一种盐酸洛美沙星有关物质的检测方法与流程

本发明涉及盐酸洛美沙星有关物质的检测方法，属于医药领域。
背景技术：
：盐酸洛美沙星是第四代喹诺酮类抗菌药，对g+,g-菌，支原体等引起的感染有较强的抗菌作用，临床用于治疗敏感细菌引起的呼吸道，泌尿生殖系统，胃肠道，皮肤软组织等感染，其半衰期长，疗效确切，得到广泛应用。盐酸洛美沙星的化学名称为(±)-l-乙基-6，8-二氟-1，4-二氢-7-(3-甲基-1-哌嗪基)-4-氧代-3-喹啉竣酸盐酸盐，化学式：c17h19f2n3o3·hci，结构式如下：在盐酸洛美沙星的合成中，杂质可能来源于起始原料和反应中间产物，6,7,8-三氟-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯为起始原料，1-乙基-6,7,8-三氟-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯为乙基化反应产物，中国药典2010版已对盐酸洛美沙星有关物质检测方法进行提高，改善了有关物质的分离，但未对已知杂质a(6,7,8-三氟-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯)，杂质b(1-乙基-6,7,8-三氟-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯)进行控制，这些杂质可能是造成盐酸洛美沙星副作用的原因，因此，提供一种能够检测杂质a，b，更加全面检测盐酸洛美沙星有关物质的高效液相色谱条件，成为了一个亟待解决的问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种盐酸洛美沙星有关物质的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，具体步骤如下：a、取盐酸洛美沙星，加乙腈水溶液溶解，得供试品溶液；b、取盐酸洛美沙星对照品和有关物质对照品，加乙腈水溶液溶解，得系统适用性溶液；c、采用如下色谱条件分别对供试品溶液、系统适用性溶液进行检测：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以0.01～1.0％三氟乙酸水溶液为流动相a，以体积比为40～60:40～60的甲醇乙腈溶液为流动相b；梯度洗脱程序为：0.01～30min，75～85％→72～82％a，30～40min，72～82％→30～40％a，40～50min，30～40％a，50.01-65min，75～85％a；检测波长：260～300nm；流速为0.5～1.5ml/min；柱温为30～40℃。进一步地，步骤a)所述盐酸洛美沙星与乙腈水溶液的质量体积比为0.5～1.0mg：1ml，优选：1.0mg：1ml。进一步地，所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为30：70。进一步地，步骤b)所述有关物质为杂质a和/或杂质b；所述系统适用性溶液每1ml含盐酸洛美沙星0.5～1.0mg，各杂质0.5-1.0ug。进一步地，所述的固定相为inertsilods-3柱；色谱柱规格为：内径4.6×250mm，5um。进一步地，步骤c)所述检测波长为287nm，流速为1.0～1.1ml/min，柱温为30℃，进样量20μl。进一步地，步骤c)所述梯度洗脱程序为：0.01～30min，80％→77％a，30～40min，77％→35％a，40～50min，35％a，50.01-65min，80％a。进一步地，：所述供试品溶液的色谱图中呈现与系统适用性溶液色谱图中有关物质对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰，即供试品中含有有关物质。