利用高效液相色谱和液质联用色谱鉴别金银花和山银花的方法与流程

本发明属于中药材来源品种鉴定
技术领域：
，涉及一种鉴别金银花和山银花的方法，具体涉及利用高效液相色谱和液质联用色谱鉴别金银花和山银花的方法。
背景技术：
：金银花和山银花自2005版《中华人民共和国药典》起分列为两种药材。由于二者原植物种属相近、药材外观形态相似，难以区分，因此市场上金银花和山银花药材来源不清、品种混乱，因为山银花产量大，价格低，市场上经常存在山银花冒充金银花现象，然而两者的物质基础相差较大，从而直接影响到药材及其制剂的疗效，更严重的是山银花中皂苷含量比金银花多，而皂苷可以导致注射剂的溶血现象，直接危害用药者的生命安全。现有的用于金银花与山银花两者之间的品种鉴别方法均存在一些不足之处。如传统的外观形态鉴别依赖经验、主观性大，尤其是对于市场上两者混合品或粉碎状态无法鉴别；dna分子鉴定法技术复杂、环境为万级实验，要求高，成本高，检验周期长，影响因素多导致重复性差。药理法验证成本高、周期长、影响因素多导致误差大，这些方法虽然可以在一定程度上对近缘品种进行区分，但无法对药效的优劣进行评价。尤其是上述几种方法对于粉碎状态的混合物或者中成药中掺伪现象无法鉴别。专利cn103173532b(一种鉴别金银花和山银花的方法及其应用)涉及一种鉴别金银花和山银花的方法及其应用。本方法包括pcr扩增its2核苷酸序列，包括1)提取样品dna；2)pcr扩增含有核糖体dna的its2序列的片段；3)对扩增产物进行拼接，获得完整its2基因间隔区；4)构建样品的its2序列的nj树。专利cn104419754a(一种快速鉴别金银花真伪的方法)公开了一种鉴别金银花及其常见伪品山银花的方法，是利用高分辨率溶解曲线技术对金银花与山银花的标志性核酸位点进行分析。本方法通过对供试金银花样品进行dna提取、pcr扩增和hrm分析，确认标志性核酸位点分型，进而对金银花真伪进行鉴定。上述方法属于dna分子鉴定法、需要pcr扩增，技术复杂，成本高。专利cn105277721b(一种鉴别口炎清制剂原料山银花和金银花的方法)公开了一种区分金银花和山银花的鉴别方法，包括以下步骤：以山银花或含山银花原料的制剂为对照；构建急性口腔炎症模型；通过比较供试品和对照标准品对急性口腔炎症模型细胞中炎症因子tnf-α、il-6、il-8和il-10表达水平的影响，鉴别区分金银花和山银花或其复方制剂。本方法需要山银花或含山银花原料的制剂为对照，构建急性口腔炎症模型；存在检验方法复杂、检验不够快速、成本高、影响因素多、误差大的缺陷。虽然现有技术中有以绿原酸与断马钱子酸的含量比值或川续断皂苷乙含量的单一指标作为鉴别依据的报道，但是其应用前提必须是性状观察样品是单一药材饮片时才可以应用，对于混合药材或者不能观察性状的药材鉴别受限。技术实现要素：本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种利用高效液相色谱和液质联用色谱鉴别金银花和山银花的方法。本方法以绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值以及川续断皂苷乙的重量百分比为指标，采用高效液相色谱和液质联用色谱进行检测金银花及山银花干燥品中绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值以及川续断皂苷乙的重量百分比，来鉴别金银花和山银花。为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：利用高效液相色谱和液质联用色谱鉴别金银花和山银花的方法，当供试品为金银花或山银花中的一种或两种时，通过高效液相色谱检测供试品干燥品中断马钱子酸和绿原酸的重量百分比，并计算绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值；通过液质联用色谱检测供试品干燥品中川续断皂苷乙的重量百分比。