本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种血浆型冻干粉儿茶酚胺类物质及其代谢物的质量控制物质制备和应用。
背景技术：
儿茶酚胺类物质(cas)是人类中枢神经重要的信息传递物质，参与、维持和调节神经系统，是生物体内具有较强生理学活性的内源性物质，由肾上腺髓质、肾上腺神经元以及肾上腺外嗜铬体合成与分泌的单胺类神经递质，在大脑和神经信号传导中起着重要的作用。儿茶酚胺类物质主要包括去甲肾上腺素(norepinephrine，ne)、肾上腺素(epinephrine，e)、异丙肾上腺素和多巴胺(dopamine，da)。
儿茶酚胺类物质的化学结构中带有一个双羟基苯环和一个带氨基的侧链，极性较大，易溶于水，其中的邻苯二酚结构在酸性条件下比较稳定，中性或碱性条件下易被氧化成醌。生物样品中儿茶酚胺含量极微，其特殊的化学结构导致易被氧化，稳定性较差。肾上腺素(e)及去甲肾上腺素(ne)经儿茶酚-o-甲基转移酶(comt)的作用下生成变肾上腺素(mn)和去甲基变肾上腺素(nmn)，肾上腺素(e)和去甲肾上腺素(ne)最终转化为3-甲氧-4-羟基苦杏仁酸(香草扁桃酸，vma)，vma是e和ne的主要代谢终产物，并以较高浓度出现在血浆和尿液中。
临床检测患者样本中的cas用于嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、神经母细胞瘤、高血压、心肌梗塞、肾上腺髓质增生等疾病的诊断和治疗，同时有助于诊断甲状腺功能异常、充血性心力衰竭、糖尿病、肾脏功能不全等疾病，具有重要的临床意义。由于mns(mn和nmn的总称)半衰期比cas长，受药物影响较小等特性，其诊断嗜铬细胞瘤的敏感性要高于cas，有研究表明尿总mns对嗜铬细胞瘤的敏感性为94.7％，高于尿ca和vma，后两者的敏感性分别为80％和60％。由于在不同肿瘤发病阶段，cas代谢有快有慢，进入血、尿中的浓度也会有所不同，所以临床上同时测定尿、血中的cas及其代谢产物mns来获得更高的诊断率。
目前用于检测cas及mns的方法主要有：免疫法、化学发光法、毛细管电泳法(ce)、荧光光度法(fl)、高效液相色谱电化学检测法(hplc-ecd)、气相色谱串联质谱法(gc-ms)、液相色谱串联二级质谱法(hplc-ms/ms)法。不同的检测方法因检测原理不同，在检测灵敏度、检测项目种类上也有很大区别，导致了其在临床上的不同应用范围。
hplc-ms/ms法可同时测定cas及其代谢物，重现性好，可在线分析，逐渐成为临床检测cas及其代谢物的发展趋势。
在临床上常采用edta-k2或肝素、柠檬酸抗凝血浆或尿作为临床检测cas及其代谢物的样本。儿茶酚胺类物质及其代谢物的准确测量需要一个稳定质量控制物质来校准、监控仪器状态和试剂的好坏，目前国内尚无儿茶酚胺类物质及其代谢物的质量控制物质制备方法的专利相关报道信息。国内美康生物发明的“用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒”专利中有包含质控品1、2，但该专利未涉及到质控品的相关制备方法信息。
在临床检测cas及其代谢物时由于检测样本为血浆，如果质量控制物质的基质与待测样本相同或相似，就可以更好的监测实验方法的准确性和稳定性。虽然可以直接使用血浆作为质量控制物质用于临床监测，但由于血浆为液体，临床实验室缺少超低温保存装置，导致其不宜长久保存。
技术实现要素：
本发明针对上述现有技术的问题，通过以人血浆为基质，克服新鲜血浆、冷冻血浆儿茶酚胺类物质及代谢物质量控制物质不稳定、不易长时间保存的缺点，提供一种均匀性、稳定性良好的血浆型冻干粉儿茶酚胺类物质及代谢物质量控制物质。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种血浆型冻干粉儿茶酚胺类物质及其代谢物的质量控制物质，该物质通过如下主要步骤制备而得：