本发明还提供了一种盐酸洛美沙星有关物质的含量测定方法，具体操作步骤如下：1)取步骤a供试品溶液，加乙腈水溶液稀释100～1000倍，得对照溶液；所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为30：70；2)按前述方法检测；3)计算有关物质含量，计算公式如下：其中，xi％：供试品中有关物质的含量，ai：供试品溶液中有关物质峰面积，a：对照溶液中盐酸洛美沙星峰面积，n:对照溶液的稀释倍数，fi:有关物质的校正因子。进一步地，步骤a所述加乙腈水溶液稀释1000倍。进一步地，所述有关物质为杂质a，其校正因子为2.42，有关物质为杂质b，其校正因子为2.93。本发明检测方法可以将盐酸洛美沙星与杂质峰有效分离，准确测定盐酸洛美沙星已知杂质6,7,8-三氟-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯与1-乙基-6,7,8-三氟-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯含量，测定结果稳定可靠，专属性强，为盐酸洛美沙星合成过程中质量控制提供了可能，从而更好地控制盐酸洛美沙星的产品质量。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1实施例1供试品溶液hplc图图2实施例2供试品溶液hplc图图3实施例3供试品溶液hplc图图4空白溶液图5盐酸洛美沙星分离溶液图6参比溶液(a)hplc图图7参比溶液(b)hplc图具体实施方式1.材料盐酸洛美沙星(成都惟邦药业有限公司提供，批号wb10300401，wb10300402，wb10300501)已知杂质a对照品(成都惟邦药业有限公司提供，批号wbz001b)已知杂质b对照品(成都惟邦药业有限公司提供，批号wbz002b)2.主要仪器高效液相色谱仪：日本岛津实施例1盐酸洛美沙星中杂质a和杂质b含量检测1)取盐酸洛美沙星(批号：wb10300401)25mg，加25ml乙腈水溶液(乙腈与水体积比30:70)溶解，配制成浓度为1.0mg/ml的供试品溶液；2)精密移取步骤1)供试品溶液，加体积比30：70的乙腈水溶液稀释成浓度为1.0ug/ml的对照溶液；3)分别取杂质a和杂质b对照品各10mg，用100ml乙腈水溶液(乙腈与水体积比30:70)溶解，配制成浓度为100ug/ml的溶液，作为杂质储备液。4)称取盐酸洛美沙星对照品25mg置于25ml量瓶中，加入0.25ml上述杂质储备液，加乙腈水溶液(乙腈与水体积比30:70)溶解定溶，作为系统适用性溶液。(盐酸洛美沙星1.0mg/ml，杂质a，b各1.0ug/ml)；5)采用如下色谱条件分别对供试品溶液、对照溶液、系统适用性溶液进行检测：色谱柱：inertsilods-34.6×250mm，5um；流动相：以0.05％三氟乙酸水溶液为流动相a，以体积比为50:50的甲醇乙腈溶液为流动相b；检测波长：287nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量20ul；梯度洗脱程序为：时间(min)流动相b(％)流动相a(％)0.01208030237740653550653550.0120806520806)供试品溶液的色谱图中呈现与系统适用性溶液色谱图中杂质a、杂质b色谱峰保留时间相对应的色谱峰，即盐酸洛美沙星中含有有关物质：杂质a、杂质b，通过如下公式计算其含有的有关物质的含量：其中，xi％：供试品中有关物质的含量，ai：供试品溶液中有关物质峰面积，a：对照溶液中洛美沙星峰面积，n:对照溶液的稀释倍数，fi:有关物质的校正因子(fa＝2.42，fb＝2.93)。7)结果：盐酸洛美沙星批号为wb10300401的有关物质检测图谱见图1，计算结果为：项目有关物质a有关物质bmax未知有关物质含量％nd(不含)nd(不含)0.079％实施例2盐酸洛美沙星中杂质a和杂质b含量检测1)取盐酸洛美沙星(批号：wb10300402)25mg，加25ml乙腈水溶液(乙腈与水体积比30:70)溶解，配制成浓度为1.0mg/ml的供试品溶液；2)精密移取步骤1)供试品溶液，加体积比30：70的乙腈水溶液稀释成浓度为1.0ug/ml的对照溶液；3)分别取杂质a和杂质b对照品各10mg，用100ml乙腈水溶液(乙腈与水体积比30:70)溶解，配制成浓度为100ug/ml的溶液，作为杂质储备液。