利用绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值和川续断皂苷乙的重量百分比来鉴别金银花和山银花。当供试品干燥品中绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值小于2，且川续断皂苷乙的重量百分比为0时，判定为金银花。所述绿原酸与断马钱子酸的含量的检测方法为：取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，于210～360nm波长处测定峰面积，采用外标法或标准曲线法计算，得到供试品中绿原酸与断马钱子酸的重量百分比，然后计算两者比值；所述川续断皂苷乙的含量的检测方法为：取对照品溶液与供试品溶液，注入液质联用色谱仪，利用液相分离，质谱测定特征离子的面积，采用外标法或标准曲线法计算，得到供试品中川续断皂苷乙的重量百分比。优选的，(1)所述高效液相色谱法的测定条件为：色谱柱c18，4.6mm×250mm，5μm；断马钱子酸波长240nm，绿原酸波长324nm；以乙腈为流动相a，以ph值为2.5的酸的水溶液为流动相b，采用梯度洗脱，其中流动相a0～20min，体积百分比5％→15％；20～30min，体积百分比15％→28％；其余为流动相b。(2)所述液质联用色谱法的测定条件为：液相部分色谱柱：c18色谱柱，10mm×2.1mm，1.7μm；柱温：45℃；流速：0.3ml/min；进样体积：1μl；流动相：以0.1％甲酸(含10mmol/l甲酸铵)溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，采用梯度洗脱，其中流动相a0～3min，体积百分比92％，3～5min，体积百分比92％→35％，5～8min，体积百分比35％→15％，8～10min，体积百分比15％；其余为流动相b；质谱离子源模式：电喷雾(esi)离子源；扫描模式：选择离子检测(srm)；电离电压：3500v；雾化室温度：200℃；鞘气：高纯氮气，35l/min；辅助气：高纯氮气，10l/min；离子传输管温度：290℃；碰撞气：高纯氩气；采用负离子采集川续断皂苷乙，其质荷比母离子为1075.0，子离子为749.2，碰撞能量，40ev。所述的酸为磷酸或甲酸或乙酸或磷酸盐。进一步的，(1)所述绿原酸与断马钱子酸的含量的检测方法中的供试品溶液的制备方法为：取供试品粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入溶剂10-50ml，超声处理15-60分钟，摇匀，过滤，即得。(2)所述川续断皂苷乙的含量的检测方法中的供试品溶液的制备方法为：取供试品，粉碎成细粉，取约0.25g，精密称定，置于100ml具塞锥形瓶中，精密加入85％甲醇20-50ml，精密称重，室温下超声提取30min，冷却后，精密称重，用85％甲醇补足重量，滤过，取续滤液用0.22μm滤膜过滤，即得。所述85％甲醇是指甲醇与超纯水的混合液，甲醇的体积百分比为85％。所述超声的功率为250w，频率35khz。所述溶剂为水或0-50％乙醇溶液或0-50％甲醇溶液或其混合物，其中0-50％乙醇/甲醇溶液是指乙醇/甲醇与超纯水的混合液，其中的百分比体积百分比。本发明的有益效果：(1)本发明通过利用高效液相色谱检测供试品干燥品中绿原酸和断马钱子酸的重量百分比并计算其比值，利用液质联用色谱检测川续断皂苷乙的重量百分比，采用绿原酸和断马钱子酸的百分比的比值和川续断皂苷乙的重量百分比两项指标鉴别供试品，能有效的提高鉴别的准确度。(2)以绿原酸与断马钱子酸的含量比值及川续断皂苷乙含量作为评价指标用来鉴别金银花和山银花混合品不需要首先通过观察性状来观察样品是否是单一药材饮片，针对于市场上很多已经粉碎或部分粉碎的混合药材以及中成药中的药材等无法通过肉眼观察性状的情况达到鉴别的目的。(3)本发明中，绿原酸和断马钱子酸的重量百分比比值规律性强，换成整数更容易观察判断；液质联用专属性更强、精度更高、灵敏度更高、准确性更高，为药品的生产、流通、使用过程中提供了一种鉴别真假的依据。