主要过敏原βLG。本发明的免疫胶体金法检测灵敏度约为0.2ng·mL-1，用时短（1~5min左右），且快速检测。同时操作简单，对操作人员无专业方面的要求，可广泛应用与牛乳过敏原的检测。
【IPC分类】G01N33/68, G01N33/04
【公开号】CN104931663
【申请号】CN201510336210
【发明人】吴序栎, 何宗民, 刘志刚, 夏兵兵
【申请人】深圳大学, 深圳市晨光乳业有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月17日