4)称取盐酸洛美沙星对照品25mg置于25ml量瓶中，加入0.25ml上述杂质储备液，加乙腈水溶液(乙腈与水体积比30:70)溶解定溶，作为系统适用性溶液。(盐酸洛美沙星1.0mg/ml，杂质a，b各1.0ug/ml)5)采用如下色谱条件分别对供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液进行检测：色谱柱：inertsilods-34.6×250mm，5um；流动相：以0.05％三氟乙酸水溶液为流动相a，以体积比为50:50的甲醇乙腈溶液为流动相b；检测波长：287nm；流速为1.1ml/min；柱温为30℃；进样量20ul；梯度洗脱程序为：时间(min)流动相b(％)流动相a(％)0.01208030237740653550653550.0120806520806)供试品溶液的色谱图中呈现与系统适用性溶液色谱图中杂质a、杂质b色谱峰保留时间相对应的色谱峰，即盐酸洛美沙星中含有有关物质：杂质a、杂质b，通过如下公式计算其含有的有关物质的含量：其中，xi％：供试品中有关物质的含量，ai：供试品溶液中有关物质峰面积，a：对照溶液中洛美沙星峰面积，n:对照溶液的稀释倍数，fi:有关物质的校正因子(fa＝2.42，fb＝2.93)。7)结果：盐酸洛美沙星批号为wb10300402的有关物质检测图谱见图2，计算结果为：项目有关物质a有关物质bmax未知有关物质含量％nd(不含)nd(不含)0.078％实施例3盐酸洛美沙星中杂质a和杂质b含量检测1)取盐酸洛美沙星(批号：wb10300501)25mg，加25ml乙腈水溶液(乙腈与水体积比30:70)溶解，配制成浓度为1.0mg/ml的供试品溶液；2)精密移取步骤1)供试品溶液，加体积比30：70的乙腈水溶液稀释成浓度为1.0ug/ml的对照溶液；3)分别取杂质a和杂质b对照品各10mg，用100ml乙腈水溶液(乙腈与水体积比30:70)溶解，配制成浓度为100ug/ml的溶液，作为杂质储备液。4)称取盐酸洛美沙星对照品25mg置于25ml量瓶中，加入0.25ml上述杂质储备液，加乙腈水溶液(乙腈与水体积比30:70)溶解定溶，作为系统适用性溶液。(盐酸洛美沙星1.0mg/ml，杂质a，b各1.0ug/ml)5)采用如下色谱条件分别对供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液进行检测：色谱柱：inertsilods-34.6×250mm，5um；流动相：以0.05％三氟乙酸水溶液为流动相a，以体积比为50:50的甲醇乙腈溶液为流动相b；检测波长：287nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量20ul；梯度洗脱程序为：6)供试品溶液的色谱图中呈现与系统适用性溶液色谱图中杂质a、杂质b色谱峰保留时间相对应的色谱峰，即盐酸洛美沙星中含有有关物质：杂质a、杂质b，通过如下公式计算其含有的有关物质的含量：其中，xi％：供试品中有关物质的含量，ai：供试品溶液中有关物质峰面积，a：对照溶液中洛美沙星峰面积，n:对照溶液的稀释倍数，fi:有关物质的校正因子(fa＝2.42，fb＝2.93)7)结果：盐酸洛美沙星批号为wb10300501的有关物质检测图谱见图3，计算结果为：项目有关物质a有关物质bmax未知有关物质含量％nd(不含)nd(不含)0.078％以下通过实验例进一步说明本发明的有益效果：实验例1检测波长的选择中国药典关于本品的有关物质检测波长为287nm，取盐酸洛美沙星，杂质a，杂质b溶液经dad检测，盐酸洛美沙星的最大吸收在287nm左右，与药典无较大差异，杂质a，杂质b最大吸收在310nm左右，其他杂质在310nm吸收弱，杂质a，b在287nm处吸收较强，综合考虑检测器波长选择为287nm。