附图说明图1是绿原酸对照品图谱；图2是河南不同批次金银花绿原酸谱图；图3是河北不同批次金银花绿原酸谱图；图4是山东不同批次金银花绿原酸谱图；图5是不同批次山银花绿原酸谱图；图6是断马钱子酸对照品图谱；图7是河南不同批次金银花断马钱子酸谱图；图8是河北不同批次金银花断马钱子酸谱图；图9是山东不同批次金银花断马钱子酸谱图；图10是不同批次山银花断马钱子酸谱图；图11是川续断皂苷乙对照品图谱；图12是河南不同批次金银花川续断皂苷乙谱图；图13是河北不同批次金银花川续断皂苷乙谱图；图14是山东不同批次金银花川续断皂苷乙谱图；图15是不同批次山银花川续断皂苷乙谱图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。实施例1建立检测方法1.仪器与材料1.1仪器tsq-tuantom液质联用仪(thermofisher公司)，电喷雾离子源(esi)质谱检测器，watersc18色谱柱(2.1×10mm，1.7μm)；安捷伦1260四元高效液相色谱仪，安捷伦g4212b二极管列阵检测器，安捷伦eclipsexdb-c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；kh500b型超声清洗器(昆山grad)，明澈d24uv超纯水系统(密理博中国)。1.2材料与试剂乙腈(fisherscientific)为色谱级，水为一级超纯水，无水乙醇(comio)等其他试剂为分析级；甲酸、甲酸铵为质谱级。断马钱子酸对照品购置于上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：60077-46-5；绿原酸对照品购置于中国药品生物制品检定所，批号：110753-200413。川续断皂苷乙对照品购置于中国药品生物制品检定所，批号：111685-200401。2.试验方法2.1色谱条件(1)所述高效液相色谱法的测定条件为：色谱柱c18，4.6mm×250mm，5μm；波长240、324nm；以乙腈为流动相a，以ph值为1.5～4的酸水溶液为流动相b，采用梯度洗脱，其中流动相a0～20min，体积百分比5％→15％；20～30min，体积百分比15％→28％；其余为流动相b。(2)所述液质联用色谱法的测定条件为：液相部分色谱柱：c18色谱柱，10mm×2.1mm，1.7μm；柱温：45℃；流速：0.3ml/min；进样体积：1μl；流动相：以0.1％甲酸(含10mmol/l甲酸铵)溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，采用梯度洗脱，其中流动相a0～3min，体积百分比92％，3～5min，体积百分比92％→35％，5～8min，体积百分比35％→15％，8～10min，体积百分比15％；其余为流动相b。质谱离子源模式：电喷雾(esi)离子源；扫描模式：选择离子检测(srm)；电离电压：3500v；雾化室温度：200℃；鞘气：高纯氮气，35l/min；辅助气：高纯氮气，10l/min；离子传输管温度：290℃；碰撞气：高纯氩气；采用负离子采集川续断皂苷乙，其质荷比母离子为1075.0，子离子为749.2，碰撞能量，40ev。2.2对照品溶液的制备2.2.1川续断皂苷乙对照品的制备精密称取川续断皂苷乙对照品0.00558g，置于5ml容量瓶中，加85％甲醇稀释定容至刻度，摇匀，制成川续断皂苷乙对照品储备液。精密量取川续断皂苷乙对照品储备液100μl置于10ml容量瓶中，加85％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得川续断皂苷乙对照品溶液i。精密吸取川续断皂苷乙对照品溶液i2ml至10ml容量瓶中，加85％甲醇稀释至刻度，摇匀，制成川续断皂苷乙对照品溶液ii。所述85％甲醇是指甲醇与超纯水的混合液，甲醇的体积百分比为85％。2.2.2绿原酸对照品溶液的制备取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50％甲醇制成每lml含40μg的溶液，即得(10℃以下保存)。