(1)搜集临床新鲜无黄疸、乳糜、溶血的血浆进行传染病筛查，选择筛查结果为阴性的样本，混合在一起，备用；
(2)将步骤(1)中的血浆采用活性炭吸附其中的儿茶酚胺类物质及代谢物，得到空白血浆；
(3)根据质量控制物质对儿茶酚胺类物质及其代谢物的浓度要求，取步骤(2)中的空白血浆，然后再添加儿茶酚胺类物质及代谢物的标准储备溶液，搅拌至均匀；
(4)向步骤(3)获得的血浆中加入稳定剂、赋形剂、抗氧剂、防腐剂等，搅拌至完全溶解；
(5)将步骤(4)获得的血浆用安瓿瓶进行分装，然后进行冷冻干燥制备成冻干粉，再将安瓿瓶充入氮气进行熔封，得到儿茶酚胺类物质及代谢物的质量控制物质的冻干粉。
上述步骤(1)的传染病筛查如hiv、乙肝、梅毒、丙肝等，但是不限于上述类型，要保证血浆为不含传染病的健康血浆为前提。
优选的，上述的步骤(2)中的活性炭吸附具体的：活性炭用量1～30g/100ml(100ml血浆中加入1～30g活性炭进行吸附)，吸附时间0～24h，吸附后的血浆先用0.45μm滤膜过滤，再用0.22μm滤膜过滤，得到澄清、含儿茶酚胺类物质及其代谢物含量很低可以忽略不计的空白血浆。
优选的，上述步骤(4)中所述的稳定剂主要是蛋白质、多元醇或氨基酸类物质，可以是牛血清白蛋白(bsa)、人血清白蛋白(hsa)、海藻糖、酪氨酸等中的一种或多种组合，浓度范围为0～5％(质量百分比)。
优选的，上述步骤(4)中所述的赋形剂为多元醇类物质，可使冻干后产品具有良好的外观，赋形剂可以是甘露醇、蔗糖、葡萄糖中的一种或是多种组合，浓度范围为0～5％(质量百分比)。
优选的，上述步骤(4)中所述的抗氧剂可以是具有还原性的物质，如抗坏血酸及其盐类、焦亚硫酸钠、半胱氨酸、谷胱甘肽等中的一种或多种组合，浓度范围为0～2.0％(质量百分比)。
优选的，上述步骤(4)中所述的防腐剂为苯甲酸及其盐类、叠氮钠、pc-300中的一种或多种组合，浓度范围为0～1.0％(质量百分比)。
上述步骤(5)中用安瓿瓶进行分装，可以根据0.5ml～10ml/安瓿瓶的规格要求进行分装。
因儿茶酚胺类物质稳定性较差，除在冻干前加入稳定剂、抗氧剂外，冻干后再将安瓿瓶充入氮气保护、熔封，可提高其稳定性。
本发明上述制备的质量控制物质可以用于质控品或校准品。
优选的，获得的质量控制物质可制备成不同浓度梯度的质控品，可以包括低浓度质量控制物质或高浓度质量控制物质：在低浓度质量控制物质中多巴胺的浓度范围可控制在0～3nmol/l，肾上腺素的浓度范围可控制在0～9nmol/l，去甲肾上腺素的浓度范围可控制在0～49nmol/l，变肾上腺素和去甲变肾上腺素的浓度范围可均控制在0～3nmol/l；在高浓度质量控制物质中多巴胺的浓度范围可控制在4～8nmol/l，肾上腺素的浓度范围可控制在10～15nmol/l，去甲肾上腺素的浓度范围可控制在50～100nmol/ll，变肾上腺素和去甲变肾上腺素的浓度范围可均控制在4～8nmol/l。
上述低浓度和高浓度质量控制物质为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素和去甲变肾上腺素的混合物；各个成分的浓度为在混合物中的各自浓度。
低浓度、高浓度的儿茶酚胺类物质及其代谢物的质量控制物质并没有明确的浓度界限区分，制备浓度可根据临床实际需要进行调整。
本发明所述的质量控制物质还可用于不同浓度水平的儿茶酚胺类物质及其代谢物检测系统的校准品，浓度水平和具体范围可根据不同方法学的要求进行制备。
如配制6个浓度水平的儿茶酚胺类物质及代谢物的校准品：