实验例2系统适用性仪器：岛津lc-20at色谱柱：inertsilods-34.6×250mm，5um，流速：1.0ml/min，色谱柱温度：30℃，进样量20ul，检测器波长：287nm，流动相a：0.05％三氟乙酸水溶液流动相b：乙腈：甲醇(50:50)，梯度洗脱条件如下：时间(min)流动相b(％)流动相a(％)0.01208030237740653550653550.012080652080(1)空白溶液：乙腈：水＝30:70(v/v)(2)杂质储备液：精密称取杂质a，b各10mg于100ml量瓶中，稀释液溶解并定容(杂质a：100ug/ml，杂质b：100ug/ml)。(3)系统适用性溶液：精密称取盐酸洛美沙星对照品25mg于25ml量瓶中，精密加入杂质储备液0.25ml，加稀释液稀释定容。(盐酸洛美沙星1.0mg/ml，杂质a，b各1.0ug/ml)(4)杂质定位溶液：分别称取杂质a，b各1.0mg分别置于100ml量瓶，加稀释液溶解定容。(杂质a：10ug/ml，杂质b：10ug/ml)(5)参比溶液(a):精密称取盐酸洛美沙星25mg于25ml量瓶中，加稀释液溶液定容。(6)参比溶液(b)：精密量取参比溶液(a)适量，稀释成1.0ug/ml的溶液按色谱条件进样空白溶液，系统适用性溶液，参比溶液(a)(既样品溶液)，参比溶液(b)(既对照溶液)，记录色谱过程，结果见表1，图4～7。表1系统适用性实验例3专属性实验条件，液相色谱方法和溶液配制如实验例1方法专属性考察峰鉴别和选择性，分别进样空白溶液，杂质定位溶液，记录色谱图，结果见表2表2专属性溶液名称物质名称溶液浓度保留时间杂质a定位溶液杂质a10.8ug/ml44.453杂质b定位溶液杂质b10.5ug/ml48.314实验例4检测限和定量限实验条件，液相色谱方法和溶液配制如实验例1对于已知杂质，检测限(lod)和定量限(loq)根据信噪比来确定。把已知浓度的杂质储备液稀释到低浓度进样，检测信噪比s/n≥10确定为定量限，s/n＝2～4确定为检测限。测试结果见表3表3定量限和检测限实验例5线性和范围实验条件，液相色谱方法和溶液配制如实验例1对于已知杂质，在loq浓度至不低于150％指标浓度范围内取6个点进行研究，线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，至少报告相关系数r2来证实良好的线性关系,要求该线性回归系数r2应不小于0.990.未知杂质线性用盐酸洛美沙星线性代替。表4线性与范围杂质校正因子实验例6精密度实验条件，液相色谱方法和溶液配制如实验例1取分离度溶液作为供试品溶液，平行配制6份，依次进样，重复性结果见表5表5重复性序列杂质a杂质bmax未知单杂10.0320.0260.07620.0330.0260.07630.0320.0250.07640.0320.0260.07850.0330.0260.07660.0320.0260.077rsd％1.601.581.09中间精密度采用相同操作方法，由不同人员在不同仪器上进行，结果见表6表6中间精密度实验例7准确度实验条件，液相色谱方法和溶液配制如实验例1准确度是通过在供试品中加入指标的80％，100％，120％三个不同浓度杂质，测定杂质的回收率所得。已知杂质的准确度是加入已知量的杂质，再测定加样样品中已知杂质的含量和理论值之间的比值(回收率)，以百分率％表达。未知杂质准确度用盐酸洛美沙星来代替。表7准确度实验例1～7研究结果表明，本发明一种测定盐酸洛美沙星已知杂质的方法具有很好的专属性，精密度良好，准确度高和灵敏度高，可适用于原料药合成中有关物质的质量控制。综上，本发明检测方法可以将盐酸洛美沙星与杂质峰有效分离，准确测定盐酸洛美沙星已知杂质6,7,8-三氟-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯与1-乙基-6,7,8-三氟-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯含量，测定结果稳定可靠，专属性强，为盐酸洛美沙星合成过程中质量控制提供了可能，从而更好地控制盐酸洛美沙星的产品质量。当前第1页12