所述50％甲醇是指甲醇与超纯水的混合液，甲醇的体积百分比为50％。2.2.3断马钱子酸对照品溶液的制备取断马钱子酸对照品，精密称定，加20％乙醇制成0.25mg/ml的溶液，即断马钱子酸对照品溶液。所述20％乙醇是指乙醇与超纯水的混合液，乙醇的体积百分比为20％。2.3供试品溶液的制备2.3.1川续断皂苷乙供试品溶液制备取供试品粉末(过四号筛)约0.25g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入85％甲醇25ml，精密称重，超声提取(功率250w，频率35khz)30min，放冷，用85％的甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.22μm滤膜过滤，即得。所述85％甲醇是指甲醇与超纯水的混合液，甲醇的体积百分比为85％。2.3.2断马钱子酸供试品溶液制备取供试品粉末(过四号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20％乙醇25ml，超声处理(功率250w，频率35khz)30分钟，放冷，用20％乙醇补足重量，摇匀，滤过，即得。所述20％乙醇是指乙醇与超纯水的混合液，乙醇的体积百分比为20％。2.3.3绿原酸供试品溶液制备取供试品粉末(过四号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声处理(功率250w，频率35khz)30分钟，放冷，用50％甲醇补足重量，摇匀，滤过，即得。所述50％甲醇是指甲醇与超纯水的混合液，甲醇的体积百分比为50％。2.4川续断皂苷乙方法学研究2.4.1线性关系精密吸取川续断皂苷乙对照品溶液ii1，2，5，10，20，25μl，分别上机分析，记录峰面积，以标准品峰面积y为纵坐标，以进样质量x(c，ng)为横坐标进行线性回归，计算回归方程及相关系数。线性方程：y＝2890.27x+1954.28，相关系数为0.9949。线性范围2.232-55.800ng。2.4.2仪器精密度考察取川续断皂苷乙对照品溶液i，按2.1色谱条件连续进样6次，记录峰面积，并计算rsd，结果见表1。表1仪器精密度考察2.4.3日内稳定性考察取批号为lf-m-2的湖南产灰毡毛忍冬样品提取液，按2.1项下色谱条件，分别在0，4，8，12，16，20h进样，记录峰面积，并计算rsd，结果见表2。表2日内稳定性考察2.4.4重复性取同一批样品(3贵州灰毡毛-1)，平行取6份，按上述2.3.1川续断皂苷乙供试品溶液制备项下要求制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液、川续断皂苷乙对照品溶液i，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算含量，结果表明，此方法测定含量，重复性良好。结果见表3：表3重复性实验考察结果表明：rsd＝3.80％，重复性实验良好。2.4.5加标回收率考察取同一样品(河北3-4)，平行取六份，每份约0.25g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入85％甲醇24.5ml，分别加入川续断皂苷乙对照品储备液0.5ml，精密称重，超声提取30min，冷却，精密称重，用85％甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液，用0.22μm滤膜过滤，按上述条件进样分析，记录峰面积，并计算回收率，结果见表4。所述85％甲醇是指甲醇与超纯水的混合液，甲醇的体积百分比为85％。表4川续断皂苷乙回收率2.5断马钱子酸方法学研究2.5.1线性考察精密吸取断马钱子酸对照品溶液(0.226mg/ml)1、5、10、15、20、25μl，分别注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积(a)对进样质量(m，μg)进行线性回归，回归方程为：a＝1213*c-12，相关系数r＝1.00，结果表明断马钱子酸在0.2264μg～5.66μg之间呈良好的线性关系。