多巴胺、变肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度可保持一致，均为0.5nmol/l、1.0nmol/l、2.5nmol/l、5.00nmol/l、7.5nmol/l、10.00nmol/l；
肾上腺素6个水平浓度为：0.5nmol/l、1.0nmol/l、5.0nmol/l、10.0nmol/l、25.0nmol/l、50.0nmol/l；
去甲肾上腺素6个水平浓度为：1.0nmol/l、5.0nmol/l、10.0nmol/l、50.0nmol/l、100.0nmol/l、200.0nmol/l；
上述质量控制物质用作校准品，有6个浓度点，为多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、和去甲变肾上腺素的混合物；各浓度各成分为在总混合物中的浓度。
以上是以6个水平为例，实际工作中具体浓度可根据临床需要进行调整，浓度水平可增加也可减少。
根据临床需要也可向步骤(3)的血浆中加入异丙肾上腺素、香草扁桃酸等物质中的一种或多种组合。
本发明的优点和有益效果：
1.本发明的质量控制物质均匀性、稳定性良好，不需-70℃低温保存，可用于儿茶酚胺类物质(ne、e、da等)及代谢物试剂盒的校准品，也可作为质控品用于临床监测儿茶酚胺类物质(ne、e、da等)及mns检测系统的准确性和稳定性。
2.本发明制备的质量控制物质以冻干粉的形式存在，从而克服了直接使用血浆作为质量控制物质用于临床监测时血浆为液体、临床实验室缺少超低温保存装置，导致其不宜长久保存的缺陷，具有均匀性、稳定性和准确性的技术优势。
3.本发明首次通过活性炭吸附方式去除血浆中的儿茶酚胺类物质及其代谢物，从而获得空白血浆，达到去干扰的技术效果。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于以下几种实例：
实例1
搜集无黄疸、乳糜、溶血的血浆，选取其中传染病筛查结果为阴性(hiv、乙肝、梅毒、丙肝)的样本混合在一起，搅拌均匀，备用。
取上述混合血浆150ml，按10g/100ml的量称取活性炭，加入血浆中，慢速搅拌2h，然后分别用0.45μm、0.22μm滤膜过滤，得到澄清血浆，经检验儿茶酚胺类物质及其代谢物含量极低，可忽略不计。
制备质控品中含多巴胺0.5nnmol/l、肾上腺素2.5nmol/l、去甲肾上腺素10nnmol/l、变肾上腺素和去甲变肾上腺素1.5nmol/l，根据多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素标准储备溶液的浓度、血浆体积(按100ml计)、质控品的浓度要求计算出需添加标准储备溶液的体积，先加入处理好的血浆，加入cas和或mns标准储备溶液，搅拌均匀；然后再依次加入bsa2.0g、海藻糖3.0g，抗坏血酸0.5％、苯甲酸钠0.05％，搅拌至完全溶解，按规格0.5ml/瓶用安瓿瓶进行分装，冷冻干燥得到冻干粉，安瓿瓶再充入氮气熔封。
实例2
搜集无黄疸、乳糜、溶血的血浆，选取其中传染病筛查结果为阴性(hiv、乙肝、梅毒、丙肝)的样本混合在一起，搅拌均匀，备用。
取上述混合血浆150ml，按5.0g/100ml的量称取活性炭，加入血浆中，慢速搅拌4h，然后分别用0.45μm、0.22μm滤膜过滤，得到澄清血浆，经检验儿茶酚胺类物质及其代谢物含量极低，可忽略不计。
制备质控品中含多巴胺1.0nnmol/l、肾上腺素4.0nmol/l、去甲肾上腺素20nnmol/l、变肾上腺素和去甲变肾上腺素2.0nmol/l，根据多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素标准储备溶液的浓度、血浆体积(按100ml计)、质控品的浓度要求计算出需添加标准储备溶液的体积，先加入处理好的血浆，搅拌均匀；然后再依次加入hsa3.0g、酪氨酸1.0g，焦亚硫酸钠0.05％、叠氮钠0.1％，搅拌至完全溶解，按规格1.0ml/瓶用安瓿瓶进行分装，冷冻干燥得到冻干粉，安瓿瓶再充入氮气熔封。