结果见表5。表5线性关系考察2.5.2仪器精密度精密吸取断马钱子酸对照品溶液(0.233mg/ml)10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算仪器精密度，结果见表6：表6仪器精密度考察结果表明：平均峰面积2945.2，rsd＝0.88％，仪器精密度良好。2.5.3重复性取同一批样品(山东产金银花sd1-1)，平行取6份，按上述2.3.2断马钱子酸供试品溶液制备项下制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液及2.2.3项下断马钱子酸对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算含量，结果表明，此方法测定断马钱子酸的含量，重复性良好。结果见表7：表7重复性实验考察结果表明：rsd＝1.83％，重复性实验良好。2.6绿原酸方法学研究2.6.1线性考察精密吸取绿原酸对照品溶液(0.1088mg/ml)4、8、12、16、20、40μl，分别注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积(a)对进样质量(m，μg)进行线性回归，回归方程为：a＝2110.0*c–3.6，相关系数r＝0.99991，结果表明绿原酸在0.4352μg～4.352μg之间呈良好的线性关系。结果见表8。表8线性关系考察2.6.2仪器精密度精密吸取绿原酸对照品溶液(0.1088mg/ml)10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算仪器精密度，结果见表9：表9仪器精密度考察结果表明：平均峰面积2299.2，rsd＝0.43％，仪器精密度良好。2.6.3重复性取同一批样品(山东产金银花sd1-1)，平行取6份，按上述2.3.3绿原酸供试品溶液制备项下制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液及绿原酸对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算含量，结果表明，此方法测定绿原酸的含量，重复性良好。结果见表10：表10重复性实验考察结果表明：rsd＝1.73％，重复性实验良好。2.7样品测定分别取金银花或山银花样品0.25g，按上述条件进样分析。2.7.1不同产地、不同批次的金银花中川续断皂苷乙含量金银花主产区为河北省、河南省和山东省，分别取各地方不同批次金银花作为供试品按照方法的检测条件进行检测，所得检测结果如表11所示。表11河北省、河南省和山东省各批次金银花中川续断皂苷乙含量2.7.2不同产地、不同批次的山银花中川续断皂苷乙含量山银花主产区为贵州省、湖南省、广西省、广东省、四川省，分别取不同产地不同批次山银花作为供试品按照所述方法的检测条件进行检测，所得检测结果如表12所示。表12不同省各批次山银花检测结果结果表明：由表11-12可见，(1)除个别批次外，山银花中川续断皂苷乙含量较高，金银花中川续断皂苷乙含量除河北产一批为0.03接近于零外，其他各批次都为零。其中12四川山银花、22四川产山银花(山东保利)批次的山银花川续断皂苷乙含量较低接近为零。(2)大部分山银花中川续断皂苷乙含量较高，用于金银花注射剂时有溶血风险，有必要通过技术手段鉴别金银花和山银花。实施例2验证实验1.不同产地、不同批次的金银花中断马钱子酸和绿原酸含量分别取河北省、河南省和山东省各批次金银花作为供试品按照实施例1中所述方法的检测条件进行检测，所得检测结果如表13所示。表13河北省、河南省和山东省各批次金银花检测结果2.不同产地、不同批次的山银花中断马钱子酸和绿原酸含量分别取贵州省、湖南省、广西省、广东省、四川省各批次山银花作为供试品按照实施例1中所述方法的检测条件进行检测，所得检测结果如表14所示。表14不同省各批次山银花检测结果3.结果和结论由表13-14可见，(1)山银花中绿原酸与断马钱子酸的含量比值都大于2，金银花中绿原酸与断马钱子酸的含量比值都小于2。(2)山银花中广东华南忍冬(三批)中的绿原酸与断马钱子酸的含量比值虽然大于2但是数值不大。分析市场因为金银花价格远高于山银花(2019年11月，金银花批发价格为360元/kg,山银花批发价格为78元/kg)，所以市场中用山银花冒充金银花销售的现象常见，但是未发现用金银花冒充山银花销售的情况，即使存在也只是提高了疗效，无安全隐患，因此本发明主要用于防止山银花冒充金银花。如果用“12四川山银花或22四川产山银花(山东保利)三个批次的山银花”冒充金银花或掺入金银花中，仅仅采用川续断皂苷乙作为评价指标，因为其含量很低接近于零，因此存在一定的误判，但是辅助测定绿原酸与断马钱子酸的含量比值会发现其比值远高于2，达到鉴别目的。如果用山银花广东华南忍冬(三批)冒充金银花或掺入金银花中，仅仅采用绿原酸与断马钱子酸的含量比值进行鉴别会发现其比值接近于2，如果冒充量少甚至低于2，因此存在一定的误判，辅助川续断皂苷乙作为评价指标，达到鉴别目的。如果用其他山银花(除12四川山银花或22四川产山银花(山东保利及三批广东华南忍冬)，因为川续断皂苷乙及绿原酸与断马钱子酸的含量比值都与金银花相差很大，容易达到鉴别目的。为更好的说明本发明的判定规律适用于不同比例的金银花和山银花的混合物，我们采用不同比例的金银花和山银花混合物作为研究对象，分别各成分含量及绿原酸与断马钱子酸的含量比值，并分析结果，实验如下：实施例3混合样品(金银花与山银花质量比为1:1混合)测定混合样品制备：按照表15分别取等重量的山银花与金银花，粉碎，混匀，作为供试品，参照实施例1项下绿原酸、断马钱子酸、川续断皂苷乙测定方法测定，并计算绿原酸与断马钱子酸的含量比值及川续断皂苷乙的含量，结果见表16。表15金银花与山银花混合样品组成表(质量比为1:1)混合样品序号金银花品种名称山银花品种名称组成质量比1河南一等第一批3贵州灰毡毛-11：12河南一等第一批14湖南隆回山银花1：13河南一等第一批29样品三广西购山银花1：14河南一等第一批广东华南忍冬11：15河南一等第一批12四川山银花1：16山东sd1-13贵州灰毡毛-11：17山东sd1-114湖南隆回山银花1：18山东sd1-129样品三广西购山银花1：19山东sd1-1广东华南忍冬11：110山东sd1-112四川山银花1：111河北2-2(4)3贵州灰毡毛-11：112河北2-2(4)14湖南隆回山银花1：113河北2-2(4)29样品三广西购山银花1：114河北2-2(4)广东华南忍冬11：115河北2-2(4)12四川山银花1：1表16金银花与山银花质量比为1:1混合时各成分含量及绿原酸与断马钱子酸的含量比值结果表明：(1)本实例中：4号混合样品“河南一等第一批--广东华南忍冬1”中绿原酸与断马钱子酸的含量比值为1.57，小于2，但是川续断皂苷乙含量为15.3mg/g，明显大于0，可以判定本品为非金银花。相反，5号混合样品“河南一等第一批--12四川山银花”中川续断皂苷乙含量为0.09mg/g，接近于0，对于某些精密度低或操作回收率低的情况可能导致误判，但是其绿原酸与断马钱子酸的含量比值为3.20，大于2，可以判定本品为非金银花。(2)以绿原酸与断马钱子酸的含量比值和川续断皂苷乙含量作为评价指标相比单用其中一项来鉴别金银花和山银花混合品，能有效的提高鉴别的准确度，能够区别所本实例中有的混合物。