实例3
搜集无黄疸、乳糜，溶血的血浆，选取其中传染病筛查结果为阴性(hiv、乙肝、梅毒、丙肝)的样本混合在一起，搅拌均匀，备用。
取上述混合血浆150ml，按7.5g/100ml的量称取活性炭，加入血浆中，慢速搅拌3h，然后分别用0.45μm、0.22μm滤膜过滤，得到澄清血浆，经检验儿茶酚胺类物质及其代谢物含量极低，可忽略不计。
制备质控品中含多巴胺1.5nnmol/l、肾上腺素6.0nmol/l、去甲肾上腺素40nnmol/l、变肾上腺素和去甲变肾上腺素3.0nmol/l，根据多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素标准储备溶液的浓度、血浆体积(按100ml计)、质控品的浓度要求计算出需添加标准储备溶液的体积，先加入处理好的血浆，搅拌均匀；然后再依次加入海藻糖5.0g、谷胱甘肽0.2g，焦亚硫酸钠0.1％、pc-3000.05％，搅拌至完全溶解，按规格1.0ml/瓶用安瓿瓶进行分装，冷冻干燥得到冻干粉，安瓿瓶再充入氮气熔封。
儿茶酚胺类物质及其代谢物质量控制物质均匀性考察
取儿茶酚胺类物质及其代谢物质量控制物质冻干粉，随机抽取10瓶，规格为1.0ml/瓶，准确加入1.0ml纯化水，并用液相色谱-串联质谱法进行检测，计算多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素和去甲变肾上腺素的浓度及均值、sd等，结果如表1所示。
表1儿茶酚胺类物质及其代谢物质量控制物质均匀性考察(单位：nmol/l)
将上述质量控制物质任取3瓶混匀，连续测定10次，计算多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素测量结果的均值、sd，结果如表2所示。
表2儿茶酚胺类物质及其代谢物质量控制物质3瓶混匀后测量结果
按照下列公式计算瓶间重复性cv瓶间：
当s1<s2时，令cv瓶间＝0
式中：
s为标准差
n为测量次数
xi为指定参数第i次测量值
经考察，本方法制备的儿茶酚胺类物质及其代谢物质量控制物质多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素瓶间s瓶间分别为0.0434、0.0963、0.1153、0.0713、0.0500，对应的瓶间重复性cv瓶间分别为6.4％、4.7％、1.4％、5.5％、3.7％，均小于10％。
儿茶酚胺类物质及其代谢物质量控制物质加速稳定性考察
取该质量控制物质冻干粉6瓶，规格：1.0ml/瓶，放37℃水浴中，经3天、5天、7天后分别取出2瓶，复溶，对多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素等进行检测，每瓶检测2次，结果与表1中各项均值比较，结果详见表3。
表337℃水浴加速稳定性考察结果(单位nmol/l)
本申请的冻干粉的获得采用的冻干操作为本领域的常规冻干操作。
从表3的数据可看出，本发明制备的儿茶酚胺类物质与其代谢物质量控制物质在37℃水浴加速考察7天后与靶值相比偏倚在±15％以内，表明本发明该质量控制物质质量稳定并可存放较长时间(2～8℃可存放1年)。
实例所用的原料，除另有说明外，均为市售商业产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例。应当指出，在本发明核心技术前提下，还可以做出改进优化，这些改进优化也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。