实施例4混合样品(金银花与山银花质量比为1:4混合)测定混合样品制备：按照表17分别取等重量的山银花与金银花，粉碎，混匀，作为供试品，参照实施例1项下绿原酸、断马钱子酸、川续断皂苷乙测定方法测定，并计算绿原酸与断马钱子酸的含量比值及川续断皂苷乙的含量，结果见表18表17金银花与山银花混合样品组成表(质量比为1:4)混合样品序号金银花品种名称山银花品种名称组成重量比1河南一等第一批3贵州灰毡毛-11:42河南一等第一批14湖南隆回山银花1:43河南一等第一批29样品三广西购山银花1:44河南一等第一批广东华南忍冬11:45河南一等第一批12四川山银花1:46山东sd1-13贵州灰毡毛-11:47山东sd1-114湖南隆回山银花1:48山东sd1-129样品三广西购山银花1:49山东sd1-1广东华南忍冬11:410山东sd1-112四川山银花1:411河北2-2(4)3贵州灰毡毛-11:412河北2-2(4)14湖南隆回山银花1:413河北2-2(4)29样品三广西购山银花1:414河北2-2(4)广东华南忍冬11:415河北2-2(4)12四川山银花1:4表18金银花与山银花质量比为1:4混合时各成分含量及绿原酸与断马钱子酸的含量比值结果表明：(1)本实例中：14号混合样品“河北2-2(4)--广东华南忍冬1”中绿原酸与断马钱子酸的含量比值为1.63，小于2，但是川续断皂苷乙含量为25.11mg/g，明显大于0，可以判定本品为非金银花。相反，5号混合样品“河南一等第一批--12四川山银花”中川续断皂苷乙含量为0.24mg/g，接近于0，对于某些精密度低或操作回收率低的情况可能导致误判，但是其绿原酸与断马钱子酸的含量比值为6.51，大于2，可以判定本品为非金银花。(2)以绿原酸与断马钱子酸的含量比值和川续断皂苷乙含量作为评价指标相比单用其中一项来鉴别金银花和山银花混合品，能有效的提高鉴别的准确度，能够区别所本实例中有的混合物。实施例5混合样品(金银花与山银花质量比为4:1混合)测定混合样品制备：按照表19分别取等重量的山银花与金银花，粉碎，混匀，作为供试品，参照实施例1项下绿原酸、断马钱子酸、川续断皂苷乙测定方法测定，并计算绿原酸与断马钱子酸的含量比值及川续断皂苷乙的含量。结果见表20。表19金银花与山银花混合样品组成表(质量比为4:1)混合样品序号金银花品种名称山银花品种名称组成重量比1河南一等第一批3贵州灰毡毛-14:12河南一等第一批14湖南隆回山银花4:13河南一等第一批29样品三广西购山银花4:14河南一等第一批广东华南忍冬14:15河南一等第一批12四川山银花4:16山东sd1-13贵州灰毡毛-14:17山东sd1-114湖南隆回山银花4:18山东sd1-129样品三广西购山银花4:19山东sd1-1广东华南忍冬14:110山东sd1-112四川山银花4:111河北2-2(4)3贵州灰毡毛-14:112河北2-2(4)14湖南隆回山银花4:113河北2-2(4)29样品三广西购山银花4:114河北2-2(4)广东华南忍冬14:115河北2-2(4)12四川山银花4:1表20金银花与山银花质量比为4:1混合时各成分含量及绿原酸与断马钱子酸的含量比值结果表明：(1)本实例中：14号混合样品“河北2-2(4)--广东华南忍冬1”中绿原酸与断马钱子酸的含量比值为1.02，小于2，但是川续断皂苷乙含量为8.43mg/g，明显大于0，可以判定本品为非金银花。相反，15号混合样品“河北2-2(4)--12四川山银花”中川续断皂苷乙含量为0.08mg/g，接近于0，对于某些精密度低或操作回收率低的情况可能导致误判，但是其绿原酸与断马钱子酸的含量比值为2.55，大于2，可以判定本品为非金银花。(2)以绿原酸与断马钱子酸的含量比值和川续断皂苷乙含量作为评价指标相比单用其中一项来鉴别金银花和山银花混合品，能有效的提高鉴别的准确度，能够区别所本实例中有的混合物。综合实施例3、4、5，分别选用不同重量比例的金银花和山银花混合，采用本发明的方法，以绿原酸与断马钱子酸的含量比值大于2且川续断皂苷乙含量大于0作为评价指标，都能有效的鉴别金银花和山银花混合品，实验过程中不用首先通过观察性状来观察样品是否是单一药材饮片。对于中成药中以山银花冒充金银花的掺伪鉴别，只要核对加入量进行重量换算即可折算出投入药材中绿原酸与断马钱子酸的含量比值及川续断皂苷乙含量，利用上述的判定要点达到鉴别目的。针对于市场上很多已经粉碎或者部分粉碎的混合药材、中成药中的药材等无法通过肉眼观察性状的情况达到鉴别的目的。当前第1页12